Protokol, mikoheterotrofik bitkilerde mantar kolonizasyonunu anlamak için uygulanan çeşitli mikroskopi tekniklerini, numune toplamaktan ayrıntılı olarak hazırlamaya ve gerekli adımları içerir. Bu tür teknikler çeşitli mikoheterotrofik bitkilere ve hatta bir bitkinin mikoheterotrofik dışındaki materyallerine uygulanabilir. Bu yöntem esas olarak yapısal botanik ile ilgilidir ve aynı zamanda mikorizal etkileşimler, fizyoloji, üreme biyolojisi, evrimi ve mikoheterotrofik bitkilerin ekolojisi hakkında fikir verebilir.
Başlamak için, bitki tabanının etrafındaki toprağı keşfederek, yeraltı organlarına zarar vermemeye özen göstererek mikoheterotrofik bitkileri toplayın. Ayrıca, hava organlarının yeraltı organlarından bağlantısını kesmeyi önlemek için bitkileri yerden çekmekten kaçının. Kökler, gövdeler, rizomlar ve depolama organları gibi yeraltı organlarını bu yapılara zarar vermeden keşfederken bir bahçe malası kullanarak hava yapılarını dikkatlice kazın.
Kırılgan yapıları korumak için toprak parçacıklarını çıkarın ve numuneleri sabitlemeden önce kalan toprak parçacıklarını durulamak için bu organları musluk suyuyla hassas bir şekilde yıkayın. Yaprak çöpü ile ilişkili mikoheterotrofik bitkiler ekstra dikkat gerektirir. Bu nedenle, ayrışan malzemeye bağlı hassas organları, bağlı yapılardan çekmeden hifleri aracılığıyla dikkatlice toplayın.
Bu tür bağlantılara sahip yapıları koruyun ve analiz için çöpleri toplayın. İletim elektron mikroskobu analizi için, bir damla glutaraldehit sodyum kakodilat tamponu içindeki 3 ila 4 milimetre kalınlığındaki numuneleri 1 ila 2 milimetre kalınlığında daha küçük bölümlere ayırın. Kesilen kenarları damlanın dışına atın.
Bitkilerin toplanmasından hemen sonra toplama sahasında sabitleme işleminin yapıldığından emin olun. Bölümleri, katkı maddesi fiksatif olduğu için numunelerin hacminden 10 kat daha fazla fiksatif hacme sahip bir toplama tüpüne derhal aktarın. Organlardaki yüzeysel hifaların yüzey analizi için, özellikle yeraltı organlarında ve yaprak çöpü ile temas edenlerde.
Diseksiyon mikroskobu altında taze veya sabit malzemeyi 7.5x veya daha yüksek bir büyütmede gözlemleyin. Yüzeysel hifalar ve rizomorflar tarafından yönlendirilen ilgi alanlarını araştırın. Yüzeysel rizomorf alanlarını içeren örnekleri seçin, çünkü bunlar köklerde ve gövdelerde kortikal hücreler içindeki pelotonları ve hifa bobinlerini görselleştirmek için bölümlere ayrılabilir.
Metin makalesinde açıklandığı gibi 0.1 molar fosfat tamponunda mililitre buğday tohumu aglütinin florokrom konjugatı ve% 1 kalkoflor beyaz çözeltileri başına 0.2 miligram hazırlayın. Şimdi, cam slaytlar üzerindeki bölümleri, 30 dakika boyunca buğday tohumu aglutinin florokrom konjugat çözeltisi ile düzgün bir şekilde kaplayarak inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bölümleri 0.1 molar fosfat tamponu ile yıkayın ve bunları bir montaj ortamı olarak kalkoflor çözeltisinde inkübe edin.
Daha sonra, kapak fişlerini slaytların üzerine yerleştirin ve belirtilen filtreleri kullanarak bir konfokal veya floresan ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Numuneleri sabitledikten sonra, dehidrasyon gerçekleştirdikten ve% 70 etanol içinde sakladıktan sonra, tek yönlü bir hareketle kesimler yapmak için keskin ve yeni bir tıraş bıçağı kullanarak elektron mikroskobu analizini taramak için istenen herhangi bir yüzeyi açığa çıkarın. Gerekirse, numuneleri seçmek için bir stereo mikroskop kullanın ve numune boyutlarını belirlerken metal saplamalar alanını göz önünde bulundurun.
Ayrıca, numuneleri etanolik bir seride dehidrate edin. Her konsantrasyonda 30 dakika boyunca küçük ve hassas numuneleri ve 1 saat boyunca daha büyük ve daha yoğun numuneleri saklayın. Ardından, sonraki adımlar için numuneleri düzenlemek üzere kağıt mendil kullanarak küçük zarfları katlayın.
Daha büyük numuneler zarf olmadan işlenebilir. Zarfları bir kalem kullanarak etiketleyin ve örneklerin bir günlüğünü tutun. Numuneleri dikkatlice bir boya fırçası kullanarak zarfların içine yerleştirin.
Şimdi, bu örnekleri mutlak etanolde tutun. Standart çalışma prosedürlerine göre kritik noktalı kurutucuyu çalıştırarak kritik nokta kurutmaya hemen devam edin. Bunun için, numuneleri mutlak etanol içine bir numune tutucuya yerleştirin ve kritik nokta kurutucunun basınç odasına yerleştirin.
Ara sıvı, kritik karbondioksit noktasında geçiş sıvısına çözünür ve böylece numuneleri kurutur. Atmosferik nemin yeniden emilimi numuneleri tahrip edebileceğinden, kritik nokta kuruduktan hemen sonra bir kurutma kabında saklayın. Numuneleri metal saplamalara monte etmeden önce, saplamaları manipüle etmek için eldivenleri takın.
Herhangi bir yağı ortadan kaldırmak ve kurumasını sağlamak için 5 dakika boyunca asetona batırın. Bir stereo mikroskop altında, numuneleri iletken çift taraflı karbon yapışkan bant kullanarak saplama üzerine sabitleyin ve konumlandırın. Yukarıdan gelen site, elektron mikroskobu görüntülerinin taranmasında mümkün olan tek perspektiftir.
Örnekleri manipüle etmek için ince noktalı cımbız kullanın. Cımbızın dokunduğu numune kısmı genellikle hasar görür. Bu yüzden dikkatli olun ve ilgi alanlarından uzakta konumlandırılmış parçalara dokunmayı deneyin.
Saplamaları, silika jel ile kapalı bir Petri kabında numunelerle koruyun. Daha sonra, standart çalışma prosedürlerini izleyerek düşük basınçlı bir inert gaz atmosferinde numunelerin yüzeyinde bir altın veya platin tabakası biriktirmek için püskürtme kaplamasına devam edin. Kaplama kalınlığı numunenin topografyasına bağlıdır ve genellikle 15 ila 40 nanometre arasındadır.
Son olarak, kaplanmış saplamaları, nemi koruyan silika jel ile kapalı bir Petri kabında saklayın. Numuneler bu şekilde haftalarca saklanabilir. Bu örnekleri analiz etmek için taramalı elektron mikroskobu kullanın.
Bir elektron ışını, tarama elektron mikroskobu sırasında vakuo örneğine çarpar ve bu etkileşimden kaynaklanan sinyal emisyonu görüntü olarak yorumlanır. Tohumların simbiyotik çimlenmesinde kullanılan çözeltilerin ve malzemelerin steril olduğundan emin olun. kontaminasyonu önlemek için.
Onları 121 santigrat derecede 20 dakika otoklavlayarak başlayın. Laminer bir hava akımı başlığında, meyveleri ve tohumları% 2 aktif klor içeren bir sodyum hipoklorit çözeltisine batırarak yüzeysel olarak dezenfekte edin. İnce ve kırılgan tohumlar 1: 1 seyreltilmiş sodyum hipoklorit çözeltisine daldırılabilir.
Dezenfeksiyondan sonra tohumları kserografik kumaş kullanarak filtreleyerek geri kazanın. Çimlenme testlerine devam etmeden önce hipoklorit çözeltisini çıkarmak için meyveleri ve tohumları otoklavlanmış damıtılmış suda üç kez yıkayın. Gerekirse, bunları 4 santigrat derecede silika jel içeren cam şişelerin içinde filtre kağıdı zarflarında saklayın ve şişeleri hermetik olarak kapatın ve sarılma filmi ile kapatın, ardından son yıkamadan patates dekstroz agarına birkaç damla su aktararak yıkama işleminin etkinliğini değerlendirin.
Orkide tohumlarının simbiyotik çimlenmesi için, yulaf ezmesi agar kültürü ortamı içeren Petri kaplarına yerleştirilen 1 ila 2 santimetrelik otoklavlanmış filtre kağıdı disklerinin üzerindeki tohumları kuluçkaya yatırın. Şimdi, Petri kabının merkezini, seçilen izole mantardan miselyum içeren kültür ortamı parçasıyla aşılayın. Petri kaplarını sarılma filmi ile kapatın ve mantar büyümesine bağlı olarak karanlıkta yaklaşık 25 santigrat derece veya oda sıcaklığında inkübe edin.
Çimlenme testi için negatif kontrol olarak tohumlu ve mantar aşılaması olmayan bazı yemekler hazırlayın. Nicel ve nitel verileri toplayarak ve protokormları ve fideleri fotoğraflayarak çimlenme sonuçlarını haftalık olarak analiz edin. Rizomorflar genellikle koyu, ayakkabı ipi benzeri yapılar olarak kolayca tanınabilir.
Freehand veya 10 mikrometreden daha kalın kesitler elde etmenin diğer yöntemleri, pelotonları daha iyi ortaya çıkarabilir ve kolonizasyonun mantar modellerinin daha temsili görüntülerini sağlayabilir. Serbest bölümler, daha yüksek amplifikasyonda hifa analizi için de uygun olabilir. Bununla birlikte, detaylar daha ince bölümlerde daha iyi elde edilir.
Ksilem elementlerindeki sekonder hücre duvarları, toluidin elde ettiği açık renk ile kolayca tanımlanabilir. Bu arada, sadece birincil hücre duvarlarından oluşan floem elementleri, daha ince ve daha koyu hücre duvarları ile tanımlanır. Otofloresan ile yapılan eserler glikol metakrilat reçine kesitlerinde görülebilir.
Bu eserler genellikle florokrom konsantrasyonu ile ilgilidir ve numunelerin tamponla daha fazla sayıda yıkanmasıyla önlenebilir. Kökün serbest bölümü iç ve dış hifaları gösterir. Aynı organ, yüzeyinde bol miktarda rizomorf ve bireysel hifa bulunan elektron mikroskobu taranarak görülebilir.
Çoğu orkide türü, aşılanmış mantar tarafından enfekte edildikten birkaç hafta sonra veya yaklaşık bir aydan fazla bir süreye kadar çimlenir. Taramalı elektron mikroskobundaki ışık, üreme biyolojisini veya mikoheterotrofik bitkileri araştırmak için çiçeklere, meyvelere ve tohumlara uygulanabilir. Tohumların simbiyotik çimlenmesi ototrofik orkidelerde de test edilebilir.
