Yüksek oranda çoklanmış titreşimsel görüntüleme, hücre altı çözünürlüğe sahip dokulardaki çoklu protein belirteçlerini sorgulamak için tek atışlık bir optik yaklaşım sağlar. Bu platform, biyolojik sistemlerin protein etkileşimlerinin kapsamlı bir resmini sunar. Bu tekniğin temel avantajı, döngüsüz çokluluğudur.
Bu teknik, özellikle kalın doku kesitleri gibi bisiklet stratejilerinin iyi çalışmadığı uygulamalar için uygundur. Bu yöntem, doku atlası oluşturma, tümör mikro ortamlarını fenotipleme ve profilleme beyin devresi gibi karmaşık sistemin yapılarını anlamak için yerinde bireysel hücre karakterizasyonu sağlar. Başlamak için, konjugasyon tamponu olarak kullanılmak üzere PHA 0.3'te PBS tamponunda yaklaşık 0.1 molar sodyum bikarbonat hazırlayın ve dört santigrat derecede saklayın.
Daha sonra susuz dimetil sülfoksit içinde üç milimolar n-hidroksisüksinamid ester fonksiyonlu MARS prob çözeltisi hazırlayın. Konjugasyon tamponundaki antikor katıları, mililitre başına iki miligramlık bir konsantrasyona çözün. Diğer tamponlarda çözünmüş antikorlar için, bunları bir santrifüj filtrede yoğunlaştırın ve daha sonra mililitre başına bir ila iki miligram konsantrasyona konjugasyon tamponuna ekleyin.
İkincil antikorlar için konjugasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için, bir cam şişedeki antikor çözeltisine 15 kat fazla molar boya çözeltisi ekleyin ve reaksiyon karışımını oda sıcaklığında bir saat karıştırarak inkübe edin. Saflaştırmayı gerçekleştirmek için, 50 mililitrelik bir tüp içinde 40 mililitre PBS tamponuna 10 mililitre jel filtrasyon reçine tozu ekleyerek bulamacı hazırlayın. Çözeltiyi bir saat boyunca 90 santigrat derecede bir su banyosunda tutun.
Daha sonra süpernatanı boşaltın, PBS'yi 40 mililitreye kadar ekleyin ve bulamacı dört santigrat derecede saklayın. Boyut hariç tutma kolonunu bulamaç çözeltisiyle 10 ila 15 santimetre yüksekliğe kadar paketleyin, ardından reçineyi daha da paketlemek için kolonu yaklaşık 10 mililitre PBS ile durulayın ve yıkayın. Daha sonra, konjugasyon reaksiyonu karışımını kolona pipetleyin.
Reaksiyon karışımını yükledikten sonra, hemen elüsyon tamponu olarak bir mililitre PBS ekleyin. Daha sonra, kolondaki renge bakarak veya absorbansı 280 nanometrede ölçerek eşlenik çözeltinin elüentini toplayın. Santrifüj filtreyi kullanarak, toplanan çözeltiyi mililitre başına bir ila iki miligrama konsantre edin.
Hidrofobik bir kalem kullanarak, slayttaki doku bölümlerinin etrafına bir sınır çizin. Daha sonra dokuları 10 dakika boyunca% 0.3 ila% 0.5 PBST ve 30 dakika boyunca bir blokaj tamponu ile inkübe edin. Birincil boyama çözeltisini hazırlamak için, tüm birincil antikorları istenen konsantrasyonlarda 200 ila 500 mikrolitre boyama tamponuna ekleyin.
Birincil boyama çözeltisini beş dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüj edin ve çökelti ortaya çıkarsa süpernatantı kullanın. Daha sonra dokuyu birincil antikor çözeltisinde bir ila iki gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Slaytları, oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 0,3 ila% 0,5 PBST ile üç kez kaydırakta duran bir kavanozda yıkayın ve dokuların çözeltiye daldırıldığından emin olun.
Daha sonra, dokuyu 30 dakika boyunca 200 ila 500 mikrolitre bloke edici tamponda inkübe edin. İkincil boyama çözeltisini hazırlamak için, tüm ikincil antikorları istenen konsantrasyonlarda 200 ila 500 mililitre boyama tamponuna ekleyin. Daha sonra ikincil boyama çözeltisini beş dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüj edin ve çökelti ortaya çıkarsa süpernatantı kullanın.
Daha sonra, dokuları bir ila iki gün boyunca dört santigrat derecede 200 ila 500 mikrolitre ikincil antikor çözeltisinde inkübe edin. Ardından, slaytları oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca% 0,3 ila% 0,5 PBST ile iki kez yıkayın. Ayrıca, 30 dakika boyunca 200 ila 500 mikrolitre DAPI çözeltisi ile inkübe edin.
Yine, slaytları PBS ile oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve yüzen doku bölümlerini cam damlayan pipetle cam slaytlara aktarın. Dokuyu bir doku fırçası ile yayın ve gerekirse etrafı mendillerle temizleyin. Daha sonra, dokuyu bir cam kapak kayması ile bir damla solma önleyici reaktife monte edin ve oje ile sabitleyin.
Çok kanallı eprSRS görüntüleme gerçekleştirmek için, lazer kontrol panelinde pompa ışınının lazer gücünü 10 ila 40 miliwatt'a ve stokes ışınını 40 ila 80 miliwatt'a ayarlayın. Ardından, piksel bekleme süresini iki ila dört mikrosaniyeye ayarlayın ve mikroskopi yazılımında tipik olarak ortalama 10 ila 20 kare olan birden fazla kare kullanın. Ayrıca, kilitli amplifikatörün zaman sabitlerini piksel bekleme süresinin yarısına ayarlayın.
İmmün etiketleme ile farklı protein belirteçlerinin ve HeLa hücrelerinin paraformaldehit ile sabitlenmiş fare beyin korteksi ve nemli böbrek FFPE dokusunun Raman boya görüntülemesi yapıldı. HeLa hücrelerinin alfa-tübülin ile immüno-eprSRS görüntülemesinde mikrotübüller gibi ince hücre altı yapılar ortaya çıkarıldı. Fare beyin dokusundaki MARS 2145 boyalı astrositlerin ve MARS 2228 boyalı serebellar granül nöronların eprSRS görüntülemesi, hücre altı çözünürlüklü üç boyutlu desenler göstermiştir.
Dondurulmuş fare adacık dokusundaki hormonların ve transkripsiyon faktörlerinin yedi renkli SRS floresan tandem görüntülemesi yapıldı. Elde edilen görüntüler iyi bir kontrast ve doğru desenler ortaya koydu. Paraformaldehit ile sabitlenmiş fare beyincik dokuları üzerindeki hücre tipi belirteçlerin sekiz renkli SRS floresan tandem görüntülemesi yapıldı.
Serebellar granül nöronları, Purkinje nöronları, astrositler, oligodendrositler ve GABAerjik nöronlar gibi farklı hücre tipleri tanımlandı. Bu prosedür, kalın bozulmamış dokularda yüksek oranda çoklanmış protein görüntülemesi gerçekleştirmek için doku temizleme ile daha da birleştirilebilir. Grubumuz bunun için Raman-boyaya özel bir doku temizleme protokolü geliştirdi.
