Biz proof-of-prensibi deneyler, fiksasyon protokolleri, reaktifler ve teşvik paylaşmak için Richard Fetter için PALM mikroskop erişim için Harald Hess ve Eric Betzig ederim. Biz DNA yapıları için Michael Davidson, Geraldine Seydoux Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Hıristiyan Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema ve Marc Hammarlund ederim. Biz de Zeiss PAL-M, Zeiss Elyra P.1 PALM mikroskop bir beta sürümüne erişmesini sağlamak için Carl Zeiss Inc ederim.

<ol>
	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).</li><li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy.">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li><li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images:+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy.">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li><li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light,+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos.">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy.">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li><li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+background-free,+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+(SOFI).">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li><li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching/blinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules.">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li></ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Carl Zeiss, Inc tarafından desteklenen

Burada plastik, elektron mikroskobu kullanarak ultrastrüktürdeki bölümlerde floresan proteinleri yerelleştirilmesine ve görüntü floresan proteinleri korumak için nasıl açıklar. Proteinler nanometre çözünürlükte PALM mikroskopi kullanılarak kırınım limitinin altına yerleştiği belirlendi. Belirli örnekler için bu protokolü uyarlamak için, aşağıdaki parametreler dikkate alınmalıdır: fluorofor, ölçme ve hizalama. Floresan protein ya da organik fluorofor seçimi ve uygulama modeli sistemi bağlıdır. Biz EGFP, YFP, Sitrin, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry ve Dendra 12 gibi floresan proteinleri çeşitli test ettik. Her bir fluorofor gelen fluoresans muhafaza tüm floresan protein anlatılan yöntem kullanılarak korunabilir düşündüren, benzer olmuştur. Bu ifade, çünkü C de tdEos seçti elegans, proteinler tdEos kaynaşmış zaman işlevsel kaldı ve çünkü onunfoto-aktivasyon özellikleri PALM mikroskopi için uygun idi. Ancak, tdEos birleştirilmesi veya başarısız ifadesi bazen 12 gözlenmiştir. Uygulamaya bağlı olarak, farklı bir florofor daha uygun olabilir. Pek çok durumda, bir foto-aktif fluoresan protein kullanmak için gerekli değildir. Basit korelatif floresans elektron mikroskobu fotoğrafı aktive floresan protein gerektirmez. GFP ya da organik boyalar kırınım sınırın üzerinde bölümlerde etiketlenmiş proteinleri floresan imaj için de kullanılabilir. Örneğin, bir resim, bir floresan mikroskobu kullanılarak bir nöropil akson ve görüntüleme ile bir elektron mikroskobu, belirli bir akson, flöresanlı bir mikroskop üzerinde floresan ile floresan sinyalini ilişkili olabilir. Böyle uyarılmış emisyon azalması mikroskopi (STED) 12, bireysel molekül dönüş (GSDIM) 13 tarafından takip zemin devlet tükenmesi mikroskopi ve gibi diğer süper-çözünürlük teknikleri,yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) 14, foto-aktive floresan proteinleri gerekmez. Ayrıca, organik boyalar 9,15,16 veya floresan probları 17 intrinsik özelliğini kullanın süper-çözünürlük görüntüleme teknikleri kolayca uygulanabilir. Her bir molekülün flüoresan uzamsal ve zamansal ayrılır çünkü avuç içinde, molekül sayısı belirlenebilir. Oksidasyon, undercounting, overcounting ve ekspresyonu: Ancak, miktar dört nedenden dolayı yanıltıcı olabilir. İlk olarak, floresan protein fraksiyonu doğallığından ya da numune işleme 5,12 esnasında oksidize edilebilir. Floresans sinyalinin ~ 90% Bizim protokolde fiksasyon ve gömme yoluyla korunmuş olmasına rağmen örnek kesitli olmuştur ve yüzey oksijen maruz sonra, floresan protein oksidasyonu oluşabilir. İkinci olarak, foto aktive olan protein aktivasyonu stokastik, ve bu nedenle birden fazla moleküller olabilir,Belirli bir kırınım sınırlı nokta 8 aktive. Birden çok moleküllerin floresans bir nokta olarak görünür, ve proteinlerin bu nedenle toplam sayısı undercounted edilecektir. Üçüncü olarak, benzer bir sorun overcounting yol açabilir. PALM yılında beyazlatma tarafından, her bir floresan protein lokalize ve ardından &quot;silinir&quot;. Ancak, floresan proteinleri 18 kalıcı beyazlatılmış olmadan karanlık devlet dönebilirsiniz. Böyle moleküller sonra birden çok kez sayılır. Dördüncü olarak, etiketlenmiş proteinler transgenler olarak ifade edilmiştir ve genellikle aşırı ekspresyonu ile sebep olabilir çoklu kopyalar, mevcut edilir. Bu nedenle, palmiye dan miktarının belirli bir konumda molekül sayısını tahmin ancak tam olarak belirlemek için değil de kullanılabilir. Bir elektron mikrografı ile PALM görüntünün hizalamasını da çünkü elektron ışını nedeniyle ışık ve elektron mikroskobu ve bozulma içinde çözünürlük farkı zor olabilir. Altın parçacıkları gibi sıkı loc hizmetelektron mikrograflarında indirgeme belirteçler alized. Ancak, altın parçacıklar fluoresecence foto-aktif değildir ve büyük bir kırınım-sınırlı bir nokta olarak görünür. Böylece, elektron mikrografı üzerinde bir floresan imaj yerleştirme bir tahminidir. Çarpıtmalarla ayrıca plastik bölümü ile elektronların etkileşimleri ortaya çıkabilir. Bu tür GMA gibi akrilik reçineler, elektron ışını altında daha az kararlı olan ve plastik boyutları değiştirilebilir. Bu koşullar altında, ince yapı ile floresan hizalayarak, referans işaretleri doğrusal olmayan transformasyon gerektirebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif veya ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Yüksek basınçlı dondurucu </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact ve Wohlwend dan Leica veya HPF-01 HPM 100 de kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Otomatik dondurma ikamesi ünitesi </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 de kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon ve Vutara ayrıca ticari PALM mikroskoplar satmak. </td></tr><tr><td> Taramalı elektron mikroskobu </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Diğer yüksek çözünürlüklü mikroskobu SEM kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Aseton </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum permanganat </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albümin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Uranil asetat </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> Bu firma uranil asetat pH biraz daha yüksektir. </td></tr><tr><td> Glikol metakrilat (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Düşük asit, TEM notu. </td></tr><tr><td> N, N-dimetil-p-toluidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo şişeleri </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Cam şişeler </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar filmi </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM kapsül </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polipropilen </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DİSK zımbalar </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Altın nanopartiküller </td><td> mikroküreler-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> 2x konsantre çözelti isteyin </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

Proteinlerin dağıtım eşlenmesi, bir hücre içinde proteinlerin işlevine anlaşılması için gereklidir. Floresan mikroskobu yaygın Protein lokalizasyonu için kullanılan, ancak Subselüler bağlamda floresans görüntülerde genellikle yoktur edilir. Immuno-elektron mikroskopisi, diğer taraftan, proteinler lokalize olabilir, ancak en fazla antijen numune yüzeyine maruz değildir çünkü tekniğin uygun antikorlar, morfoloji ve zayıf korunmuş yokluğu yüzünden kısıtlıdır. Korelatif yaklaşımlar da immüno-floresans veya genetik tagged proteinler, önce bir bütün hücre floresan görüntü elde edebilirsiniz. Örnek sonra sabitlenir ve elektron mikroskobu için gömülü ve görüntülerin 1-3 ilişkilidir edilir. Bununla birlikte, düşük çözünürlüklü fluoresans görüntü ve indirgeme belirteçlerin olmaması proteinin tam olarak lokalize engellemektedir. Alternatif olarak, floresan görüntüleme plastik olarak numune korunması sonrasında yapılabilir. IçindeBu yaklaşım, blok kesitli ve floresans görüntüler ve aynı bölümün elektron mikroskop 4-7 ilişkilidir. Bununla birlikte, görüntü içinde ilintili ışık kırınım sınırı bireysel moleküllerin yerleri gizler, floresans ve sık sık hücre sınırlarının ötesine uzanmaktadır. Nano-çözünürlüklü floresan elektron mikroskobu (nano-FEM) foto-aktive localisation mikroskobu (PALM) ve elektron mikroskopi kullanılarak görüntüleme aynı kesimler tarafından nano-ölçekte proteinleri yerelleştirilmesine için tasarlanmıştır. PALM görüntüleme bireysel floresan proteinleri tarafından kırınım sınırı aştı ve daha sonra her floresan nokta 8-10 Centroid haritalama. Biz beş adımda nano-FEM tekniği özetlemektedir. İlk olarak, örnek sabit ve etiketlenmiş proteinlerin floresan korumak koşullar kullanılarak yerleştirilmiştir. İkinci olarak, reçine bloklar monte edilmiştir ultra-ince bölümler (70-80 nm) olarak bölünmüştürBir kapak camına. Üçüncü olarak, floresans Zeiss PALM mikroskop kullanarak bu bölümlerde görüntülenmektedir. Dördüncü, elektron yoğun yapıları taramalı elektron mikroskobu kullanılarak bu aynı bölümlerde görüntülü. Beşinci olarak, floresans ve elektron mikroskop indirgeme belirteçleri olarak altın parçacıkları kullanılarak hizalanır. Özet olarak, fluoresan etiketli proteinlerin hücre altı lokalizasyonu yaklaşık bir hafta içinde nm çözünürlükte tespit edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy at JoVE.com

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Biz elektron mikrograflarında fluoresan ışığı ile işaretlenmiş proteinler yerelleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Floresans ilk ince kesitler üzerinde fotoğraf ile aktive localisation mikroskopi kullanılarak yerelleştirilmiştir. Bu görüntüler daha sonra aynı bölümde elektron mikroskop ile hizalanır.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

nano-fem-protein-localization-using-photo-activated-localization

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K Görüntüleme.  University of Utah. Biz elektron mikrograflarında fluoresan ışığı ile işaretlenmiş proteinler yerelleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Floresans ilk ince kesitler üzerinde fotoğraf ile aktive localisation mikroskopi kullanılarak yerelleştirilmiştir. Bu görüntüler daha sonra aynı bölümde elektron mikroskop ile hizalanır.