Wir danken Harald Hess und Eric Betzig für den Zugang zum PALM Mikroskop für proof-of-principle Experimente, Richard Fetter für den Austausch Fixierung Protokollen, Reagenzien und Ermutigung. Wir danken Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema und Marc Hammarlund für die DNA-Konstrukte. Wir danken auch Carl Zeiss Inc. für den Zugang zu den Zeiss PAL-M, eine Beta-Version des Zeiss ELYRA P.1 PALM Mikroskop.

<ol>
	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).</li><li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy.">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li><li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images:+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy.">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li><li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light,+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos.">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy.">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li><li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+background-free,+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+(SOFI).">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li><li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching/blinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules.">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li></ol>

Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel wird von Carl Zeiss, Inc. gesponsert

Hier beschreiben wir, wie man fluoreszierende Proteine ​​erhalten in Kunststoff, lokalisieren die fluoreszierenden Proteine ​​in den Abschnitten und Bild die Ultrastruktur mittels Elektronenmikroskopie. Die Proteine ​​wurden unterhalb der Beugungsgrenze mit PALM Mikroskopie Nanometer-Auflösung lokalisiert. Um dieses Protokoll zu bestimmten Proben anzupassen, sollte die folgenden Parameter berücksichtigt werden: Fluorophor, Quantifizierung und Ausrichtung. Die Wahl des fluoreszierenden Proteins oder organischen Fluorophor hängt von der Anwendung und dem Modellsystem. Wir haben eine Vielzahl von fluoreszierenden Proteinen, einschließlich EGFP, YFP, Citrin, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry und Dendra 12 getestet. Die Erhaltung der Fluoreszenz von jedem Fluorophor war ähnlich, was darauf hindeutet, dass alle fluoreszierenden Proteinen erhalten kann mit dem beschriebenen Verfahren werden. Wir wählten tdEos weil es ausgesprochen gut in C. elegans, blieb Proteine ​​funktionell, wenn die tdEos verschmolzen, und weil seinePhotoaktivierung Eigenschaften waren optimal für PALM Mikroskopie. Allerdings hat Aggregation oder nicht Ausdruck tdEos wurde gelegentlich beobachtet 12. Je nach Anwendung kann ein anderes Fluorophor besser geeignet sein. In vielen Fällen ist es nicht notwendig, einen photoaktivierten fluoreszierenden Proteins zu verwenden. Einfache korrelative Fluoreszenz Elektronenmikroskopie erfordert keine photoaktivierten Fluoreszenzprotein. GFP oder organische Farbstoffe zur Bilder Fluoreszenz markierte Proteine ​​in den Abschnitten oberhalb der Beugungsgrenze verwendet werden. Beispielsweise kann ein Bild, ein Axon in einem Neuropil mittels Fluoreszenzmikroskopie und korrelieren das Fluoreszenzsignal einer bestimmten Axons in einer elektronenmikroskopischen Aufnahme durch Abbilden der Fluoreszenz an einem Fluoreszenzmikroskop. Andere Superauflösung Techniken wie stimulierte Emission Mikroskopie (STED) 12, Grundzustand Depletion-Mikroskopie von einzelnen Moleküls Rücklauf (GSDIM) 13 gefolgt, undstrukturierten Beleuchtung Mikroskopie (SIM) 14, erfordern keine photoaktivierten fluoreszierende Proteine. Darüber hinaus sind super-resolution imaging Techniken, organischen Farbstoffen 9,15,16 oder die intrinsische Eigenschaft von fluoreszierenden Sonden 17 verwenden leicht anwendbar. In PALM, kann die Anzahl der Moleküle, da quantifizierte Fluoreszenz jedes Molekül räumlich und zeitlich getrennt werden. Allerdings kann die Quantifizierung für vier Gründen irreführend: Oxidation, Unterschätzung, Überzählen und Überexpression. Erstens kann ein Bruchteil der fluoreszierenden Proteine ​​denaturiert oder oxidiert während Probenprozessierungsvorrichtung 5,12. Obwohl ~ 90% des Fluoreszenzsignals durch Fixierung und Einbettung in unserem Protokoll erhalten wurde, kann eine Oxidation des fluoreszierenden Proteins auftreten, nachdem die Probe wurde geschnitten und die Oberfläche Sauerstoff ausgesetzt. Zweitens ist die Aktivierung der photoaktivierbaren Proteine ​​stochastischen und somit mehrere Moleküle könnenaktiviert in einer gegebenen beugungsbegrenzten Fleck 8. Fluoreszenz von den mehreren Moleküle wird als einer Stelle erscheinen und somit die Gesamtzahl der Proteine ​​wird undercounted werden. Drittens kann ein ähnliches Problem zu Überzählen führen. In PALM wird jedes fluoreszierende Protein lokalisiert und dann auf &quot;Löschen&quot; durch Bleichen. Allerdings können fluoreszierende Proteine ​​aus dem dunklen Zustand, ohne dauerhaft gebleichte 18 zurückzukehren. Solche Moleküle werden dann mehrfach gezählt werden. Viertens tagged Proteine ​​als Transgene exprimiert und sind oft in mehreren Kopien, die zur Überexpression führen kann präsentieren. Daher kann die Quantifizierung von PALM für die Schätzung jedoch nicht genau bestimmen die Anzahl von Molekülen in einer bestimmten Position ist. Die Ausrichtung eines PALM Bild mit einer elektronenmikroskopischen Aufnahme kann auch wegen der Auflösung Unterschied in Licht und Elektronenmikroskopie und Verzerrung, die durch den Elektronenstrahl hervorgerufen Herausforderung sein. Goldpartikel dienen als dicht locsierte Bezugsmarkierungen in elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Allerdings ist fluoresecence aus Gold Partikel nicht photoaktivierten und erscheint als eine große beugungsbegrenzten Fleck. Somit ist die Platzierung eines Fluoreszenzbilds auf einer elektronenmikroskopischen Aufnahme eine Schätzung. Verzerrungen können auch aus Wechselwirkungen der Elektronen mit dem Kunststoffteil entstehen. Acrylharze wie GMA sind weniger stabil unter dem Elektronenstrahl, und die Abmessungen des Kunststoffes verändert werden kann. Unter diesen Umständen kann das Ausrichten des Fluoreszenz mit Ultrastruktur die nicht-lineare Transformation der Bezugsmarkierungen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagens oder Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hochdruck-Gefrierschrank </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> Empact und HPM 100 von Leica oder hpf-01 ab Wohlwend können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td> Automatisierte freeze Substitutionseinheit </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 kann auch verwendet werden. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon und Vutara verkaufen auch Gewerbe PALM Mikroskope. </td></tr><tr><td> Rasterelektronenmikroskop </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Andere hochauflösenden SEM Mikroskope verwendet werden kann. </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459.844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumpermanganat </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albumin aus Rinderserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetat </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH-Wert von Uranylacetat von diesem Unternehmen etwas höher ist. </td></tr><tr><td> Glycol-Methacrylat (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02.630-AA </td><td> Low Säure, TEM Klasse. </td></tr><tr><td> N, N-Dimethyl-p-toluidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryoröhrchen </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Glasfläschchen </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar Film </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM Kapsel </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polypropylen </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC Schläge </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Gold-Nanopartikel </td><td> Mikrosphären-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Fordern 2x konzentrierte Lösung </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

Abbilden der Verteilung von Proteinen ist wesentlich für das Verständnis der Funktion von Proteinen in einer Zelle. Fluoreszenzmikroskopie wird weitgehend für Proteinlokalisierung, aber subzelluläre Zusammenhang ist oft in Fluoreszenz-Aufnahmen fehlen. Immuno-Elektronenmikroskopie, auf der anderen Seite kann lokalisieren Proteine, aber die Technik ist durch das Fehlen von Antikörpern kompatibel, schlechte Konservierung von Morphologie und begrenzt, da die meisten Antigene nicht zur Probenoberfläche ausgesetzt sind. Korrelativen Ansätzen kann die Fluoreszenz Bild aus einer ganzen Zelle erst einmal erwerben, entweder von Immun-Fluoreszenz oder genetisch markierten Proteine. Die Probe wird dann fixiert und für die Elektronenmikroskopie eingebettet und die Bilder korreliert werden 1-3. Jedoch schließt die niedriger Auflösung Fluoreszenzbild und das Fehlen von Bezugsmarkierungen die genaue Lokalisierung von Proteinen. Alternativ können Fluoreszenz-Bildgebung nach Erhalt der Probe in Kunststoff ausgeführt werden. Indieser Ansatz ist der Block geschnitten und Fluoreszenzbilder und elektronenmikroskopische Aufnahmen von dem gleichen Abschnitt sind 4-7 korreliert. Allerdings überdeckt die Beugungsgrenze des Lichts in dem korrelierten Bild die Positionen der einzelnen Moleküle, und die Fluoreszenz erstreckt sich oft über die Grenze der Zelle. Nano-Auflösung Fluoreszenz-Elektronenmikroskopie (nano-FEM), zur Lokalisierung von Proteinen im nanoskaligen Maßstab durch bildgebende den gleichen Abschnitten mit Foto-activated localization microscopy (PALM) und Elektronenmikroskopie. PALM überwindet die Beugungsgrenze durch bildgebende einzelner fluoreszierender Proteine ​​und anschließend Kartierung der Schwerpunkt jedes fluoreszierenden Fleck 8-10. Wir skizzieren die Nano-FEM-Technik in fünf Schritten. Zuerst wird die Probe fixiert und eingebettet unter Verwendung von Bedingungen, die die Fluoreszenz des markierten Proteinen zu erhalten. Zweitens sind die Harz-Blöcke in ultradünnen Segmente (70-80 nm), die montiert sind geschnitteneauf einem Deckglas. Drittens wird die Fluoreszenz in diesen Abschnitten mit dem Zeiss PALM Mikroskop abgebildet. Viertens werden Elektronen dichte Strukturen in den gleichen Abschnitten mit einem Rasterelektronenmikroskop abgebildet wird. Fünftens werden die Fluoreszenz-und elektronenmikroskopische Aufnahmen ausgerichtet mit Goldpartikeln Bezugsmarken. Zusammenfassend kann die subzelluläre Lokalisation von fluoreszent markierte Proteine ​​in einer Auflösung im Nanometerbereich auf etwa eine Woche bestimmt werden.

Watch this Scientific Journal Video about Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy at JoVE.com

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Wir beschreiben ein Verfahren zur Lokalisierung fluoreszent markierte Proteine ​​in elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Fluoreszenz wird zuerst lokalisiert durch Foto-activated localization microscopy auf ultradünne Schnitte. Diese Bilder werden dann an elektronenmikroskopischen Aufnahmen von dem gleichen Abschnitt ausgerichtet ist.

Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

nano-fem-protein-localization-using-photo-activated-localization

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K Aufrufe.  University of Utah. Wir beschreiben ein Verfahren zur Lokalisierung fluoreszent markierte Proteine ​​in elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Fluoreszenz wird zuerst lokalisiert durch Foto-activated localization microscopy auf ultradünne Schnitte. Diese Bilder werden dann an elektronenmikroskopischen Aufnahmen von dem gleichen Abschnitt ausgerichtet ist.