Damos las gracias a Harald Hess y Eric Betzig para acceder al microscopio PALM para experimentos de prueba de principio, Richard Fetter para compartir protocolos de fijación, reactivos y estímulo. Damos las gracias a Michael Davidson, Seydoux Geraldine, Eimer Stefan, Leube Rudolf, Nehrke Keith, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada Nguema y Hammarlund Marc construcciones de ADN. También agradecemos a Carl Zeiss Inc para proporcionar acceso a la Zeiss PAL-M, una versión beta del microscopio Zeiss ELYRA P.1 PALM.

<ol>
	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).</li><li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy.">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li><li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images:+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy.">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li><li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light,+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos.">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy.">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li><li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+background-free,+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+(SOFI).">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li><li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching/blinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules.">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li></ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Carl Zeiss, Inc.

Aquí se describe cómo preservar las proteínas fluorescentes en plástico, localizar las proteínas fluorescentes en secciones, y la imagen de la ultraestructura con microscopía electrónica. Las proteínas se localizan por debajo del límite de difracción mediante microscopía PALM la resolución nanométrica. Para adaptar este protocolo a particular, los modelos, los parámetros siguientes deben ser considerados: fluoróforo, la cuantificación, y la alineación. La elección de la proteína fluorescente o fluoróforo orgánico depende de la aplicación y del sistema modelo. Hemos probado una variedad de proteínas fluorescentes, entre ellos EGFP, YFP, Citrino, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA mCherry, y Dendra 12. La preservación de la fluorescencia de cada fluoróforo fue similar, lo que sugiere que todas las proteínas fluorescentes se pueden conservar usando el método descrito. Elegimos tdEos porque expresaba bien en C. elegans, las proteínas siguen funcionando cuando se fusionó con tdEos, y debido a suactivación foto-características fueron óptimas para la microscopía de PALM. Sin embargo, la expresión de agregación o no de tdEos se ha observado en ocasiones 12. Dependiendo de la aplicación, un fluoróforo diferente puede ser más adecuado. En muchos casos, no es necesario el uso de una proteína fluorescente foto-activado. Microscopía de fluorescencia simple correlativo de electrones no requiere foto-activated proteína fluorescente. GFP o colorantes orgánicos se pueden utilizar para fluorescencia imagen de proteínas etiquetadas en secciones por encima del límite de difracción. Por ejemplo, uno puede imaginar un axón en un neuropil mediante microscopía de fluorescencia y correlacionar la señal de fluorescencia con un axón particular en una micrografía electrónica de imágenes de la fluorescencia en un microscopio de fluorescencia. Otras técnicas de super-resolución, como la microscopía de emisión estimulada agotamiento (STED) 12, estado fundamental microscopía agotamiento seguido por el retorno molécula individual (GSDIM) 13, ymicroscopía de iluminación estructurada (SIM) 14, no requieren foto proteínas activadas fluorescentes. Además, super-resolución de las técnicas de imagen que utilizan tintes orgánicos 9,15,16 o la propiedad intrínseca de sondas fluorescentes 17 son fácilmente aplicables. En PALM, el número de moléculas puede cuantificarse porque la fluorescencia de cada molécula se separa espacialmente y temporalmente. Sin embargo, la cuantificación puede ser engañosa por cuatro razones: la oxidación, la subestimación, overcounting y sobreexpresión. En primer lugar, una fracción de las proteínas fluorescentes se pueden desnaturalizar o se oxida durante el procesamiento de la muestra 5,12. Aunque ~ 90% de la señal de fluorescencia fue preservada a través de fijación e inclusión en el protocolo, la oxidación de la proteína fluorescente puede ocurrir después de la muestra ha sido seccionado y la superficie expuesta al oxígeno. En segundo lugar, la activación del foto-activables proteínas es estocástico, y por lo tanto pueden ser múltiples moléculasactivado en un determinado punto de difracción limitada 8. La fluorescencia de las moléculas de múltiples aparecerá como un punto, y por lo tanto el número total de proteínas se subcontados ser. En tercer lugar, un problema similar puede conducir a overcounting. En PALM, cada proteína fluorescente es localizado y luego &quot;borrados&quot; por blanqueo. Sin embargo, las proteínas fluorescentes pueden volver desde el estado oscuro sin ser permanentemente decolorado 18. Dichas moléculas entonces se cuenta múltiples veces. En cuarto lugar, las proteínas etiquetadas se expresan como transgenes y están a menudo presentes en múltiples copias, que pueden conducir a la sobreexpresión. Por lo tanto, la cuantificación de la palma se pueden utilizar para estimar, pero no determinar con precisión el número de moléculas en un lugar determinado. La alineación de una imagen de la palma con una micrografía electrónica también puede ser un reto, debido a la diferencia de resolución en la microscopía de luz y electrónica y la distorsión causada por el haz de electrones. Las partículas de oro servir como fuertemente loctrializados marcadores de referencia en micrografías electrónicas. Sin embargo, fluoresecence de partículas de oro no es foto-activado, y aparece como una gran mancha de difracción limitada. Por lo tanto, la colocación de una imagen de fluorescencia sobre una micrografía electrónica es una estimación. Distorsiones pueden deberse también a las interacciones de los electrones con la sección de plástico. Resinas acrílicas tales como GMA son menos estables bajo el haz de electrones, y las dimensiones del plástico puede ser alterado. Bajo estas circunstancias, la alineación de la fluorescencia con ultraestructura puede requerir de transformación no lineal de los marcadores de referencia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o equipo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> De alta presión congelador </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPACT y HPM 100 de Leica o HPF 01-de Wohlwend también se puede utilizar. </td></tr><tr><td> Congelación automatizado unidad sustitución </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 también se puede utilizar. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon y Vutara también venden microscopios comerciales de palma. </td></tr><tr><td> Microscopio electrónico de barrido </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Otros de alta resolución de los microscopios SEM se puede utilizar. </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmio tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> El permanganato de potasio </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de uranilo </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH de acetato de uranilo de esta empresa es ligeramente superior. </td></tr><tr><td> El glicol metacrilato (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Ácido bajo, grado TEM. </td></tr><tr><td> N, N-dimetil-p-toluidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo viales </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio viales </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar película </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM cápsula </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polipropileno </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISCO golpes </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Las nanopartículas de oro </td><td> microesferas-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Solicitar solución concentrada 2x </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

Mapeo de la distribución de las proteínas es esencial para la comprensión de la función de las proteínas en una célula. Microscopía de fluorescencia se utiliza ampliamente para la localización de proteínas, pero contexto subcelular es a menudo ausente en las imágenes de fluorescencia. Immuno-microscopía electrónica, por otro lado, puede localizar proteínas, pero la técnica está limitada por la falta de anticuerpos compatibles, pobre preservación de la morfología y porque la mayoría de los antígenos no están expuestos a la superficie de la muestra. Enfoques correlativos puede adquirir la imagen de fluorescencia de una célula entera primero, ya sea de inmuno-fluorescencia o proteínas genéticamente marcadas. La muestra es luego fijado e incluido para microscopía electrónica, y las imágenes se correlaciona 1-3. Sin embargo, la imagen de fluorescencia de baja resolución y la falta de marcadores de referencia excluye la localización precisa de las proteínas. Alternativamente, imágenes de fluorescencia se puede hacer después de la preservación de la muestra en plástico. Eneste enfoque, el bloque es seccionado, y las imágenes de fluorescencia y las micrografías de electrones de la misma sección se correlacionan 4-7. Sin embargo, el límite de difracción de la luz en la imagen correlacionada oscurece las ubicaciones de las moléculas individuales, y la fluorescencia a menudo se extiende más allá del límite de la célula. Nano-resolución fluorescencia microscopía electrónica (nano-FEM) está diseñado para localizar proteínas en nano-escala por las mismas secciones de imágenes usando Photo activado por microscopía de localización (PALM) y microscopía electrónica. PALM supera el límite de difracción por formación de imágenes fluorescentes de proteínas individuales y, posteriormente, el mapeo de la centroide de cada 8-10 mancha fluorescente. Planteamos la técnica de nano-FEM en cinco pasos. En primer lugar, la muestra se fija y encajada, usando condiciones que preservan la fluorescencia de las proteínas etiquetadas. En segundo lugar, los bloques de resina son seccionaron en segmentos ultrafinas (70-80 nm) que están montadosen una cubierta de vidrio. En tercer lugar, se crea una imagen de fluorescencia en estas secciones usando un microscopio Zeiss PALM. En cuarto lugar, estructuras densas de electrones se visualizan en estas mismas secciones utilizando un microscopio electrónico de barrido. En quinto lugar, las micrografías de fluorescencia y de electrones se alinean usando partículas de oro como marcadores fiduciales. En resumen, la localización subcelular de las proteínas etiquetadas fluorescentemente se puede determinar en resolución nanométrica en aproximadamente una semana.

Watch this Scientific Journal Video about Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy at JoVE.com

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Se describe un método para localizar proteínas etiquetadas fluorescentemente en micrografías electrónicas. La fluorescencia se localiza primero mediante foto-activado microscopía de localización en secciones ultrafinas. Estas imágenes se alinean entonces a micrografías electrónicas de la misma sección.

Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

nano-fem-protein-localization-using-photo-activated-localization

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K vistas.  University of Utah. Se describe un método para localizar proteínas etiquetadas fluorescentemente en micrografías electrónicas. La fluorescencia se localiza primero mediante foto-activado microscopía de localización en secciones ultrafinas. Estas imágenes se alinean entonces a micrografías electrónicas de la misma sección.