Yazarlar Land Baden-Württemberg ve Europäische Birliği Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung ederim - fon ZAFH-PHOTON n, herhangi bir fon araştırma bursu için Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) için. 1792C08 yanı sıra proje &quot;Aurami&quot; finansmanı için Baden-Württemberg-Stiftung GmbH.

1. Hücre Ekici ve Kuluçka <ol><li> Tohum tek tek hücreler, örneğin, U373-MG-251 ya da U-MG, glioblastoma hücrelerinin bir cam slayt üzerinde 100 hücre / mm 2 &#39;tipik bir yoğunlukta ve (örneğin RPMI 1640 ve% 10 fetal dana serumu ile takviye kültür ortamı 4872 saat süreyle büyümelerini ve 37 bir inkübatör kullanarak antibiyotikler) ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Bir zar işaretleyici, örneğin 6-Dodekanoil-2-dimetilamino 8 uM (kültür ortamı, 4) ya da bir işaretleyici sitoplazma &#39;lik bir konsantrasyonda 60 dakika için uygulanan naftalen (laurdan), örneğin, kalsein acetomethlyester bir 40 dakika boyunca uygulanmış olan hücreler inkübe 4,5, 5 uM 3, ışığa ya da ilişkili bir zar konsantrasyonu, örneğin, protoporfirin IX, öncülü olan 5-aminolevulinik asit (1 mM 5-ALA) ile 4 saat kuluçka üzerine indüklenen. </li><li> Kültür ortamı veya fosfat ile yıkayın hücrelerini salin (PBS) floresan mikroskobu önce tamponlu. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> Dik bir mikroskop, örneğin, Zeiss Axioplan kullanımı ve Ref de tarif edildiği gibi, bir aydınlatma cihazı tarafından kondansatör değiştirin. Hemi-küresel veya optik (bkz. Şekil 1) nesnenin slayt birleştiğinde hemi-silindirik cam prizma ile 3. </li><li> Paralel collimated Lazer ışını kullanarak hangi cam prizma ve tekrar ileri optik bileşenlerin (örn. içbükey ayna) numune yüzeyi (telesentrik öğrenci ışını) üzerinde paralel bir ışın sonuçlar tarafından görüntüleme sonra. Elektrik alan vektörü geliş düzlemine dik polarize olmasına özen gösterin. </li><li> Örnek düzleminde görüntülenmiş ve sıklığı değişken açılı (nesne ışını) altında örnek yanar kondenser içinde bulunan ayarlanabilir bir ayna kullanın. Her bir pozisyon sıklığı iyi tanımlanmış bir açı karşılık geldiği goniometrik ölçümler 3 tarafından belirlendiği gibi ayarlanabilir ayna, bir adım motoru tarafından tahrik edilebilir </&gt; sup. </li><li> Kritik açısı kullanılarak ayarlanabilir ayna açısal konumunun kalibre Θ c = 61.3 °, sabit bir değer olarak bir su-cam geçiş için. Θ c floresan boya (örneğin 1 mM flavin mononükleotid, FMN) suda çözülür Θ değişimi üzerine canlandırılabilir. De ayna pozisyon Θ = Θ c ayna pozisyonlama programında depolanır. </li><li> Sıcaklık, kazanç, kayıt süresi ve vardiya hız dahil kameranın parametrelerini (arka aydınlatmalı Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Teknoloji, Belfast, UK 6) ayarlayın. </li><li> Uygun büyütme ve tercihen orta sayısal diyafram (örneğin 40 × / 0,75 ya da 63 × / 0.90 suya daldırma) bir objektif lens kullanın ve mikroskop nesne slayt yerelleştirilmesine. Cam prizma ile numunenin optik bağlantıyı sağlamak için immersiyon yağı kullanın. Değişimi üzerine özdeş örnekleri floresans görüntüleri kaydedinaydınlatma açısı (Θ ≥ Θ Θ c ile c hücre cam arayüzü için 64,5 ° karşılık gelen). 0.5 ° veya 1 ° adımlarla 66 ° -74 ° arasında bir açı aralığı önerilir. Floresans saptama için uygun bir uzun pas veya band geçiren filtre kullanın. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Değişik açılardan Θ yanı sıra kamera ayarlarını (arka plan ayrımcılık), dalgaboyu ve cam kırılma endeksi (= 1.52 n + 1) ve hücreler de kaydedilen görüntüleri (ASCII formatında örneğin) (n 2 = 1.37) okuyun değerlendirme programı içine (LabView; NanoCell). Için parametreler penetrasyon derinliği d (Θ) ve iletim faktörü T (Θ) her set otomatik olarak hesaplanır. </li><li> Denklem 5 (membran belirteci) veya Denklem 4 (sitoplazma işaretleyici), homojen olmayan ile bireysel görüntülere göre Δ hücre-substrat mesafeleri değerlendirilmesinde kullanılan görüntüleri seçinaydınlatma (açığa e, g. çizgili) hariç tutulabilir. </li><li> Hücre-yüzey topolojisi görüntüleri hesaplama ve görüntüleme için uygun bir renk kodu belirleyin. Şekil 2 &#39;de gösterildiği gibi tek tek piksel değerlendirilmesi profilleri boyunca, görüntülenebilir. Bu profilleri uygun kalitesi için bir gösterge olarak kullanılabilir. </li><li> Değerlendirme protokolü saklayın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Örnek deneyler nazik Prof Oca Mollenhauer, Moleküler Onkoloji Bölümü, Güney Danimarka Üniversitesi, Odense tarafından verilen genetiği U251-MG glioblastoma hücreleri ile yürütülmektedir. Bu U251 hücreleri iki yola çıkılarak alt klonlar olarak tümör baskılayıcı genler TP53 veya PTEN kullanarak aşırı ifade edilir bir Tet-On indüklenebilir ifade sistemi, bu hücrelerin azalması tümörojenik potansiyeli sergilemek ve daha az malign olarak kabul edilebilir böyle. Supresör geni olmadan son derece malign U251-MG hücreleri kontrol grubu olarak kullanıldı ve U251-edilirMG vahşi tip hücrelerin bir başka karşılaştırma için hizmet vermektedir. Pikosaniye bakliyat, yarı sürekli bir dizi (;: 391 nm; darbe enerjisi: 12 PJ; tekrarlama oranı: dalgaboyu sürücüsü PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Almanya ile LDH400 40 MHz) yayan bir lazer diyot bir uyarım kaynağı olarak kullanılır. Şekil olarak bir aktif TP53 tümör baskılayıcı gen ve laurdan (8 uM; 60 dk) ile inkübe U251-MG glioblastoma hücreleri 3 TIRFM görüntüleri 66.0 ° insidansı açıları, 69.0 ° ve 73.0 ° ve penetrasyon derinlikleri karşılık için tasvir edilmiştir yaklaşık 140 nm yiten elektromanyetik alan, 75 nm ve 60 nm, sırasıyla. Penetrasyon derinliği floresans azalması ile yoğunluğu azalır (terazi bakın) ve hücrelerin daha yüzeysel siteleri (üzerlerine kenarları örneğin odak kişileri) kaynaklanmaktadır. Hücre-substrat mesafeleri (0-600 nm arasında değişen bir renk kodu ile Şekil 3d görüntülenmiştir) kuvvetle üzerine arasındaki hücreleri üzerinde değişiklikly birkaç nanometre (beyaz-sarı) ve 250-300 nm (koyu kırmızı), yani odak kişileri ve daha büyük hücre-substrat mesafeleri yakın çevresinde bulunmaktadır. Şekil 4b, hücre-substrat mesafeleri U251-MG kontrolü ve 80-100 nm tipik değerleri ile vahşi tip hücreleri (sarı için oldukça sabit iken aynı bir aktifleştirilmiş baskılayıcı gen PTEN (Şekil 4d) ile U251-MG glioblastoma hücreleri için geçerlidir ) ve 150-200 nm (turuncu-kırmızı; Şekil 4a). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> Şekil 1. Dik mikroskop VA-TIRFM için aydınlatma cihazı. Bir adım motoru tarafından tahrik edilen bir ayarlanabilir ayna ± 0.25 ° &#39;lik bir açısal izin vermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> Bir PIX için Şekil 2. Değerlendirilmesi profiliel (şematik). Ne ln [I F / T (Θ)] 1 / d (Θ) bir fonksiyonu olarak çizilir, yamaç hücre-substrat mesafe Δ temsil eder. Bu eğim, genellikle yaklaşık bir hassasiyet ±% 10 ile tespit edilir. Bir değer - homojen aydınlatma kaynaklanan - işaretlenir ve değerlendirme dışında tutulmuştur. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> Şekil 3 laurdan (8 uM, 60 dk) ile inkübasyondan sonra, aktif TP53 baskılayıcı gen ile U251-MG, glioblastoma hücrelerinin TIRFM görüntüler. Aydınlatma çeşitli açılardan (AC) de kaydedilir; 0-600 nm aralığında hücre-yüzey mesafeleri gösterildiği 391 nm, algılama: ≥ 420 nm; resim boyutu: dalgaboyu, bir renk kodu (d). 210 mikron × 210 mikron <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Şekil 4, bir renk kodu ile gösterilen 0-600 nm aralığında U251-MG glioblatoma hücreleri hücre-yüzey mesafeleri;. (A) vahşi tip (B), kontrol, aktive baskılayıcı gen TP53 (c) hücreleri, (d) aktive supresör geni PTEN olan hücreler; dalgaboyu: 391 nm, algılama: ≥ 420 nm; resim boyutu:. 210 mikron × 210 mikron <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bir yöntem olup nanometre hassas hücre-yüzey uzunluk ölçmek için açıklanmıştır. Halen, süper-çözünürlük mikroskopi yöntemleri, örneğin yapılandırılmış aydınlatma 7 veya tek molekül saptama 8-10 yanı sıra uyarılmış emisyon azalması (STED) mikroskopi 11 hatırı sayılır bir ilgi vardır dayanmaktadır. Bu teknikler hiçbiri, yine de, 50 nm altındaki bir eksenel çözünürlüğe izin vermektedir. Buna ek olarak, 50100 arasında oldukça yüksek ...

Kırılma indisi n, 1 arasında bir ortam içinden ilerleyen bir ışık ışını kırılma indisi n, 2, ikinci bir ortam bir ara yüz karşılaştığında &lt;n 1, toplam iç yansıma kritik açı daha büyük olan oran Θ tüm açılar meydana gelir Θ c = arcsin (n = 2 / n 1). Tamamen yansıyan olmasına rağmen olay ışık demeti ben göre ikinci orta ve arabirimden dik mesafe z&#39;nin katlanarak çürüklerini giren bir fani elektromanyetik alan çağrıştırıyor (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) olarak verilen, dalga boyu λ da penetrasyon derinliği ile elektromanyetik alan ve d (Θ) yoğunluğunu tekabül d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Literatürde 1,2 bildirildiği kadarıyla, ben 0 </sub&gt; I e iletim faktörü T (Θ) ve oranı n 2 / n 1 ile çarpılır olayla ışık yoğunluğuna karşılık gelir. Bu, ışının elektrik alan vektörü geliş düzlemine (olay ve yansıyan ışın tarafından yayılmış düzlemi yani) için polarize dik ise, bu iletim faktörü tarafından verilir T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n = 2 / nL 1) 2] TIRFM ölçümleri de tespit edilen floresans yoğunluğu, ışık emme numune, tüm tabakaları üzerine entegre edilmiş ve ilgili boya floresans kuantum verimi ile η yanısıra algılama Ω katı açı ile çarpılarak gerekmektedir. 3. Daha önce belirtildiği gibi, bu yoğunluk ile tanımlanabilir Ben F (Θ) = (Θ) OC (z) AT E-z / d (Θ) dz Eğer bağımsız f tüm faktörler<html> florofor konsantrasyon c (Z) hemen hemen sabit olduğu için kabul edilir ise ROM geliş açısı Θ ve koordinat z deneysel sabit A. Denklem 3 içinde yer alır, analitik olarak çözülebilir - Ya da bütün koordinatlar z ≥ Δ de arayüzünden bir mesafe Δ sahip olan hücrelerinin sitoplazması içinde, örn. Bu durumda, tamamlayıcı z = Δ kadar z = ∞ elde olarak hesaplanmalıdır Ben F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Ya da z arasında = Δ - t / 2 ve z = Δ + T / 2, kalınlığı t, ince bir tabaka içinde, yani, örneğin, arayüz Δ bir mesafede bulunan bir hücre membranıdır. Bu durumda, floresan yoğunluğu olarak hesaplanabilir; Ben F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), t Δ ile karşılaştırıldığında küçük ise. floresans yoğunluğunu I, F görüntü değişken açılı için kaydedilir ise Eşitlik (4) ve (5) hücre-yüzey mesafeleri ent &quot;&gt; Δ, hesaplanabilir Θ, ve eğer ln (I F / T d) (denklem 4) ya da ln (I F / T) (denklem 5) bu açılar için 1 / d&#39;lik bir fonksiyonu olarak değerlendirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan zar işaretleyici laurdan (s. altında) için değerlendirme Denk. 5&#39;e göre yapıldı. Daha önce 3, görüntü elde bildirdi ve değerlendirme gerektirdiğinden dolayı - Numune üzerinde uyarma ışık homojen dağılımı, - 2-katmanlı model (yüzey ve sitoplazma için kırılma indisleri n 1 ve n 2 ile, sırasıyla) geçerlilik. Plazma zar çok ince ise, bu, tutar, ve hücre dışı ortamda (hücre ile alt tabaka arasında) tabaka gelen ışığın dalga boyu ile karşılaştırıldığında küçük ise. Buna ek olarak, bir orta açıklık sayısal(Tipik olarak A ≤ 0.90) mikroskop objektif lens dielektrik arayüz yakın alanına radyasyon anizotropi dolayı parlaklık sapmaları engellemek için avantajlıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Tip </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kuluçka makinesi </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Laminar akım </td><td> Güvenli Holten </td><td> S2010 1.2 TR GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM +% 10 FCS +% 1 penisilin / streptomisin </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Yetiştirme ortamı </td></tr><tr><td> Cam nesne slaytlar </td><td> Marienfeld </td><td> Saf beyaz cam </td><td> Kullanılan özel temizleme prosedürü </td></tr><tr><td> 6-Dodekanoil-2-dimetilamino naftalin (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Floresan işaretleyici (Stok çözelti: Etanol içinde 2 mM) </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Lazer diyot </td><td> PicoQuant </td><td> Sürücü PDL 800-B ile LDH 400 </td><td> Dalga boyu: 391 nm </td></tr><tr><td> Tek modlu fiber sistemi </td><td> Nokta Kaynağı </td><td> kineFlex </td><td> Collimating optik ile ikinci </td></tr><tr><td> EMCCD kamera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Arka aydınlatmalı kamera </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Yüzey topoloji, bir substrat üzerinde büyüyen hücrelerin örneğin, Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) tarafından nanometre hassasiyetle belirlenir. Hücreler şeffaf slaytlar üzerinde ekili ve homojen onların plazma membranında dağıtılan bir floresan işaretleyici ile inkübe edilir. Aydınlatma yiten elektromanyetik alanın farklı nüfuz etme derinliği olan toplam iç yansıma (TIR) ​​değişken açılı altında paralel bir lazer ışını ile gerçekleşir. Yaklaşık 10 farklı açılarda ışınlaması üzerine floresans görüntülerinin kaydedilmesi birkaç nanometre hassasiyetle hücre yüzey mesafeleri hesaplamak için izin verir. Çeşitli hücre çizgileri, örneğin, kanser hücreleri ve daha az habis hücreleri arasında yapışma farklılıkları, bu şekilde tespit edilmektedir. Buna ek olarak, kimyasal ya da fotodinamik tedavi bağlı hücre yapışmasının olası değişiklikleri kontrol edilebilir. Süper-çözünürlük diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında mikroskopi ışığa maruz tutulurcanlı hücreler, çok küçük, ve herhangi bir hasar meydana beklenmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Bir substrat üzerindeki hücre adezyon Topolojisi değişken açılı toplam iç yansıma floresan mikroskobu (VA-TIRFM) tarafından nanometre hassasiyetle ölçülür.

Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) üzerine Hücre yapışma Nanotopology

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

10.1K Görüntüleme.  Institut für Angewandte Forschung. Bir substrat üzerindeki hücre adezyon Topolojisi değişken açılı toplam iç yansıma floresan mikroskobu (VA-TIRFM) tarafından nanometre hassasiyetle ölçülür.

Video: Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Biyomühendislik

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly interesting for already approved polymers that have a long standing use in medicine because these materials are well characterized and legal issues associated with the introduction of newly synthesized polymers may be avoided. Polytetrafluoroethylene (PTFE) is one of the most frequently employed materials for the manufacturing of vascular grafts but the polymer lacks cell adhesion promoting features. Endothelialization, i.e., complete coverage of the grafts inner surface with a confluent layer of endothelial cells is regarded key to optimal performance, mainly by reducing thrombogenicity of the artificial interface.
This study investigates the growth of endothelial cells on peptide-modified PTFE and compares these results to those obtained on unmodified substrate. Coupling with the endothelial cell adhesive peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) is performed via activation of the fluorin-containing polymer using the reagent sodium naphthalenide, followed by subsequent conjugation steps. Cell culture is accomplished using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and excellent cellular growth on peptide-immobilized material is demonstrated over a two-week period.

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Geliştirilmiş Hücre yapışma Politetrafloroetilen Islak Kimya ve Peptit İmmobilizasyonu

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...