Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI050677, HD-051998 ve GM103433), bir Malcolm Feist kardiyovasküler araştırma bursu ve bir Amerikan Kalp Derneği predoctoral bursu (10PRE4200007) hibe tarafından desteklenmiştir.

1. Jelatin-kaplanmış lameller hazırlanması <ol><li> Bir steril plastik 100 mm çanak (es) yerleştirin asitle yıkanmış cam lameller (çapı 15 mm). Tabak başına 8-9 lamelleri yerleştirin ve birbirlerine dokunmadan veya yemeğin tarafında değil emin olun .. </li></ol> Not: lameller, iğneler ve cımbız muhtemel kirletici mikroorganizmaların, hem de hareketliliği de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonlar, endotoksinler etkiler ortadan kaldırmak için steril olması gerekmektedir. <ol start="2"><li> Jelatin toz tartılır ve 0.5 g/300 ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon ile bir jelatin solüsyonu yapmak için deiyonize su içinde tekrar süspansiyon toz. Daha sonra, jelatin solüsyonu otoklava gerekmektedir. </li><li> Pipet 2-3 her bir lamel üzerine jelatin (~ 100-150 ml) damla. </li></ol> Not: Jelatin çanak dokunmak veya çanak lamelleri kaldırmak mümkün olmayacaktır izin vermemek için dikkatli olun. <ol start="4"&gt; <li> 10 dk için 90 ° C sıcaklıkta bir fırında 100 mm tabak jelatin kaplı lamelleri pişirilir. </li><li> Nazik pipetleme tarafından aşırı jelatin çıkarın. </li><li> 45 dk için 70 fırın içinde 100 mm tabak ° C lamelleri kurutun. </li><li> Kuruduktan sonra, steril, endotoksin ücretsiz iğne ve cımbız (iğne hafifçe kaldırmak için yavaşça cımbız için erişilebilir yapmak için lamel kadar dürtmek için kullanılan) kullanarak 100 mm çanak lamelleri çıkarın. </li><li> 24-iyi çanak ayrı kuyulara bireysel jelatin kaplı lamelleri yerleştirin. </li></ol> 2. Kolloidal Altın kaplı lameller hazırlanması <ol><li> Chloroauric asit (tetrakloro asit trihidrat; HAuCl 4 · 3H 2 O) uygun bir miktarı tartılır ve sonra bir nihai 14.5 mM solüsyonu (zehirli) maddesinin hazırlanması için steril deiyonize su içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 8-9 lamelleri başına çözelti 1.5 ml hazırlayın. </li></ol> Uyarı: Chloroauric asit hkucak dolusu yutulduğunda, Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur ve alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir. Yutulması halinde toksiktir. <ol start="2"><li> Sodyum sitrat, uygun bir miktarda tartılır (trisodyum dihidrojen 2-hydroxypropane-1 ,2,3-tricarboxylate, Na 3 C 6 H 5 O 7) ve daha sonra son bir% 0.5 çözelti yapmak üzere deiyonize su içinde tekrar süspansiyon toz. 8-9 lamelleri başına 1 ml çözelti hazırlayın. </li></ol> Uyarı: Sodyum sitrat göz ve cilt tahrişine neden olabilir. Ayrıca solunum ve sindirim yollarında tahrişe neden olabilir. <ol start="3"><li> Steril, endotoksin ücretsiz beher içinde steril 14.5 mM HAuCl 4 solüsyon ve steril deiyonize su 13.5 ml 1.5 ml birleştirmek sonucu soluk sarı bir çözelti elde edilmelidir. Adı geçen hacimleri için 8-9 koloidal altın lamelleri için izin verir. </li><li> Sürekli karıştırarak ederken bu b başlayana kadar, bir sıcak plaka üzerinde çözüm ısıtmakyağ. </li></ol> Uyarı: buharları toksik / zararlı olabilir gibi çözüm ısıtma, davlumbaz yapılmalıdır. Buharlar mukoza ve üst solunum yolu dokusu için yıkıcı vardır. <ol start="5"><li> Sıcak plaka gelen beher çıkarın. </li><li> Karıştırma sırasında,% 0.5 sodyum sitrat solüsyonu 0,7 ml eklenir. Söz konusu hacim yapılacak 8-9 koloidal altın lamelleri için izin verir. </li><li> Yaklaşık 2 dakika için bu birleşik çözüm karıştırarak tutun (Not: çözüm rengi yavaş yavaş nihayet bir kırmızı şarap ulaşmadan önce, derin mor, mor, gri, açık veya, tercihen, pas rengi, soluk sarı değişecektir) . Bu ürün kolloidal altın çözümdür. </li><li> 1-2 dk (koloidal altın çözeltisi eklendiğinde, erime lamel jelatin tabaka tutmak için) için 10 ml lik bir pipet, koloidal altın çözelti soğutulur ve daha sonra colloida bir 1.0-2.0 mLbakınız - önceden bir 24-kuyu çanak (ler) (bu, jelatin kaplı lamelleri eklediği koloidal altın çözelti miktarı altın parçacıkları çözelti içinde çökeltilmiştir ne kadar iyi bağlıdır yerleştirilmiş her bir jelatin kaplı lamel üzerine l altın çözelti aşağıdaki yorum). </li></ol> Not: altın partikül Yağış verimliliğinde farklılıklar olabilir Çünkü, ilk jelatin kaplı lamelleri için koloidal altın çözeltisi 0.5-1 ml ekleyin ve sonra 0.5 saat boyunca inkübatörde 24-iyi çanak koymak için tavsiye edilir . Bu inkübasyon süresinden sonra, lamelleri lameller üzerine altın parçacıkları uygun yoğunluk için hafif mikroskop altında kontrol edilmelidir. Altın parçacıkları çok düşük ve çok yüksek bir konsantrasyon örnekleri 20x mikroskobu görüntüleri için Şekil 1&#39;e bakınız. Altın parçacıkları (en azından monositler ile kullanmak için) ideal bir konsantrasyon 40x mikroskopi görüntü elde etmek için Şekil 2&#39;ye bakınız. Optfarklı hücrelerin özellikleri lamelleri üzerine hareketin kendi gücünü dikte edecek gibi slayt üzerinde altın nanopartiküller olmuş bölgeler yoğunluğu deneysel, kullanılan her bir hücre tipi için tespit edilmelidir. Altın partiküllerinin konsantrasyonu yetersiz ise, jelatin kaplı lamelleri ile koloidal altın çözeltisi ilave 0.5-1 ml eklenir. Hücre boyutuna bağlı olarak, altın partiküllerinin uygun konsantrasyonu değişebilir ve bu, bunun bir sonucu olarak hareketlilik açısından incelenmiştir hücre boyutuna bağlı olacaktır. Örneğin, küçük ölçekli hücreleri (~ 10-20 mikron 28) insan monosit ile, altın parçacıkları daha yüksek bir konsantrasyon analizlerimiz gerek duyuldu. Nanoparçacıkların uygun dağılımını kolayca ve verimli bir hücresel parçaların kenarları ayırt edebilme becerisi ile araştırmacı sağlar. Çok yüksek altın parçacıkları bir konsantrasyon doğru bir şekilde ölçmek için dolayısıyla hareket etmek için ve hücrelerin yeteneğini engellemektedirhareketliliğini iken motilite doğru bir parça çizmek için çok düşük limitler olanları yeteneğidir altın parçacıkları bir konsantrasyon. Önemli Not: nanoparçacıkların sentez soruna neden olan, sentez nanoparçacıkların 5 nm ile 400 nm boyutlarda ticari olarak temin edilebilir. Buna ek olarak, floresan mikroküreler hücre hareketi 29 çalışmalarda aynı zamanda kullanılmıştır. Ancak, bu mikrosferler kullanımı hücre göçü ve analizi için bir floresan mikroskobu gerektirir. <ol start="9"><li> 37 küvözde kolloidal altın kaplı lamelleri ile 24 sıra tabak koyun 1 saat gecede ° C ve inkübe. </li><li> Inkübasyondan sonra, durulama / (PBS, pH 7.4) tamponlu salin steril fosfat içine lamelleri (3x) batırarak ilişkisiz altın kaldırın. </li><li> PBS içeren temiz 12-iyi çanak (es) bu kolloidal altın kaplı lamelleri yerleştirin. </li><li> 4 ° C &#39;ye kadar olan bu lamelleri depolamak için hazır(parafilm buzdolabında yerleştirmeden önce plaka) kullanın. </li></ol> Önemli Not: Her zaman altın parçacıkları lamelleri gelen soyulmaz kurumasına izin verirseniz olabildiğince sıvı / medya bazı tür kolloidal altın kaplı lamelleri tutmak. Kolloidal altın lamelleri yapıldığı tarihten itibaren 2-3 ay içinde kullanılmalıdır. Kalite Kontrol: tek bir parça phagokinetic motilite tahlil olarak, altın parçacıkları benzer bir konsantrasyon ile karakterize edilir lamelleri kullanmak için çok önemlidir. Bu basit nokta muamele ile değil, koloidal altın kaplı lamelleri fiziksel özelliklerinin doğası sadece bağlı olduğu örnekleri arasında hücre hareketliliği de kantitatif farklılıklar için izin verir. Bu nanoparçacıkların yoğunluk sürece eşit olduğunu göstermiştir olmakla beraber, ayrı deneyler, aynı anda yapılan tek lamelleri kullanarak lehine, lamelleri kullanımıFarklı hazırlıkları uygundur. 3. Hücresel Motilite Analiz <ol><li> İlgi hücreleri için uygun bir hücresel ortamda, koloidal altın kaplama lamelleri yerleştirin. </li><li> 24-iyi çanak (es) yerleştirilir kolloidal altın kaplı lamelleri üzerine uygun şekilde tedavi hücreleri aktarın </li></ol> Not: tek bir iyi transfer hücrelerin sayısı, her bir hücre tipinde çalışma için tespit edilmesi gerekmektedir. İdeal olarak, hücrelerin eşit sırayla tek bir hücre tarafından oluşturulan tek parça istatistiksel analiz için izin verecektir kolloidal altın kaplı lamel üzerinde dağıtılması gerekir. Hücrelerinde çok yüksek bir konsantrasyonda kaplama durumunda, birden fazla hücre çakışan rota görülecektir ki son derece olası hale gelir. Örtüşen parça doğru nicelendirildi edilemez ve dolayısıyla bunlar, test edilen hücre hareketi, sonuç olarak dikkate alınması mümkün değildir. Bir sonucu olarak parça Örtüşenbirden fazla hücre tutulum genellikle kolayca gözlenir; iki ya da daha fazla hücrenin aynı bitişik temizlenmiş bir alana görülebilir olan parça (analizi alanında) birleştirilmiş ya da çapraz olarak. <ol start="3"><li> 37 inkübe ° 24 hr C /% 5 CO 2 (veya herhangi uygun bir zaman, biz 6 saat ve 12 saattir tedavi sonrası 24 saat sonrası tedavi ve endotel hücreleri arasında monosit motilitesini analiz ettiler örneğin). Hücre tipi çalıştı ve böylece deneysel her bir hücre türü (- 12 saat sonrası tedavi iyi bir başlangıç ​​noktası, ancak, 6, olduğu) için tespit edilir ile hücre hareketliliği belirlenmesi ve ölçülmesi için optimum süre çerçevesi değişecektir. </li></ol> Not: Deneysel kolloidal altın kaplı lamelleri daha sonraki bir zamanda depolanan ve / veya analiz edilmesi gerekiyorsa, hücreleri ve altın nanopartiküller lamelleri üzerine sabit olması gerekir. Bu tespitin adımı gerçekleştirmek için; aşağıdaki Adım 3.3, ilk yıkamada 1x ile dikkatlice 2 kez lamelleriPBS (lamelleri altın nanopartiküller bir kaldırma kaçınılmalıdır gibi lamelleri daldırma, tercih edilir), daha sonra bu oda sıcaklığında 3% paraformaldehit ile inkübasyon gibi standart bir cep fiksasyon yöntemi kullanın. 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra,% 3 paraformaldehid çıkarılmalı ve lamelleri 1 x PBS ile dikkatle 3 kez yıkandı. Lamelleri sabit bir buzdolabında saklanır. <ol start="4"><li> Bir ışık mikroskobu kullanarak, tek bir hareketli hücre (: Kesinlikle soruşturma altında hücre türüne bağlı olarak değişir hücresel parçalarının fotoğraflarını çekmek için kullanılan büyütme Not) tarafından oluşturulan parça görüntüleri yakalayabilir. Koloidal altın kaplanmış lameller üzerine olmayan hareketsiz ve hareketli hücreler tarafından oluşturulan hücre parçaları örnek olarak Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol> Not: phagokinetic parça motilite ölçüm içinde kullanılabilir boyutu nanoparçacıkların hücre 30 için tamamen toksik olduğu tespit edilmiştir. Gerekirse, Incelenen hücre canlılığı tripan mavisi ile boyanarak değerlendirildi veya hücresel canlılığı diğer belirteçleri için incelenebilir. Bir bu adımı taahhüt gerekiyorsa, dikkate sabitleme vb fiksasyonu, türü için ihtiyaç almak zorunda kalacak. <ol start="5"><li> Böyle ImageJ yazılımı (olarak serbestçe kullanılabilir yazılım kullanma <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) veya NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> geliştirilen), hem Ulusal Sağlık Enstitüleri, veya ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html</a> ) San Antonio, Texas Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından temizlenmiş, kolloidal altın ortalama alanı (keyfi birimler olarak) Üniversitesi&#39;nde geliştirilen 10-20 veya daha fazla hücre (örnek başına) çekilen görüntülerin her deneysel kol için belirlenir. İstatistikler ardından t yapılabilirO sonuçlar toplanır. Örneğin, sonuçlar gelir olarak çizilebilir ± örnekler arasında istatistiksel anlamlılık ölçütü olarak kullanılan Student t yapılan testler ve bir P değeri &lt;0.05 olan (SEM) ve standart hataları. Şekil 3 ve 4 gösteri adımları hücre tarafından temizlenir koloidal altın alan analizi. </li></ol>

<ol>
	<li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+cell+motility+during+embryogenesis.">The control of cell motility during embryogenesis.</a> Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+traffic+to+tune+T+cell+responses.">Stop and go traffic to tune T cell responses.</a> Immunity. 21, 305-314 (2004).</li><li>Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+repair:+from+wound+healing+to+fibrosis.">Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).</li><li>Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+proteins+in+migration+and+invasion.">Polarity proteins in migration and invasion.</a> Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).</li><li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion:+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension.">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li><li>Mitchison, T. J., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+cell+motility+and+cell+locomotion.">Actin-based cell motility and cell locomotion.</a> Cell. 84, 371-379 (1996).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112, 453-465 (2003).</li><li>Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+membrane+flow+and+the+cytoskeleton+to+cooperate+in+moving+cells.">Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells.</a> Cell. 87, 601-606 (1996).</li><li>Albrecht-Buehler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagokinetic+tracks+of+3T3+cells.">The phagokinetic tracks of 3T3 cells.</a> Cell. 11, 395-404 (1977).</li><li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+induces+monocyte+differentiation+and+migration+as+a+strategy+for+dissemination+and+persistence.">Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence.</a> J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).</li><li>Palmisano, R., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Metalloproteinase+Protocols.">Matrix Metalloproteinase Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXD3-Overexpression+Increases+Integrin+Alpha+V+Beta+3+Expression+and+Deprives+E-Cadherin+while+It+Enhances+Cell+Motility+in+A549+Cells.">HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).</li><li>Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+chemotactic+motility+and+trans-endothelial+migration+of+human+neutrophils+by+sphingosine+1-phosphate.">Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate.</a> FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).</li><li>Kawamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+and+WAVE2+acting+downstream+of+phosphatidylinositol+3-kinase+are+required+for+myogenic+cell+migration+induced+by+hepatocyte+growth+factor.">N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor.</a> J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).</li><li>Ando, Y., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+and+insulin-like+growth+factor+I+enhance+keratinocyte+migration.">Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).</li><li>Todt, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha+on+human+trophoblast+cell+adhesion+and+motility.">Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility.</a> Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).</li><li>McAuslan, B. R., Reilly, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+phagokinesis+in+response+to+specific+metal+ions.">Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions.</a> Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).</li><li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCMV+activates+PI(3)K+in+monocytes+and+promotes+monocyte+motility+and+transendothelial+migration+in+a+PI(3)K-dependent+manner.">HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner.</a> J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).</li><li>Smith, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+phosphatidylinositol+3-kinase+and+NF-kappaB+in+human+cytomegalovirus-mediated+monocyte+diapedesis+and+adhesion:+strategy+for+viral+persistence.">Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence.</a> J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).</li><li>Bentz, G. L., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CMV+infection+of+endothelial+cells+induces+an+angiogenic+response+through+viral+binding+to+EGF+receptor+and+beta1+and+beta3+integrins.">Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).</li><li>Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+EGFR+on+monocytes+is+required+for+human+cytomegalovirus+entry+and+mediates+cellular+motility.">Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).</li><li>Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCMV-Regulated+Paxillin+in+Monocytes+Links+Cellular+Pathogenic+Motility+to+the+Process+of+Viral+Entry.">HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry.</a> J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).</li><li>Turkevich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+nucleation+and+growth+processes+in+the+synthesis+of+colloidal+gold.">A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold.</a> Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).</li><li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+and+sol+stability+in+mental+colloids.">Particle size and sol stability in mental colloids.</a> Colloid &#38; Polymer Science. 250, 736-741 (1972).</li><li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+nucleation+for+the+regulation+of+the+particle+size+in+monodisperse+gold+suspensions.">Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions.</a> Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).</li><li>Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+capillary+endothelial+cell+migration.">Assay of capillary endothelial cell migration.</a> Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).</li><li>Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+the+production+of+gold+colloid+monolayers+for+use+in+the+phagokinetic+track+assay+for+cell+motility.">Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility.</a> Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).</li><li>Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+blood+monocyte:+two+subpopulations+with+different+sizes,+phenotypes+and+functions.">Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions.</a> Immunology. 77, 298-303 (1992).</li><li>Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+behavior+screen:+identification,+sorting,+and+enrichment+of+cells+based+on+motility.">A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility.</a> BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).</li><li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+cytotoxicity+of+gold+nanoparticles.">Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles.</a> Small. 3, 1941-1949 (2007).</li><li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-healing+assay.">Wound-healing assay.</a> Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Brooks, D. M., Brooks, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Invasion+Assay+Using+Matrigel(R).">In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R).</a> Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).</li><li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway.">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li><li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo.">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu makalede sunulan phagokinetic parça motilite tayini hücre göçü kantitatif analiz için basit ve son derece etkili bir yöntemdir. Birden fazla hücre tipleri 9-17 analiz edilebilir, çünkü bu yöntem farklı disiplinlerde potansiyeline geniş bir kullanıma sahiptir. Koloidal altın kaplı cam lameller kullanımı, bir hareket eden bir hücre ile temizlenmiş bir izi alanı ölçümü sağlar. Test hücresi motilitesi üzerine (ECM ligandlar, virüsler, bakteriler saflaştırılmış yani b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Cam lameller (15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> Jelatin 300 Bloom </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrakloro Asit Trihidrat </td><td> Fisher Kimyasal </td><td> G54-1 </td><td> 14.5 mM (nihai bir çalışma çözeltisi) </td></tr><tr><td> Sodyum Sitrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP327-500 </td><td> % 0.5 (bir son çalışma çözeltisi) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> O4042 </td><td> % 3 (nihai çalışma çözeltisi) </td></tr><tr><td> 100 mm Doku Kültürü Bulaşık </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802 </td><td></td></tr><tr><td> 12-Peki Tabaklar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Peki Tabaklar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Techne Fırın Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> Standart laboratuvar fırın yeterli olacaktır </td></tr><tr><td> 10 ml Serolojik Pipetler </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Aid Dolgu / Dispenser </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 Tek Kanal Manuel Pipet </td><td> Rainin </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ml Bariyer ipuçları </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ yazılım </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>p :/ / rsb.info.nih.gov / ij / </td><td></td><td> Lisans: Public Domain </td></tr><tr><td> Bir photometrics CoolSNAPfx Nikon Eclipse TE300 12-bit CCD kamera monokrom </td><td> Nikon </td><td></td><td> Durduruldu; en karşılaştırılabilir şartname Nikon Eclipse Ti sahiptir, ancak alt uç Nikon 80i de uygun olacaktır. Diğer markalar da karşılaştırılabilir mikroskoplar sağlamak. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Not: Aşağıda listelenen reaktifler ve ekipman bizim çeşitli çalışmalarda bize tarafından kullanılmıştır. Diğer malzemeleri, tedarikçi, reaktifler ve ekipman sürece onlar benzer özelliklere sahip olarak, kullanılabilir. </td></tr></tbody></table>

a quantitative evaluation of cell migration by the phagokinetic track motility assay

Hücresel motilite tek hücreli ve çok hücreli canlılar için önemli bir biyolojik süreçtir. Bu besinlerin veya uzak uygun koşulların yanı sıra doku gelişimi, bağışıklık gözetim ve yara iyileşmesi için çok hücreli organizmalarda olduğu gibi, sadece birkaç rolleri 1,2,3 söz kaynağı doğru tek hücreli organizmaların hareketi için gereklidir. Bu işlemin önemli Deregülasyon, nörolojik kardiyovasküler ve immünolojik hastalıkların yanı sıra, şiddetlenir tümör oluşumuna yol açan ve 4,5 yayılabilir. Moleküler, aktin polimerizasyonu ve reseptör geri dönüşüm hücre 6,7,8 öne hareketini götürmek hücresel uzantıları (lamellipodia), yaratmada önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Ancak, hücre göçü ile ilgili birçok biyolojik sorular yanıtsız kalıyor. Insan sağlığı ve hastalık hücresel hareketlilik açısından merkezi bir rol özgü mec anlamanın önemini vurgularhanisms bu süreç içinde yer alan ve özellikle önemli hücre hareketi değerlendirilmesi için doğru yöntem sağlar. Mikroskop genellikle hücre hareketi görselleştirmek için kullanılır. Ancak, hücre hareketli hücrelerin nicel zaman lapsed filmleri oluşturmak için pahalı kameralar ve yazılım gerektiren bir kaynak-alıcı bir süreç hücre göçü kantitatif ölçümü yapmak, oldukça yavaş hareket ettirin. Bu nedenle, maliyet-etkin olmayan zahmetli ve bu ortak laboratuvar ekipmanı kullanan bir hücre göçü bir kantitatif ölçümü gerçekleştirmek için yeteneği birçok araştırmacı için büyük bir ihtiyaçtır. Phagokinetic parça motilite tayini kolloidal altın kaplamalı cam lamel 9,10 ölçülebilir bir parça oluşturmak için onun yolundan altın parçacıkları temizlemek için hareketli bir hücre yeteneğini kullanır. Serbestçe kullanılabilir yazılım kullanımı ile, birden fazla parçayı istatistiksel gereksinimleri gerçekleştirmek için her tedavi için değerlendirilebilir. Tahlil değerlendirmek için kullanılabilecekBu tür kanser hücrelerinin 11,12, fibroblastlar 9, nötrofiller 13, iskelet kas hücreleri 14, keratinositler 15, trofoblastlar 16, endotel hücreleri 17 ve monositler 10,18-22 gibi birçok hücre tipleri, motilitesi. Protokol sodyum sitrat ile chloroauric asit (Au 3 +) bir azalma ile oluşturulan nanoparçacıkların (Au °) ile kaplanmış slaytlara oluşturulmasını içerir. Bu yöntem, 1951, 23. Turkevich ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve sonra Frens ve diğerleri tarafından 1970 de geliştirilmiştir. 24,25. Bu kimyasal indirgeme aşamasının bir sonucu olarak, altın parçacıkları (çap: 10-20 nm), tepkime karışımından, çökelti ve hücre göçü analiz 9,26,27 kullanıma hazır sonra cam lameller üzerine tatbik edilebilir. Genel olarak, phagokinetic parça motilite hücresel tahlil motilite hızlı, basit ve kantitatif ölçüsüdür. Buna ek olarak,Zaman lapsed görüntüleme, hem de, araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak başka kullanım için müsait olmayan hücre tipleri ile birlikte kullanım için, basit bir yüksek hacimli tahlil olarak kullanılabilir. Birlikte, kantitatif pahalı mikroskoplar ve yazılıma gerek olmadan birden fazla hücre tipleri hücresel motilite ölçme yeteneği, ortak laboratuvar ekipman ve kimyasalların kullanımı ile birlikte, hücresel anlamada phagokinetic parça motilite tayini ile ilgilenen bilim adamları için sağlam bir seçim yapmak motilite.

Gösterilen tek bir hücre (bizim deneyler bir monosit Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir) tarafından temizlenir bir izi alanı gösteren bir ışık mikroskobu altında alınan resimlerin bir örnektir. Non-motil hücrelerin karakteristik küçük, oval veya bu uyarılmamış hücreleri (Şekil 2A ve 2B) için hareket düşük bazal seviyesini gösteren kendi etrafında daire şeklinde yolları oluşturmak. Bunun aksine, yüksek derecede hareketli hücreler [Sistemimiz...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay at JoVE.com

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Phagokinetic motilite parça tahlil hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, tahlil, bir nicel bir şekilde, zaman içinde chemokinesis (rastgele hücre hareketliliğinin) ölçer. Tahlil, koloidal altın kaplama lameller üzerine onların hareket ölçülebilir bir parça oluşturmak için hücrelerinin yeteneği yararlanır.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

a-quantitative-evaluation-cell-migration-phagokinetic-track-motility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K Görüntüleme.  Louisiana State University Health Sciences Center. Phagokinetic motilite parça tahlil hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, tahlil, bir nicel bir şekilde, zaman içinde chemokinesis (rastgele hücre hareketliliğinin) ölçer. Tahlil, koloidal altın kaplama lameller üzerine onların hareket ölçülebilir bir parça oluşturmak için hücrelerinin yeteneği yararlanır.

Video: A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Akış Sitometri Yaralı Omurilik Doku Bağışıklık Hücreleri Kantitatif Değerlendirilmesi: Hücre Arıtma Yöntemi Roman kullanın

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Kullanarak İzleme Dendritik Hücre Göç<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Manyetik Rezonans Görüntüleme

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...