Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen R01-DK080752 ve P50-DK064540 verir. Biz bu tahlili kurarak onun çabaları J. Loughman teşekkür ederim.

1.. 5637 Mesane Epitel hücrelerinin kültür Laminer akış doku kültürü kaputu UV radyasyonu ile hazırlanmış ve% 70 etanol ile sildi aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) [adlandırılır RPMI +] ihtiva eden RPMI-1640 ortamı hazırlayın, filtre, su banyosu içinde bir 0.22 um gözenek boyutlu filtre kullanılarak sterilize ve sıcak 37 ° C. </li><li> 5637 hücre cryovial çözülme (American Type Culture Collection HTB-9, mesane karsinomu türetilmiş), 37 ° C su banyosu içinde. Hızla 20 ml RPMI + ihtiva eden bir 75 cm 2 doku kültürü şişesine çözülmüş hücreleri aktarın. </li><li> Hücreler, yaklaşık% 95 konfluent (kap basma-6 x 10 6 hücre), yaklaşık 4 gün kadar,% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de inkübe edin, şişeyi. </li><li> 5637 hücreleri altkültürü için: <ol><li> Şişeden gelen orta çıkarın. 10 ml Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin ile hücrelerin yıkayınOda sıcaklığında e (DPBS). </li><li> 6 ml ılık (37 ° C),% 0.05 tripsin, şişeye% 0.02 EDTA çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile bir 15 ml konik bir tüp ve pelet hücreleri aktarın. Tripsin / EDTA çözeltisi çıkarın. </li><li> 20 ml RPMI + içeren yeni bir 75 cm 2 şişeye 6 ml RPMI + (10 6 hücre / ml), ve transfer 1 ml (10 6 hücre) &#39;de tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol></li><li> Hücreler% 95 izdiham ulaştığınızda her 4 gün hücrelerini altkültürü için adım 1.4 tekrarlayın ya. </li></ol> 2. Geçirgen Desteklenmesi Hakkındaki 5637 Hücreler tohumlama ve Yetiştirme Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. En iyi sonuçlar için, az 10 altkültürler uğramıştır 5637 hücreleri kullanır. <ol><li> Steril forseps kullanılarak, steril bir 25 mm derin doku kültürü çanağı içinde geçirgen destek ters. </li><li&gt; 1.4.1-1.4.3 aşamalara göre% 95 birleştiği noktada 5637 hücre, 75 cm 2 şişe tripsinize edin. </li><li> 1000 ul pipet kullanarak, yumuşak bir hemositometre kullanılarak bir hücre sayımı ile belirlenir 3 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar ~ 2 ml RPMI + hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Membran dokunmadan her geçirgen destek hücre süspansiyonu (1.5 x 10 5 hücre) 50 ul uygulanır. Tabağına yerleştirin kapağı ve dikkatli bir şekilde en fazla 16 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de çanak yerleştirin. </li><li> Oyuk başına 0.6 ml RPMI + ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içine steril forseps sağ geçirgen destek kullanılması. Her bir geçirgen desteğin üst haznesine 0.1 ml RPMI + ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Her 2 günde bir ortam değiştirin. First, aspirat alt rezervuar ardından üst hazneden orta ve alt hazne (0.6 mi), ters sırayla taze RPMI + uygulamak ve daha sonra üst reservoir (0.1 ml). </li><li> Yedi gün 5637 hücreleri ile geçirgen destek tohumlama sonra, hücrelerin izdiham değerlendirmek. RPMI + (~ 0.35 mi) ile üst doldurun. Orta üst ve alt kapları arasındaki dengeye etmez, hücreler yeterince birleşmiş olan. </li></ol> 3. Bakteriyel inokulum hazırlanması <ol><li> Aseptik teknik kullanılarak, bir kap ile bir 250 ml şişeye uygun bir kültür et suyu ile 20 ml ekleyin. E. Luria-Bertani (LB) suyu kullanın coli kültürleri ve uygun olduğunda suyu için antibiyotik ekleyin. </li><li> Steril bir aşılama döngü kullanılarak, bir gliserol stokundan bakteri ya da bir çizgi plaka ile suyu inoküle. UPEC suşlar için, (tip 1 pili üretimini teşvik etmek için) çalkalama olmaksızın, yaklaşık olarak 16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe bakteri kültürü. </li><li> Bir santrifüj tüpüne bakteri kültürü aktarın. 10 dakika boyunca 8000 x g&#39;de santrifüj ile bakteriler Pelet. </li><li> Süpernatant süzünVe ~ 10 9 CFU / ml &#39;ye eşdeğer, = 1.000 OD 600 için PBS içinde tekrar süspansiyon bakteri. <ol><li> Isı ile öldürülmüş bakteriyel uyarıcı oluşturmak için, bir kısım 30 dakika boyunca 55 ° C &#39;de yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteri (150 ul, örneğin 1.5 x 10 ~ 8 CFU) inkübe edilir. Bakteriyel ölüm onaylamak için ısı ile öldürülmüş süspansiyonu bir kısım Plate. </li></ol></li><li> Kullanımdan hemen önce, yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteriler (canlı ya da ısıyla öldürülmüş) 10 kat sıcak serum içermeyen RPMI 8 CFU / ml 10 için bir mikro tüp içerisinde [RPMI-adlandırılır] seyreltin. </li></ol> 4. Periferik Kan İnsan nötrofilleri İzolasyonu Yetişkin gönüllülerin kan toplanması ileri inceleme ve kurumsal inceleme kurulu onayı gerektirir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve düzgün bir insan kanına maruz kalmaktan kaçınmak için tehlikeli madde atmayın. <ol><li> Sağlıklı yetişkin v venöz kan yaklaşık 25 miolunteer phlebotomy eğitimli personel tarafından 3 steril sodyum heparin içeren kan toplama tüpleri içine çekilmelidir. <ol><li> Sıkıca dirsek üstü, üst kol etrafında bir lastik turnike sarın. </li><li> Steril% 70 alkol silin kullanarak giriş siteyi, Antekübital fossayı dezenfekte edin. </li><li> Kanatlı bir kelebek iğne sistemine bir plastik tüp tutucu takın. </li><li> Yukarı bakacak şekilde 30 ° açı veya daha az, eğimin bir antekubital damara iğne takın. Kan bir hamle plastik boru göründüğünde iğne damarı delinmiş. </li><li> Plastik tüp yuvasına bir kan toplama tüpü yerleştirin. Ilk koleksiyonu tüp dolu olduğunda, ikinci toplama tüpü ile değiştirin. Üçüncü boru ile tekrarlayın. </li><li> Üçüncü toplama tüp, yaklaşık yarısı dolduğunda, turnike çıkarın. </li><li> Steril bir pamuk ile delinme siteyi örtün ve yavaş yavaş damardan iğneyi. İğne ve yer i üzerinde koruyucu kalkan kaydırınna biohazard konteyner diyez. </li><li> Ponksiyon basınç uygulayın. Yapışkan bandaj ile delinme site ve pamuk örtün. </li><li> Yavaşça heparin dağıtmak için kan toplama tüpleri ters. </li></ol></li></ol> Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. <ol start="2"><li> 10 ml bir pipet kullanarak, yumuşak bir taze, steril bir 50 ml konik bir tüp için kan aktarın. % 3 eşdeğer bir hacim (a / h) dekstran% 0.9 NaCI ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. 20 dakika boyunca, oda sıcaklığında dik olarak tüp inkübe edin. </li><li> Alt katmanı bozmadan, dikkatle üst tabakası aspire ve yeni bir 50 ml konik tüp transfer. 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile Pelet hücreleri. Süpernatant atın. </li><li> Kan tekrar başlangıç ​​hacmine eşit% 0.9 NaCI hacminde hücre pelletini. </li><li> Hücre süspansiyonu, p altında yoğunluk santrifüj çözeltisi 10 ml Katmanİki faz arasındaki arayüz ayırma. Hiçbir frenli 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj. Süpernatant atın. </li><li> Arta kalan kırmızı kan hücreleri lize etmek için, 10 ml soğuk% 0.2 NaCl&#39;de hücre pelletini. 30 saniye boyunca inkübe ve sonra derhal izotonikliğe yeniden 10 ml soğuk% 1.6 NaCI ekleyin. </li><li> 6 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile Pelet hücreleri. Süpernatant atın. </li><li> Hücre topağı, kırmızı kan hücrelerinin lize, tipik olarak 3 tur arındırılmış olması görünene kadar yineleyin 4,6-4,7 adımları tekrarlayın. </li><li> 1000 ul pipet kullanarak, in, hücre pelletini, öncelikle PMN tekrar süspansiyon sıcak (37 ° C) RPMI-hücre bir hemasitometre kullanılarak saymak suretiyle belirlendi 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda,. Kullanılana kadar 37 ° C&#39;de hücreleri tutun. Sırasıyla, boyandıktan sonra, nükleer morfoloji tripan mavi dışlama ve görselleştirme ile değerlendirilen Tipik olarak, PMN canlılığı ve saflık&gt;% 99 bulunmaktadır. </li></ol> 5. Transuroepithelial Nötrofil Göç gibidemek Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. Adım 2.7 &#39;de tespit edildiği üzere, birleşik 5637 hücre katmanları taşıyan sadece geçirgen destek kullanın. Ihtiva eden 24 oyuklu plakalar RPMI-olabilir, önceden hazırlanmış ve% 5 CO2, kullanıma kadar 37 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. <ol><li> Kısım 1, 24 oyuklu plakada oyuk başına RPMI-ısınmaya ml; geçirgen destek başına 3 kuyu hazırlar. </li><li> Geçirgen desteklerin üst ve alt haznelerden ortam aspire. </li><li> Steril forseps kullanılarak, aşama 5.1 &#39;de hazırlanan 24 plaka için geçirgen destek aktarın. Kuyudan kuyuya destekleri aktararak geçirgen özelliği destekleyip üç kez yıkayın. </li><li> Bakteriyel inokulum kullanılacak ise, steril bir 25 mm derin doku kültürü çanağı içinde geçirgen destek ters. Bir kimyasal çekicidir (örneğin, N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) ya da IL-8) kullanılacak ise, 5.6 adıma geçin. </li><li> Canlı veya öldürülen Bact ile deneyler içinerial uyarı, 60 ul RPMI-(sahte enfeksiyon) veya bakteriyel aşı aşama 3.5 de hazırlanan (6 x 10 6 CFU) ile her bir geçirgen destek apikal yan inoküle. Tabağına yerleştirin ve kapağı, 1 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> , 24 oyuklu, düşük bağlanma plakasına oyuk RPMI-başına 0,6 ml ilave et; geçirgen destek oyuk başına 1 hazırlar. RPMI-to PMN girişi numaralandırmak 0.5 ml içeren 3 kuyu hazırlayın. <ol><li> Bir kimyasal çekicidir bakterilerin yerine kullanılıyorsa, aşama 5.6 &#39;de hazırlanan 24 oyuklu plaka RPMI-in 0.6 ml kemoatraktan ekleyin. </li></ol></li><li> 24-iyi düşük eki plaka içine doğru geçirgen destekler. </li><li> Her bir geçirgen desteğin üst haznesine (bazolateral taraf), aşama 4.9 de hazırlanan 0.1 ml PMN (10 6 PMN) ekleyin. Doğrudan 500 ul ihtiva eden gözlere 100 ul RPMI-PMN ekleyin. 1 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Steril forseps kullanarak, hafifçe kazıyınKuyunun kenarına karşı geçirgen destek zar apikal taraftan ek PMN kaldırmak ve daha sonra desteğin imha etmek. </li><li> Yavaşça 1000 ul pipet ucu ile de her bir alt kazıma ile PMN toplayın ve mikrofüj tüpler için PMN süspansiyonlar aktarın. </li><li> Hemasitometre kullanarak PMN Enumerate. </li><li> Alt haznede PMN toplam sayısını hesaplamak için, 6000 1 mm 2&#39;de PMN sayısı (100 nl) çarpın. PMN sayısı 10 6 giriş PMN normalize gibi veri girişi PMN bir yüzdesi olarak belirtilir, ya da olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+chamber+in+chemotaxis.">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li><li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration:+implications+in+mediating+epithelial+injury.">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li><li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+migration+of+neutrophils:+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury.">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria.">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li><li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration.">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection.">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li><li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection.">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li><li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li><li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase.">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li><li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration.">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kültürlü bir mesane epitel hücre çizgisi ve yeni izole edilmiş insan PMN kullanarak, transuroepithelial nötrofil göçü bir in vitro bir model oluşturduk. Bu model idrar yolu enfeksiyonu (İYE) sırasında doğal immün yanıt, tipik UPEC 9 nedeniyle son derece yaygın bir bakteriyel enfeksiyon karmaşıklığı incelemek başlayan vesile olmuştur. Mesane ya da sistit enfeksiyon esnasında, mesane lümenine PMN işe bakteri açıklık 10 için gereklidir. Bir enflamatuar yanıtı...

Vücuttaki hücrelerin hareketi, çoğunlukla uzun mesafeler boyunca, büyüme ve gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi için gereklidir. Hücre göç karmaşık ve sinyal iletim ve sitoskeletal bileşenlerinin yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok farklı süreçlerin koordinasyonunu gerektirir. Hücreler tanımlanmış kimyasal geçişlerini (kemotaksı) doğru rastgele (kemokinezinin) hareket olarak yapabilirsiniz. Birçok teknik in vitro hücre göçü incelemek için geliştirilmiştir. En eski ve en yaygın teknik, Boyden haznesi, bir kemo-çekici maddenin alt bölmeye ve ilgi hücrelerinde yerleştirilen dikey iki odacıklı sistem oluşur, üst bölmede 1 yerleştirilir. Iki bölmeyi ayıran tanımlanan boyutta gözenekleri olan geçirgen filtre boyunca hücrelerin hareketi izlenir. Ek teknikler arasında Zigmond odası 2 ve Dunn odası da dahil olmak üzere, hücre göçü araştırmak için geliştirilmiştir3. Bu toplu yaklaşımlar çok farklı hücre tiplerinin hareketine önemli bakış açısı vermiştir. Kemokinezinin ve kemotaksi temel ilkelerini sorgulama ek olarak, iki odacık tahlilleri hücre dışı matris bileşenleri ve hem de endotelyal ve epitel hücre katmanları üzerinden hücre göçü soruşturma kolaylaştırmıştır. Diğer teknikler üzerinden iki oda sistemlerinin kullanılmasının bir avantajı, gözenekli membranı, kolajen ya da fibrinojen gibi proteinler ile kaplanabilir, ve hücre dışı matris-benzeri bariyer boyunca hücre göçü değerlendirilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, kültürlenmiş hücre soyları yetiştirildi ve geçirgen destekler üzerinde farklı olabilir. Endotelyal hücre engeli boyunca hareketini araştırmak için, kültürlenmiş endotelyal hücreleri, geçirgen desteğin üst haznesinde tohumlanır ve büyütülür. Gibi bağışıklık hücreleri gibi hareketli hücreler, en karşısındaki alt rezervuara üst hazne ve göç eklenirfizyolojik apikal-to-bazolateral yönünde endotel bariyer görülmektedir. Bu model kan akışı bağışıklık hücrelerinin ekstravazasyonunu anlamada çok değerli olmuştur. Göç endotel aksine, bir epitel bariyerinden hücrelerinin hareketi tipik olarak bazolateral-apikal yönünde meydana gelir. In vitro olarak, bu etkinlik modellemek amacıyla, araştırmacılar, tohum ve geçirgen desteklerin alt kültürlenmiş epitelyum hücreleri büyür. Hareketli hücrelerin bazolateral-apikal yönü temsil eden epitelyal bariyer boyunca üst hazne ve göç, ilave edilir, izlenir. Transepitelyal göç tür modeller belirgin mukozal yüzeylerinde inflamatuar yanıtlar, özellikle akciğer olanlar ve 4,5 gut anlayışımıza katkıda bulunmuştur. Bunun aksine, idrar yolu epitel boyunca bağışıklık hücresi ticareti daha az dikkat çekmiştir. Bizim understandi ilerletmek içinbir mesane epitelyal bariyer 6 boyunca hareket, (nötrofil PMN) ng üropatojenik Escherichia coli (UPEC) ile enfeksiyon sırasında idrar yollarında doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin nedeniyle, polimorfonükleer lökosit, inceleme sağlayan bir in vitro tahlil, transuroepithelial nötrofil göçü deneyi geliştirilmiştir -8. Transepitelyal göç diğer iki odacıklı modellerinde olduğu gibi, kültürlenmiş insan mesane epitel hücreleri, geçirgen desteğin alt büyüdü ve birleşik epitel tabakalar oluştururlar. Toplardamar kanından izole İnsan nötrofilleri, epitel tabakanın bazolateral tarafına uygulanır ve fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönünde epitel boyunca göç E farklı suşları ile enfeksiyona yanıt olarak ölçülür E. coli ya da kemo-çekici moleküllerinin varlığı. Pek çok araştırma ek hücre tiplerinin yokluğunda, nötrofil hareketi kemokinezinin ve kemotaksis hem odaklı vardı. Bu hesaba enfeksiyon sırasında mesane epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki karmaşık etkileşimler alır gibi transuroepithelial nötrofil göçü deneyi avantajlıdır. Bu uysal in vitro model epitelyal yüzeylerde bağışıklık tepkilerinin ayrıntılı bir araştırma izin vermek için potansiyele sahiptir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

Enflamasyon siteye periferiden bağışıklık hücrelerinin işe herhangi mukozal yüzeyde doğal immün yanıtta önemli bir adımdır. Mesane enfeksiyonu sırasında, polimorfonükleer lökosit (PMN, nötrofiller) kan göç ve mesane epitel dolaşırlar. Nötrofilik yanıt yokluğunda enfeksiyonu gidermek için başarısızlık mesane savunma PMN önemini göstermektedir. Kesesi epitelinin üropatojenik Escherichia coli (UPEC) kolonizasyonunu kolaylaştırmak için, idrar yolu enfeksiyonları (İYE) çoğunluğunun neden olan madde, kısmen tanımlanan çeşitli mekanizmalar kullanılarak akut bir enflamatuar yanıtı ıslatın. Bundan başka ev sahibi ve bakteriyel patojen arasındaki etkileşimi incelemek için, UPEC için tabii immun cevabın bu yönünün bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyinde, Boyden odasının bir varyasyon, kültürlü mesane epithElial hücreler, geçirgen desteğin alt akmak üzere yetiştirilmektedirler. PMN İnsan toplardamar kanından izole edilir ve mesane epitel hücre katmanlarının bazolateral tarafına uygulanır. Bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici moleküllere yanıt olarak, fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönü temsil eden PMN geçişi, bir hemositometre kullanılarak numaralandırılmış. Bu model UPEC ve ökaryotik hücreler arası etkileşimleri incelemek için hem de PMN mesane epitel geçişi için moleküler şartları sorgulamak için kullanılabilir. Transuroepithelial nötrofil göçü modeli mesane UPEC için başlangıçtaki inflamatuar cevabın anlayışımızı ilerletmek olacaktır.

Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, çeşitli uyaranlara (Şekil 1B) karşılık olarak kültürlenmiş mesane epitel hücre tabakası boyunca insan PMN göç kantitatif bir değerlendirmesini sağlar. Protokol basit iken, PMN göçünü etkilemeye ve sonuç olarak bu tahlilin tekrarlanabilirliğini etkileyen değişkenler vardır. Teknik ve biyolojik çoğaltır arasındaki değişkenliği azaltmak için geçirgen destek ve PMN hazırlarken önlemler alınmalıdır. Örneğin, yeterli bir birl...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium at JoVE.com

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Biz üropatojenik Escherichia coli ile mesane enfeksiyonu sırasında akut inflamatuar yanıtın önemli bir bileşeni taklit eden bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici maddelere cevap olarak, geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiştir, mesane epiteli üzerinde insan nötrofil göçü kantitatif bir değerlendirmesini sağlar.

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine.  Biz üropatojenik Escherichia coli ile mesane enfeksiyonu sırasında akut inflamatuar yanıtın önemli bir bileşeni taklit eden bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici maddelere cevap olarak, geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiştir, mesane epiteli üzerinde insan nötrofil göçü kantitatif bir değerlendirmesini sağlar. 

Video: Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI&#39;nin Gelişimi ve Kimlik<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro