Biz Rebecca Nishi, MS, ve hayvan cerrahi yardım UC Irvine Christopher ve Dana Reeve Vakfı Hayvan Çekirdek Tesis teknisyenleri teşekkür ederim. Ayrıca, teknik yardım, el yazması ve video çekimi hazırlıkları ve animasyon Gabriella Funes, Usha Nekanti ve Denisse Moreno teşekkür ederim. Bu araştırma, NINDS (AJA RO1 NS43428-01), Amerika Felç Projesi (PPA-32.574 - HXN için) ve California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) Kök Hücre Eğitim Ödülü HXN T1-00008 tarafından desteklenmiştir. KDB UC Irvine (T32 NS007444) moleküler ve hücresel nörobilim eğitim programı tarafından desteklenmiştir.

1. Omurilik dokusunda Fototerapisi <ol><li> Spinal kord segmentleri yaralı olmayan yaralı ya da spinal kord kontüzyonu T8-T10 (T9 az yaralanma) Sprague Dawley rat disseke ve oda sıcaklığında HBSS ince makas mekanik olarak ayrışmış, önceden 1 tarif. Doku disosiasyon öncesinde, bütün omurilik sütunları kord segmentleri T8-T10 ekstraksiyon önce 5 dakika boyunca kuru buz üzerinde tutuldu. </li><li> Doku bit santrifüj (1 dakika, 1000 rpm, oda sıcaklığında) ve 2.5 mg tripsin ve 20 dakika boyunca 37 az 5 ml DME (Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Kullanıcı medya) 5 mg kollajenaz ° öğütme önce C (enzimatik ayrışmış tarafından alınan edildi ~ 10 kez oda sıcaklığında) bir cam Pasteur pipeti (9-inç). </li><li> DME +% 10 fetal sığır serumu 10 ml enzim faaliyetlerinin engellenmesi ve ardından 40 mikron hücre süzgecinden geçirilerek süzülür hücrelere eklendi. Hızlı bir spin sonra, hücre pelletini HBSS 6 ml yeniden süspanse edildi ve OptiPrep degrade çözümleri aşağıda açıklanan üzerine yerleştirilmiştir. </li></ol> 2. OptiPrep degrade çözümler oluşturma <ol><li> Seyreltilmiş OptiPrep OptiPrep 01:01 MOPS Buffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS pH 7.4) ile seyreltilmesi ile inşa edilmiştir. </li><li> Dört OptiPrep degrade çözümleri karıştırma 350, 250, 200 veya 150 ul seyreltilmiş OptiPrep son hacmi 1 ml (Tablo 1) HBSS tarafından yapılmıştır. </li><li> Dört çözüm yavaş ve dikkatli altındaki en seyreltik ve en üst (Şekil 1A) seyreltilmiş bir 15 ml konik tüp katmanları yerleştirildi. </li></ol> 3. Hücrelerin lipid / miyelin enkaz ayırmak <ol><li> 6 ml HBSS ayrışmış spinal hücrelerinin OptiPrep degrade çözümleri üstüne dikkatlice katmanlı oldu. </li><li> Tüp içeren hücreler ve degrade çözümler lipid farklı katmanları içine hücre çözümü ayıran bir salıncak kova rotor (A-4-62) ile bir Eppendorf Centrifuge 5810R kullanarak santrifüj edildi (1900 rpm veya 726 RCF, 15 dakika, 20 ° C) / pelet inflamatuar hücreler, glia, ve kırmızı kan hücreleri nöronların 3 kat, takip miyelin enkaz (üst 7 ml tüp). Bazı büyük ölçekli aktive makrofajlar, monositler, makrofajlar, PMN granülositler ve lenfositler de dahil olmak üzere pek çok inflamatuvar hücreler, pelet bulundu rağmen, pelet yukarıda katmanlar halinde tespit edilemedi. </li><li> Lipid / miyelin enkaz tabakası (üst 7 ml) aspire kaldırıldı. Hücreler daha sonra yıkanır ve 2.5 ml HBSS yeniden bekletildi ve aşağıda immunolabeling için kullanılır. </li></ol> 4. Flow sitometri için spesifik bağışıklık hücrelerinin Immunolabeling <ol><li> Omurilik hazırlıkları toplanan Hücreler (500 ul) pelet ve kırmızı kan hücreleri lyse için 5 dakika için 0.85% amonyum klorür (distile su ile seyreltilmiş) yeniden süspanse. </li><li> Hücreler 500 ul HBSS ile yıkanmalı ve daha sonra, oda sıcaklığında, normal tavşan ya da fare serumu 30 dakika süreyle bloke edildi. </li><li> Ya da sulandırılmış izotip IgG çözüm Hücreler 1 antikoru ile saat (; Fare anti-sıçan ED1 Alexa 488, Serotec veya Fare anti-sıçan CD3 Alexa 488 Tavşan anti-PMN FITC, Doğru Kimyasal ve Bilimsel) yıkanmış ve oda sıcaklığında inkübe HBSS (1:100 dilüsyon), daha önce 1 nitelendirdi. </li><li> Hücreler 300 ul HBSS son adım sonra yeniden süspanse her adımdan sonra yukarıda ve daha sonra iki kez yıkandı. </li></ol> 5. Flow sitometri ile hücre nicel değerlendirmesi <ol><li> Hücre Görev yazılımı kullanarak bir FACS Calibur (Becton-Dickinson) akış sitometresinin Numuneler analiz edildi. Örnek başına 5.000 etkinlik örnekleri için okuma ve veri analizi Zirvesi (DakoCytomation) ile tamamlanmıştır. </li><li> Flow sitometrik kapıları,, daha önce 1 açıklandığı gibi zaman noktaları arasında normalleşme için temel değerlerini ayarlamak için kontrol IgG izotip etiketli hücreleri veya yaralanmamış bir şekilde kontrol hayvanlardan omurilik hücreleri kullanılarak ayarlanır . Olumlu etiketli hücrelerin ortalama değerleri tüm örneklem yüzde (± SEM) olarak ifade edildi. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: 1 spinal PMN niceleme miyelin enkaz kaldırmak ve flow sitometri ile immün hücre algılama geliştirmek için bir OptiPrep degrade yeteneği değerlendirildi dpi (Şekil 1B), SKY 1-3 sonra PMN infiltrasyonu önceden bildirilen tepe. Alternatif olarak, aynı disseke omurilik miyelin enkaz OptiPrep çıkarmadan enzimatik ayrışmış ve benzer flow sitometri ile PMN infiltrasyonu paralel olarak değerlendirildi. Biz daha önce 1 bildirdin gibi, sağlam miyelin enkaz örneklerinde tespit PMNs&#39;nin yüzdesini gösteren, sadece bir kısmını (% 0.5) tek başına enzimatik disosiasyon göre OptiPrep degrade arıtma yöntemi ile izole edilen örneklerde olayların konumunda bir değişim var . OptiPrep purif tespit PMNs&#39;nin yüzdesi (% 5.1)IED örnekleri (Şekil 1B). Bu veriler doku hazırlıkları miyelin enkaz akım sitometrik okuma belirsiz olduğunu göstermektedir ve bu miyelin enkaz kaldırma yaralı omurilik dokusunda immün hücre algılama hassasiyeti artırır göstermek. Yaralı omurilik hücre tespiti için OptiPrep degrade sisteminin hassasiyeti tespit ettikten sonra, 2 saat ile 180 dpi arasında değişen bir süre içinde hücresel infiltrasyon değişiklikler karakterize ve PMN, makrofajlar dahil SKY sonra hücresel inflamasyon bir roman multifazik yanıt kurdu / mikroglia ve T-hücrelerinin. 1-3 önceki çalışmalar tarafından onaylandıktan sonra, PMN-yaralanma sonrası ilk 2 saat kablosu girdi ve 1 dpi (Şekil 2 &amp; 4) zirve yaptı. Öte yandan 1,4,5 Makrofajlar / mikroglia 3 dpi kadar yaralı spinal kord tespit ve başlangıçta 7 dpi (Şekil 3 ve 4) zirve yaptı değildi. Hayret, biz ilk defa makrofaj / mikroglia doruğa için ikinci kez 60 dpi ve 180 dpi (Şekil 3 ve 4) ile yüksek kaldı göstermektedir. Makrofaj / mikroglia, benzer şekilde T-hücre infiltrasyonu 7 dpi 5-7 zirve tahmin; ancak, flow sitometri, ilk 7 dpi yüksek bir T-hücrelerinin sayısı tespit edildi rağmen, T hücre sayısında herhangi bir değişiklik tespit etmedi 9 dpi (% 1.6) (Şekil 4). T-hücre sayısı 10 dpi, hücrelerin% 4.4 CD3 (Şekil 4) etiketli hangi zaman kalıcı bir T-hücre yanıtı, 180 dpi aracılığıyla gözlendi azalarak iken. Birlikte, bu veriler SKY sonrasında hücresel inflamasyon (Şekil 4) bir zamana bağımlı multifazik tepki göstermek; hücresel inflamasyon ilk aşamalarında dpi ED1, bir tepe + makrofaj / mikroglia 7 dpi ve T tarafından takip PMN 1 erken tepe oluşan edildi hücreleri 9 dpi, daha sonraki aşamalarında, 60 dpi çözünürlükte makrofaj / mikroglia kayda değer bir ikinci zirve, 14 dpi sonra yükselen ve 180 dpi ile ısrar üç hücresel nüfus, oluşmuştu. Bu timecourse flow sitometri tarafından oluşturulan çalışma ve nicel veri immunolabeled omurilik bölüm 1 kantitatif stereology toplanan veriler karşılaştırılabilir sonuçlar gösteren, daha önce onaylandı. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table1.jpg" alt="Tablo 1"/> Tablo 1. Miyelin enkaz kaldırma OptiPrep degrade hazırlanması Dört OptiPrep degrade çözümleri HBSS ve seyreltilmiş OptiPrep (OptiPrep ve MOPS 1:1 dilüsyon) kullanılarak yapılır. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 OptiPrep degrade yoğunlukları ayrı çoğu miyelin / yaralı spinal kord dokuların / hücrelerin flow sitometri ile enkaz ve immün hücre değerlendirmesi geliştirmek. (A) Miyelin / enkaz miyelin / enkaz tabakası aspirasyonu ile takip OptiPrep degrade ile santrifüj sonra ayrışmış omurilik dokusu hücreleri (nöronlar, glia ve bağışıklık hücreleri) ayrıldı. (B) omurilik yaralı PMN numarası, enkaz kaldırma sonra PMN tespit artmış duyarlılık gösteren (Student t-testi, p = 0.0001). N = 5, grup başına ortalama ± SEM, tüm akım sitometrik kapıları yaralanmamış bir şekilde hayvanlardan etiketli hücreleri kullanılarak belirlenmiştir. Örnek başına 5.000 etkinlik örnekleri için okuma ve pozitif işaretli hücrelerin ortalama değerleri tüm örneklem yüzde (± SEM) olarak ifade edildi. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 akış sitometri yaralanan omurilikte PMN infiltrasyonu Algılama. T9 (200 kd) ılımlı bir kontüzyon yaralanma sonrası, PMN hızlı başlayan ve 2 saat (B) post-yaralanma 1 dpi (C) zirve omurilik girdi. Bütün akış sitometrik kapıları yaralanmamış bir şekilde hayvanlar etiketli hücreleri (A) kullanılarak belirlendi. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 flow sitometri yaralı omurilikte makrofaj / mikroglia infiltrasyon tespiti. T9 az bir orta (200 kd) kontüzyon yaralanma sonra ED1 + makrofaj / mikroglia sayısını 3 dpi (D) başlayan, yaralı spinal kord artan 7 dpi (E) akut zirve yaptı, 14 dpi (F) düşük seviyelere gerilemiştir , daha önce ikinci bir 60 dpi (G) zirvesine yükselen ve 180 dpi (H) omurilik yaralı kaldı. 7 dpi spinal hücrelerinin IgG izotip kontrol etiketleme (B) minimal antikor etiketleme arka plan ve 2 saat antikor etiketli hücreleri sonrası yaralı (C) veya yaralanmamış bir şekilde (A) hayvanlar için hiçbir fark gösterdi. Bütün akış sitometrik kapıları, yaralanmamış bir şekilde hayvanlardan etiketli hücreleri kullanarak kuruldu. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table2.jpg" alt="Tablo 2"/> Tablo 2. Timecourse deneyler Hayvan örnekleri her zaman noktası (0 saat 180 dpi), beş hayvan, T9 (200 kd) ılımlı bir kontüzyon yaralanma aldıve omurilik dokularında PMN, ED1 + makrofaj / mikroglia ve CD3 + T hücreleri numaraları için flow sitometri ile değerlendirildi. Ancak, tüm hayvan örnekleri PMN (4-5), ED1 (3-5) ve CD3 (4-5) akış sitometri analizleri için başarıyla kurtarıldı. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 T9 ılımlı (200 kd) kontüzyon yaralanma omurilik hücresel inflamasyon timecourse. + T-hücrelerinin flow sitometri, PMNs&#39;nin numaraları, ED1 + makrofaj / mikroglia ve CD3 tarafından değerlendirilir gibi akut zirve yaptı (sırasıyla 1,7 ve 9 dpi) ve kronik omurilik yaralı ısrar n = 3 ila 5 ortalama grubu, ortalama ± SEM.

<ol>
	<li>Beck, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cellular+inflammation+after+traumatic+spinal+cord+injury:+evidence+for+a+multiphasic+inflammatory+response+in+the+acute+to+chronic+environment.">Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment.</a> Brain. 133, 433-447 (2010).</li><li>Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+early+and+terminal+complement+proteins+associated+with+polymorphonuclear+leukocytes+in+vitro+and+in+vivo+after+spinal+cord+injury.">Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury.</a> J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).</li><li>Saville, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+to+CD11d+reduces+the+inflammatory+infiltrate+into+the+injured+spinal+cord:+a+potential+neuroprotective+treatment.">A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment.</a> J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).</li><li>Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+inflammatory+response+after+spinal+cord+injury+in+Sprague-Dawley+and+Lewis+rats.">Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats.</a> J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).</li><li>Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+hematogenous+macrophages+promotes+partial+hindlimb+recovery+and+neuroanatomical+repair+after+experimental+spinal+cord+injury.">Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).</li><li>Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+physiological+and+pathological+T-cell+recruitment+after+mouse+spinal+cord+injury.">Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).</li><li>Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+lesion+development+and+intraspinal+inflammation+in+four+strains+of+mice+following+spinal+contusion+injury.">Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury.</a> J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).</li><li>Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+quantitative+analysis+of+spinal+cord+cells+from+Theiler's+virus-infected+mice+without+the+requirement+for+myelin+debris+removal.">Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal.</a> J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).</li><li>Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+CD41-labeled+platelets+isolated+by+the+rapid,+one-step+OptiPrep+method+from+human+blood.">Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood.</a> Cytometry A. 65, 84-87 (2005).</li><li>Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+adult+rat+hippocampal+neurons+with+long-interval+changing+media.">Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media.</a> Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).</li><li>Tjoa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+flow+cytometry+to+assess+neutrophil+infiltration+in+the+injured+murine+spinal+cord.">The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).</li><li>Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+inflammation+decreases+secondary+degeneration+and+functional+deficit+after+spinal+cord+injury.">Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).</li><li>Stirling, D. P., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+inflammatory+response+after+murine+spinal+cord+injury+revealed+by+flow+cytometry.">Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry.</a> J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).</li></ol>

MSS bağışıklık hücrelerinin ölçmek için flow sitometri lipid / miyelin içerik ve enkaz karmaşıktır. Antikor bağlanma ve özgüllük ile müdahale yanı sıra, miyelin enkaz, ölçü hassasiyeti ve doğruluğu 8 azalan bağışıklık sistemi hücrelerine benzer boyut ve granülasyon özellikleri olabilir. Burada açıklanan yeni hücre hazırlama yöntemi miyelin enkaz giderilmesinde etkilidir ve böylece yaralı omurilik hücresel inflamasyon değişiklikleri belirlemek için flow sitometri duyarlılığını artırır. SKY PMN için bir tam zamanlı kursa dahil sonra Örneğin, bağışıklık hücreleri bu yöntemi gelişmiş algılama miyelin enkaz kaldırma alone.Critically enzimatik ayrılma göre, bu yöntemin yeni kullanımı, akut ve kronik hücresel inflamasyon ilk karakterizasyonu izin makrofaj / mikroglia ve T-hücrelerinin, 180 dpi ve hücresel inflamasyon bir roman ikinci aşaması belirledi. Nöro bir multifazik bileşeni Bu önemli bulgular SKY için her iki hücre tabanlı ve farmakolojik müdahaleler de dahil olmak üzere rasyonel tedavi stratejileri, tasarlanması ve uygulanması için kritik olabilir. OptiPrep degrade sistemi, beyin hücre kültürü amacıyla 10 9 kan hücreleri veya saflaştırmak nöronlar ayrı enkaz olmuştur, ancak, değiştirilmiş ve omurilik ayrışmış hücreleri miyelin enkaz ayırmak için bu yöntemi sistemi gelişmiş ve izin flow sitometri ile hücresel inflamasyon hızlı ve daha doğru kantifikasyon. Bu yöntem, flow sitometri ile birlikte birçok çalışmanın sadece hücre türüne özgü değildir ya da her zaman doğru sağlayamaz morfolojik ve histolojik teknikler kullanarak CNS hücresel inflamasyon karakterize olduğu gibi, merkezi sinir sistemi yaralanma veya patolojik durumların sonra inflamasyon araştırmalarda önemli bir ilerleme sağlamak olasıdır kantitatif değerlendirilmesi. Ayrıca, bir kaç son çalışmalar, bağışıklık hücrelerinin taze ayrışmış kord doku 11,12 veya Percoll degrade sistemi 13 ayrılmış hücreler kullanılarak flow sitometri ile spinal kord yaralı ölçmek için çalıştılar; Ancak, bu çalışmalar düşük hücre verimi ya da göstermiştir veya duyarsız var bağışıklık hücrelerinin algılama. Buna karşılık, OptiPrep degrade hücre hazırlama yöntemi, ilk kez kademeli yaralanma şiddetine tepki olarak ve 180 dpi kadar uzun bir timecourse üzerinden hücresel inflamasyon değişiklikleri flow sitometri ile hassas ve güvenilir kantitatif değerlendirme sağladı. Akım sitometri analizi hassasiyet ve güvenilirlik de spesifik immün hücre türlerini tespit etmek için kullanılan antikorların özgüllüğü bağlıdır, flow sitometri olarak morfolojik kriterlerinin daha fazla hücre tiplerini ayırt etmek için izin vermez. PMN, makrofaj / mikroglia ya da T-söyler antikor özgüllüğü yaralı omurilik dokusu 1,2 kültür ve hücrelerin periton PMN ve alveoler makrofajlar için flow sitometri iyice test edilmiştir. OptiPrep degrade sistemi ile birlikte, flow sitometri için kullanılan bu antikorlar, hücresel inflamasyon, SCI mikroçevresinin dinamikleri yeni anlayış sağlamış ve ilk kez uzun bir multifazik yanıt için belirlenen bir zamansal ve kantitatif analiz nesil katkıda bulunmuştur hücresel inflamasyon. SKY sonrasında hücrelerin Bu multifazik yanıt yaralanma sonrası belirli zamanlarda belirli hücre tiplerinin rolünü araştırmak veya yaralanmalara kötüleştirebilir belirli bir hücre türlerine karşı terapötik girişimlerin oluşturmak için önemli olabilir. Ayrıca, bu bulgular SKY için en uygun ilaç ya da hücre tabanlı müdahaleler için uygun bir gerekçe gelişimine yardımcı olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> OptiPrep </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9182490 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H1387 </td></tr><tr><td> Tavşan anti-sıçan PMN (FITC) </td><td> Doğru Kimyasal ve Bilimsel </td><td> AIFAD51140 </td></tr><tr><td> Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA341A488 </td></tr><tr><td> Fare anti-sıçan CD3 (FITC) </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA772F </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Sigma </td><td> T9935 </td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> DME </td><td> Sigma </td><td> D1152 </td></tr><tr><td> FARE IgG1 (Alexa Fluor 488) </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA1209A488 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> Tavşan serumu </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 011-000-120011-000-120 </td></tr><tr><td> Fare serumu </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-120 </td></tr><tr><td> Hücre Süzgeç </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry:  a novel use for a cell purification method

Morfolojik ve histolojik teknikler kullanarak yaralı bir merkezi sinir sistemi (MSS) bağışıklık hücrelerinin tespiti her zaman hücresel inflamasyon gerçek kantitatif analiz sunmamıştır. Flow sitometri, bağışıklık hücrelerinin zarar gören beyin veya omurilik dokusunda ölçmek için hızlı bir alternatif bir yöntem. Tarihsel olarak, flow sitometri, kan ya da ayrışmış dalak ve timus alınan bağışıklık hücreleri ölçmek için kullanılır olmuştur ve sadece birkaç çalışma yaralı omurilik taze ayrışmış kord dokusu kullanılarak flow sitometri ile bağışıklık hücrelerinin ölçmek için çalıştılar. Ancak, ayrışmış omurilik dokusunda hücreler için yanlış olabilir ve akış sitometresi ile elde edilen hücre sayımı güvenilirliğini azaltmak miyelin enkaz ile yoğunlaşmıştır. Biz flow sitometri yaralı omurilikte hücresel inflamasyon hassas ve güvenilir niceleyiciler, hücreleri etkili bir şekilde ayrı lipid / miyelin enkaz OptiPrep degrade sistemini kullanarak bir hücre hazırlama yöntemi gelişmiş var. (Beck &amp; Nguyen ve ark, Beyin 2010 Şubat 133 (Pt 2):. 433-47) son çalışmada belirtildiği gibi, OptiPrep hücre hazırlama, sayar, yaralanan omurilikte hücresel inflamasyon tespit duyarlılık artmıştır yaralanma şiddeti ile korele özel hücre tipleri. Kritik, roman bu yöntemin kullanımı, 2 saat arasında değişen bir süre içinde tam bir zaman polimorfonükleer lökositlerin kursu (PMN, nötrofiller), makrofaj / mikroglia ve T-hücrelerinin SKY sonrasında akut ve kronik hücresel inflamasyon ilk karakterizasyonu hücresel inflamasyon şaşırtıcı bir roman ikinci aşaması tanımlayan 180 gün sonrası yaralanma (dpi). Bu yöntemi kullanarak hücresel inflamasyon Kapsamlı karakterizasyonu yaralı MSS nöro daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve rasyonel tedavi stratejileri de dahil olmak üzere hücre tabanlı ve farmakolojik hem de tasarım ve uygulama için kritik olabilecek nöro multifazik önemli bir bileşeni açığa SKY yönelik müdahalelerin.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method at JoVE.com

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Flow sitometri yaralı / patolojik MSS hücresel inflamasyon Niceleme azalan hassasiyet / doğruluk, benzer boyutta ve granülasyon hücreleri olabilir lipid / miyelin enkaz karmaşıktır. Biz miyelin enkaz kaldırmak ve yaralanan omurilikte akım sitometri ile hücre algılama geliştirmek için bir hücre hazırlama yöntemi gelişmiş var.

Akış Sitometri Yaralı Omurilik Doku Bağışıklık Hücreleri Kantitatif Değerlendirilmesi: Hücre Arıtma Yöntemi Roman kullanın

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

quantitative-assessment-immune-cells-injured-spinal-cord-tissue-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.0K Görüntüleme.  University of California. Flow sitometri yaralı / patolojik MSS hücresel inflamasyon Niceleme azalan hassasiyet / doğruluk, benzer boyutta ve granülasyon hücreleri olabilir lipid / miyelin enkaz karmaşıktır. Biz miyelin enkaz kaldırmak ve yaralanan omurilikte akım sitometri ile hücre algılama geliştirmek için bir hücre hazırlama yöntemi gelişmiş var.

Video: Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...