Biz eleştirel görüş ve önerileriniz için Wobus laboratuar üyelerine teşekkür. CEW ve laboratuvarda çalışma Michigan Üniversitesi, Biyo-Savunma Mükemmeliyet NIH / NIAID Bölgesel Merkezi ve Gelişmekte Olan Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma (RCE) Programı, Bölge V &#39;Büyük bir kariyer geliştirme hibe start-up fonları tarafından finanse edildi Göller RCE (NIH ödülü 1-U54-AI-057153) ve NIH R01 AI080611. MBG-H. Michigan Üniversitesi Deneysel İmmünoloji (NIH T32 A1007413-16) ve Mikrobiyal Patogenezinde Moleküler Mekanizmalar (NIH T32 A1007528) eğitim hibeleri tarafından finanse edildi. JBC Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nivel Superior (Pelerin), Brasilia, Brezilya tarafından finanse edildi.

1. 264.7 RAW Makrofaj Hücre Hattı ekimi <ol><li> % 10 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (&lt;10 EU / ml) ile yüksek glikoz DMEM oluşur DMEM-10 ortamı içinde RAW 264.7 hücreleri (ATCC, katalog # TIB-71), 10 mM HEPES bakımı , 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1 mM, temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin. Hücreler tipik olarak şişesi başına ortam 35 ml içeren 175 cm2 doku kültürü şişeleri içinde muhafaza edilmekte ve 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde CO2. Ancak, herhangi bir boyut şişenin şişenin boyutu için uygun bir ortam hacmi ile de kullanılabilir. </li><li> Hücreleri ayırmak için: eski medya kapalı aspire hücrelere taze DMEM-10 ortamı 10 ml eklenir, sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak, şişenin alt hücreler kazıma. Sonra, bir 10 ml pipet içine hücreleri çizerek homojen bir çözelti içine hücreleri tekrar süspansiyon ve zorla pipet pr hücreleri sıkmaşişenin dibine Essed. En az 3 kez hücreler artık yığın birlikte böylece bu işlemi tekrarlayın. Tek bir hücre süspansiyonu elde edildiği ışık mikroskobu ile kontrol edin. Yeni bir 175 cm 2 şişesine hücre süspansiyonu 2 ml (1:5 seyreltme veya ~ 2x10 7 hücreleri), ve medya son hacim kadar getirmek - Sonra 1 ml (1:10 seyreltme veya ~ 1x10 7 hücreleri) aktarmak 35 ml. </li><li> Bölünmüş hücreleri (~ 1x10 8 hücreleri total/175 cm 2 matara) neredeyse konfluent zaman: 1:5 seyreltme ile başlayan eğer 1:10 seyreltme, ya da her iki gün ile başlayan üç günde eğer. Yarma hücreleri önce hücre morfolojisi kontrol etmek için ışık mikroskobu kullanın. Hücrelerin çoğu yuvarlak bakmak ve aktif olmamalıdır. Aktif hücreler cılız morfolojisi ekleri ile, granül ve / veya genişletilmiş var. Bu hücreleri genellikle plak yok gibi hücrelerin sarmak izin vermeyin. Geçit sayısı takip edin ve sık sık hücrelerin bir alt geçit kısım eritilmesi ile başlamak. (Biz bir cut-off olarak geçit 30 kullanın). </li></ol> 2. MNV İnokulum RAW 264.7 Hücreleri Infect <ol><li> Tohum RAW 264.7 1x10 6 canlı hücre / DMEM-10 ortamı içinde ml &#39;lik bir yoğunlukta 6 oyuklu plakalar (3.5 cm çapında) içine hücreleri, ve her bir kuyu için bu süspansiyon 2 ml ekleyin. Bu el en az 10 kat plakaları sallama ile ya da yaklaşık 10 dakika için bir sallanan tertibatım kullanarak ya da eşit bir şekilde kuyu hücrelere yaymak için önemlidir. Girdap plakaları bu kuyunun merkezinde küme hücreleri neden olur gibi yapmayın. Sıra plakalar bir doku kültürü kuluçka makinesi içine (37 ° C ve% 5 CO2). Hücreler 37 ° C de bir gece boyunca ya da en azından 4 saat için takmak için izin Hücreler 60 olmalı -% 80 plak tahlil için birleşik ve iyi boyunca eşit olarak dağıtılır. </li><li> Ertesi gün, doku kültüründe MNV-enfekte hücreleri veya MNV-enfekte farelerde Homojenize dokularda veya dışkı örneklerinden olabilir virüs inokulum hazırlamak. doku örnekleri kullanılarak, bezelye büyüklüğünde pidoku eces bir doku homojenleştirici (; Roche örneğin MagnaLyser) kullanılarak DMEM-10, 1 ml steril silis boncukları ihtiva eden 2 ml vidalı kapak tüp içinde homojenize edilir. Dışkı numuneleri için, en fazla 3 fare pislikleri 1 ml ortam içinde homojen hale getirilmelidir. Tüm numuneler sonra dondurulan (-80 ° C&#39;de) ve plak tahlil yapmadan önce bir kez çözdürülmelidir edilir. </li><li> DMEM / yüksek glukozlu,% 5 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 oluşan tam bir DMEM-5 ortam içinde virüs inokulum 10 kat dilüe U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1 mM, temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin. </li><li> On-kat seri seyreltiler, 24 oyuklu plakalar olarak hazırlanmıştır: Bir yükseltici pipet çoklu kuyu içine 1.35 ml ortam dağıtmak için kullanılır, 10 -1 seyreltme ortamı 1.35 ml, virüs ihtiva eden numune 0.15 mL karıştırılması ile yapılmıştır ve daha sonra 10 -1 seyreltme 0.15 mi 10 -2 dilutio etmek için ortam 1.35 ml ilave edilirn ve böyle devam eder. Bu ipuçları yeni bir seyreltme yapmak her zaman değiştirmek için önemlidir. Bir çok kanallı bir pipet kuyu başına 0,15 ml &#39;lik bir toplam hacim (Şekil 3A bakın) transfer eden bir 24-kuyulu plakanın iyi birine uygun iki uç ile aynı anda birden fazla numune seyreltmeler yapmak için kullanılabilir. </li><li> Doku homojenatlarında ve fekal içerik için tipik bir seyreltme aralığı 10 -1 10 -3 olduğunu. Bununla birlikte, bu örneklerden doku kültür plakları örnekleri ile karşılaştırıldığında daha küçük olma eğilimindedir. Ayrıca, bazı durumlarda, dışkı örnekleri, 1:100 dilüsyon böylece plaklar saymak için engellemektedir, yeterli derecede tek tabakalı hücre bozabilir dışkı herhangi bir zehirli bileşenleri sulandırmak için gereklidir. Doku kültürü lizatları seyreltme aralığı virüs ömrü çevrimi esnasında ilgi zaman noktasına bağlıdır. 10 -9 kadar gitmek Dilüsyonlar enfeksiyon zirvesinde gerekli olabilir. </li><li> Seri dilüsyonları hazırlandıktan sonra, 6-well plakasındas örnek adını ve kaplama olmak dilüsyonları ile RAW 264.7 mono tabakaları (bölüm 2.1) içeren. Bir seferde bir tabak, dışarı Flicking veya aspire tüm ortamı çıkarın. Hemen ardından bir seyreltilmiş örnek 0,5 ml ekleyin, iyi, sonra bir sonraki seyreltme geçmeden önce, yinelenen bir de tekrarlayın. Tüm 3 dilüsyonları tüm hücreleriyle kaplanmış oylandı sağlamak için elle ileri geri bir plaka, eğim plaka eklenir sonra. Hücrelerin kurumasına olmayacak emin olmak için bir kerede bir tabak tutun. </li><li> Her bir kuyucuğa seyreltmeler ve 0,5 ml eklendikten sonra, dikey plakaları üst üste ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya onları. Hacim, her bir oyuğa ilave tamamen tek tabakalı karşılamak için yeterli olmadığı için, plakalar nazikçe yandan her 10-15 dakikada tarafından ileri geri hareket ettirildiğinde veya bir sallama cihazı (dakika başına ~ 18 salınım) üzerine yerleştirilmesi gerekir. Bu kurumasını hücrelerini engeller. </li></ol> 3. Düşük Erime Noktası Agaroz (SeaPlaque) Overlay Hazırlık <ol><li> 1 saat inkübasyon işlemi tamamlanmadan önce levha toplam hacim için gereken kaplama miktarını hesaplar. Gerekli hacim / de veya 12 ml/6-well plakası 2 ml. Agaroz (bkz. bölüm 3.2) ve ayrıca medya (bkz. bölüm 3.3) hazırlayın. </li><li> Agaroz hazırlamak için, bir cam şişe içinde, damıtılmış su (% 3 w / v) ve 100 ml &#39;lik bir toplam hacim içinde SeaPlaque agaroz 3 g askıya. 20-30 dakika süreyle otoklav. (Agaroz zaten mikrodalga yeniden erime agaroz-elden önce hazırlanan varsa.) Bu agaroz çok sıcak ise ° C Kullanmadan önce bir su banyosunda, bu hücreleri öldürecek çünkü 42 SeaPlaque agaroz dengelenmesi önemlidir. Su seviyesi istenmeyen katılaşma önlemek için agaroz düzeyine eşit veya üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> Ortam hazırlamak için: oluşur 2x MEM medya, 100 ml olun2x MEM,% 10 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 4 mM L-glutamin. ° C su banyosunda 37 medya dengelenmesi. </li><li> Enfekte hücre mono tabakaları üzerine yayılmış hemen önce, bir 1:1 oranında SeaPlaque agaroz ve bir steril şişe içinde bir araya 2x MEM ortam hem de karıştırılır. Fazla 200 ml paylaşımı gerekiyorsa, bölünmüş çok sayıda şişe içine hacmi ve 37 tutmak ° C su banyosunda kullanıma hazır oluncaya kadar. </li><li> 1 saat inkübasyon (bölüm 2.7 &#39;e bakınız) sonunda her kuyunun inokulum kapalı aspire. Yavaş yavaş her çukurun duvarına pipet koyarak her bir kuyunun kenarına bindirme 2 ml ekleyin. En fazla 5 plakalarına hücrelerin kurumasına fırsat vermeden aynı anda işlenebilir. </li><li> Bindirme doku kültürü inkübatör içine dik plakaları koymadan önce oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika katılaşmasını bekleyin. % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de 48 saat boyunca levhalar inkübe edin. </li><li> Sonrakuluçka dönemi, plaklar çıplak gözle belli belirsiz görünür, bu yüzden plak varlığı için boyanmamış plakaları kontrol edin. Plak yok görünmüyorsa, ek 4 saat boyunca inkübe ve tekrar kontrol edin. Bununla birlikte, en fazla 72 saat inkübasyon süresi geçmemelidir. </li></ol> 4. Neutral Red Boyama tarafından Plaketlerinin Görselleştirme <ol><li> , - 1 x PBS, 97 ml (doku kültürü derecesi, Mg 2 + etmek; plaklar görselleştirmek için, nötr kırmızı boyama çözeltisi nötr kırmızı, 3 ml (Sigma, katalog # N2889 DPBS içinde% 0.33 w / v) ilave edilmesi ile hazırlanır Ca 2 + - ücretsiz; Gibco, katalog # 10010). 12 ml nötr kırmızı boyama çözeltisi her bir 6-plaka için gereklidir: deney için gerekli olan nötür kırmızı boyama çözeltisinin hacmi hesaplayın. Ardından, her bir kuyucuğa 2 ml ekleyin. Bazı plak tahlil protokolleri agaroz fişi kuyulardan çıkarılması gerektirmesine rağmen, bu protokolde nötral kırmızı boyama çözüm bindirme doğrudan eklenir. </li><li> Bir saat sonra birplaklar hala kuyularda nötral kırmızı boyama çözeltisi ile görünür durumdaysa 37 ° C&#39;de cubation, kontrol edin. Plaklar kolaylıkla görünür değil iseniz, boyama başka bir saat boyunca devam etmesine izin verin. Plaklar görebilir kadar kuluçka devam edin. (Not:. Fazla 3 saat boyunca Boyama optimal değildir ve hiçbir plaklar boyanma 3 saat sonra pozitif kontrol örneği görünür ise, plak tahlil düzgün çalışmadı) boyama tamamlandıktan sonra, nötral kırmızı boyama çözüm aspire , agaroz fiş sağlanması rahatsız ve sonra plaklar sayma devam edilmez. </li><li> Bir ışık kutusu üzerinde baş aşağı plakası yerleştirerek ve yinelenen sayar önlemek için sayılır plaklar üzerinde bir nokta işaretleyerek plaklar sayın. (Birlikte plaklar füzyon hiçbir görsel kanıtlar yani) plaklar açıkça ayrılır kuyularda plaklar saymak için seyreltme seçin. Eğer mümkünse, iki dilüsyonlarda plaklar sayılır. O plak boyutu MNV suşları, virüs inokulum arasında değişebilir dikkat etmek önemlidir, ve bağlıdırplak tahlil sırasında RAW 264.7 hücreleri koşulu. </li><li> Plak yok, iyi görünür, her iki numune içinde mevcut herhangi bir virüs ya da virüs miktarı plak tahlil saptama sınırının altında olduğunu olsaydı. Bu durumda, diğer plaka kuyuları içeren kuyu olarak benzer bir kırmızı renk ile leke. Belirli bir seyrelti içinde mevcut çok sayıda viral partiküller olduğunda Alternatif olarak, plak yokluğunda da görülmektedir. Bu tüm monolayer parçalanma yol açar ve kuyular rengi sarı / turuncu görünür. </li><li> Viral titreleri hesaplayın. Tek bir dilüsyon kuyularda hem plakların sayısını ekleyin ve seyreltme faktörü (yani 1 ml 2 kuyu 0,5 ml ile enfekte olup olmadığını) ile çarpın. Bu 1 ml sizin inokülum hacminin plak oluşturan birim miktarı (PFU) verecektir. Örneğin, 10 -2 seyreltme de Şekil 4 &#39;, iyi bir (&quot;II&quot; işaretli) 14 plaklar vardır ve diğer iyi (&quot;V&quot; işaretli) 17 plaklar vardır. Böylece, viral titresi 14 olacakx10 17x10 2 + 2 = 3.100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Bulaşıcı MNV-1 parçacıklar Şekil 1 &#39;de şematik olarak belirtildiği gibi bir plak deneyi kullanılarak ölçülebilir. Şekil 2A hemen önce enfeksiyon, RAW 264.7 hücreleri, bir tek tabaka ile iyi göstermektedir, Şekil 2B, I, II, roman numaraları ile gösterilen üç görünür plaklar gösterirken Bir kuyu içinde ve III. Testin bireysel adımları Şekil tasvir edilmektedir F. Şekil 3A ile 3A, bir virüs içeren bir örnek, 10-kat inceltilmiş serileri hazırlanması gösterilmektedir. Şekil 3B, bir 6-kuyulu plakanın kuyularının çoğaltmak için dilüsyonları transferi gösterir. Şekil 3C 1 saat için oda sıcaklığında inokulum ile RAW 264.7 hücreleri inkübe etmek için kullanılan cihaz sallanan gösteren Şekil 3B hücreleri SeaPlaque ile kaplanmış olan gösterir:. MEMŞekil 3F hücreler daha sonra bir% 0.01 nötral kırmızı solüsyon 48 saat ile boyanmış olan gösterirken, bir karışım. Şekil 3E, kaplama katılaşmasını sağlamak için oda sıcaklığında bir plaka göstermektedir. 1-3 saat boyunca boyanan hücrelerin ve nötral kırmızı boyama çözüm aspire sonra, plaklar görebilir ve (Şekil 4) sayılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Şekil 1. MNV plak tahlil protokolü şematik. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Şekil 2. Enfeksiyon öncesi ve plak oluşumundan sonra bir tek tabakalı bir iyi Temsilcisi görüntüler. A) RAW 264.7 hücreleri 20x büyütmede ışık mikroskobu altında geceleme ve görüntülü kültüre edildi. B) Hücreler 48 saat sonra 0,01% nötral kırmızı çözeltisi ile boyandıenfeksiyon r ve 4x büyütmede ışık mikroskobu altında görüntülendi. Romen rakamları I, II ve III üç görünür plaklar göstermektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Şekil 3. Farklı plak tahlil adımlar Temsilcisi görüntüler. A) MNV-1 inokulum 10-kat dilüsyonu hazırlanır. B) Aşı, yinelenen bir kuyu içinde hücre mono tabakaları eklenir. C) hücreleri ile inokulum, oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallanan ile inkübe edilir. D) hücreler SeaPlaque agaroz ve 2x MEM ortam bir 1:1 karışımı ile üst üste. E) Levhalar kaplama katılaştırmak için izin vermek üzere oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya bırakıldı. Nötral kırmızı boyama çözüm 48 saat sonrası enfeksiyon hücrelerin F) Boyama. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Hücre monol Şekil 4. MNV-1 formları plaklarayers. Burada gösterilenler inkübasyon 1 saat sonra nötral kırmızı boyama çözüm lekeli plaklar gösteren, 48 saat sonrası enfeksiyon temsili bir plak tahlil plakadır. Plakası üç 10 kat dilüsyonlarının yinelenen kuyuları gösterir. I ve IV 10-1 seyreltme karşılık roman numaraları ile etiketlenmiş Wells, II ve V 10-2 seyreltme karşılıktır; III ve VI 10-3 seyreltme karşılık gelir. Numunenin viral titresi (hesaplama ayrıntıları için bakınız Bölüm 4.5) aşağıda belirtilmiştir.

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan MNV-1 için plak metodu bulaşıcı MNV parçacıkların miktarının bir yoludur. Şekil 3&#39;de gösterilen tahlil adımı takip ederek, tekrar üretilebilir bir viral titreler elde edebilir. Testin tespit limiti kullanılan başlangıç ​​seyreltme bağlıdır. Yukarıda açıklandığı gibi örnek bir 1:10 seyreltme ile başlarken, plak testin saptama sınırının 10 pfu (yani, 10 -1 seyreltme görülebilir 1 plak) &#39;dir. Her bir plak tek bir virüs temsil ettiği için, plak deneyi, izole plaklar çekme ve bunları daha önce tarif 1 yayarak MNV klonal popülasyonları saflaştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, plak saflandırma da karışık virüs popülasyonlarının tek başına bir virüs popülasyonunun ayırmak için de kullanılabilir. MNV enfeksiyonun tespiti için bir plak tahlil kullanarak bir sınırlaması tüm MNV suşların plaklar 4 oluştururlar olmasıdır. Bununla birlikte, inabili üstesinden gelmek mümkündürseri doku kültürü 7 bu virüsler pasajlanmasını tarafından plak oluşturan hayvanlardan izole edilen bazı suşları MNV, ve ty. Plak tahlil alternatif TCID 50 tekniği 3, 4 ile bulaşıcı partikülleri ölçmektir. Bu tahlil, uç nokta seyreltmeleri ile MNV 4-tamamlanması 1 hafta sürer aşağıdaki aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarı miktarını belirler. Bir plak deneyi daha yavaş olmasına ek olarak, TCID 50 tahlil ayrıca şu şekilde duyarlı değildir (tespit limiti = 200 TCID 50 / ml), RAW 264.7 hücreleri, 4 doku örneklerinin toksisite nedeniyle. Protokolü içerisindeki kritik adımlar protokol boyunca tarif edilmiş olmasına rağmen, aşağıdaki bölümde sorun giderme kolaylaştırmak için bir özet sunar. Protokolde en kritik adım RAW 264.7 hücreleri virüs çoğaltması desteklemek için test boyunca canlı kalmasını sağlamaktır. Bu canışık mikroskobu ile testin her aşamasında izlenecektir. Hücre canlılığı, iki yolla sağlanır. Birincisi, bakım plakaları tutarken hücrelerin kurumasına izin vermeyin alınmalıdır. Böylece, plakaları, bir defada bir aşılanmış enfeksiyon döneminde sarsan ve onlar ele edilmemesi zaman kalır kapalı olmalıdır edilmektedir. İkinci olarak, çözeltiler hücrelerin üzerine ilave ~ 37 ° C &#39;ye dengelenmiş olmalıdır Bundan başka, hücrelerin aktivasyonu sınırlayan düşük endotoksin serum (&lt;10 EU / ml) içeren ortam içinde bakımı için de RAW 264.7 hücreleri genel sağlığı için hayati önem taşır. Pasaj 30 ya da daha yüksek bir ikinci hücreleri kullanılarak Buna ek olarak, plak deneyi daha yüksek bir başarısızlık oranı gözlemledik. Bu büyük olasılıkla laboratuvardan laboratuvara değişir rağmen, yüksek geçit RAW 264.7 hücreleri kullanarak, özellikle tekrarlanabilir titreleri sağlamak için (örneğin, bilinen bir viral titreye sahip bir örnek) bir pozitif kontrol dahil etmek önemlidir. Yüksek geçit hücrelerin kullanımını sınırlamak için, erken passa şişeleri dondurmak tavsiye edilirRAW 264.7 hücrelerin alınması ve sıklıkla dondurulmuş flakonlarından yeni bir kültür başlamak üzerine ge hücreleri. Hücreleri değişmiş gibi, hücre morfolojisi değişiklikler uymak (örneğin yuvarlak çırpı ve yaymak) başarısızlık gibi özellikler, veya mikoplazma kirlenme tespit edildiğinde sergilemek zaman düşük geçişi hücre kültürleri üzerinde başlayarak da yararlı olacaktır. Dikkat etmek önemli bir nokta da pipet uçları örnekleri arasında ve dilüsyonları sırasında değiştirilen sağlamaktır. Bu doğru seri dilüsyonları sağlamak ve örnekler arasında çapraz bulaşmayı önlemek olacaktır. Aynı örnek seri dilüsyonları kuyucuklara ilave edilmesi ile aynı pipet ucu tekrar kullanılabilir protokol içinde bir adımdır. Bu durumda, bir çok seyreltilmiş inokulum den az başlar ve yeni bir seyreltme çizerken şiddetle aşağı yukarı pipetle etmelidir. Plak tahlil protokolü bazı modifikasyonlar iyileştirilebilir. T yapılabilir bir modifikasyonuburada iki kopya halinde kuyu inokülasyon için yeterli hücre olmayan her bir seyreltme için sadece tek bir iyi aşılamak için. Inokulum hacmi 0.5 ml olan Bununla beraber, plaklar sayı daha sonra pfu / ml &#39;ye normalleştirmek için 2 faktör ile çarpılır gerekmektedir. Plak tahlil da MNV replikasyon desteklemek mümkün olan herhangi bir diğer yapışık hücre hattı ile kullanım için adapte edilebilir, ve bu fare mikroglial BV-2 hücre dizisi 8 için tarif edilmiştir. Uygulanabilir diğer değişiklikler diğer virüsler için geliştirilen plak tahlil protokolleri için tarif edilmiştir uyarlamalar vardır. MNV halinde, aşağıdaki modifikasyonlar önceden başarılı bir şekilde uygulanmıştır; metil yerine Deniz Plak selüloz agaroz 9, ve kristal mor ya da yerine nötr kırmızı 10, 11 ve metilen mavisi ile boyanması hücrelerin kullanımı. Diğer plak oluşturan virüs ölçmek için gerekli ya da oth için kullanılır Genel olarak, bu protokol kolayca adapte edilebilirgenel olarak bulaşıcı viral parçacıkların ölçmek için yararlı bir araç yapma, RAW 264.7 hücrelerinde litik enfeksiyonlara neden er virüsler.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM / Yüksek glukoz </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x Penisilin ve streptomisin </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM olmayan esansiyel amino asitler </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-glutamin </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Deniz Plak Agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Nötr Kırmızı 0.33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm Zirkonya / Silika boncuk </td><td> BioSpec Ürünler </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Model 35 Hız Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna Lyser Enstrüman </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Ham 264.7 hücre hattı </td><td> ATCC </td><td> TİB-71 </td></tr><tr><td> Doku kültürü inkübatör </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Mürin norovirusa (MNV) verimli doku kültürü 1, 2 yetişir Norovirüs cinsinin tek üyesidir. Hücre parçalama ve sitopatik etki (CPE) fare dendritik hücreler veya makrofajlar 1 MNV-1 enfeksiyonu sırasında görülür. MNV-1 Bu özellik, bir plak deneyi 1 gerçekleştirerek, belirli bir örnek içinde bulaşıcı maddelerin sayısını ölçmek için kullanılabilir. Plak tahlil olmuş akyuvarlar ve plaklar 3 olarak adlandırılan bir birleşik hücre monolayer, delik oluşturmak için MNV-1 yatmaktadır. Birden çok doku kültürü teknikleri, hasat edilmiş doku, klinik, çevre örneklerde viral enfeksiyonların tespit etmek için kullanılır, fakat hepsi değil ölçü bulaşıcı parçacıklar (örn. qRT-PCR). Edilebilir Bulaşıcı virüs parçacıkları ölçmek için bir yolu, aşağıda daha detaylı olarak tarif edilecektir bir plak deneyi 3, gerçekleştirilmesidir. MNV plak tahlil bir varyasyonu flor olduğunuMNV antijen hücre mono tabakaları 4 immunohistokimyasal edilir escent odak tahlil. Viral antijen ekspresyonu plak oluşumu önündeki tarihi Bu testte, daha hızlı olabilir. Aynı zamanda, plak oluşturan yapamaz virüs titrasyonu için yararlıdır. Ancak, floresan odak tahlil gibi antikorlar ve odak oluşturan birim saymak için bir mikroskop gibi plak testin ötesinde ek kaynaklar gerektirir. Bulaşıcı MNV ayrıca% 50 Doku Kültürü Enfektif Doz (TCID 50) 3 belirlenerek ölçülebilir. Bu tahlil, uç 5 ile titrasyon aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarını ölçer. Ancak, algılama sınırına bir plak tahlil 4 ile karşılaştırıldığında daha yüksektir. Bu yazıda, etkili biyolojik ya da çevresel numuneler 1, 4, 6 mevcut bulaşıcı MNV parçacıkların sayısını belirlemek için kullanılabilecek bir plak tahlil protokol açıklar. Bu yöntem olup baizin veren hücreler (RAW 264.7 mürin makrofaj hücreleri) bir tek tabaka aşılamak için kullanılır MNV ihtiva eden numuneler, 10-kat seri seyreltiler hazırlanması sed. Virüs zaman belirli bir süre için hücre mono tabakasında bağlanmasına izin verilir ve daha sonra agaroz ve hücre kültür ortamı bir karışımı hücreleri kapsayan önce aspire edilir. Soğuk bir şekilde yer alan hücrelere yaymak sınırlandırarak agar komşu hücreler, viral soy yayılmasını sağlar. Sonuç olarak, enfekte olmuş hücreler lize ve mono tabakasında deliklerin şekil plaklar olarak bilinir. Virüsün yeterli yayılması üzerine, plaklar nötr kırmızı, metilen mavisi veya kristal viyole gibi boyalar ile hücrelerin görünür aşağıdaki boyama olur. Düşük dilüsyonları, her plak komşu hücrelere yayılmış tek bir bulaşıcı viral partikül ve döl, kaynaklanır. Böylece, plakların sayısını sayma biri seyreltilmemiş numune 3 mevcut plak oluşturan birim (PFU) hesaplamak için izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Plaque Assay for Murine Norovirus

Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.2K Görüntüleme.  University of Michigan, Ann Arbor. Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.

Video: Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

B Grubu bir murin modelinde<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vajinal Kolonizasyon

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Dik Intravital mikroskopi için fare Submandibular Tükürük bezi hazırlanması

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;