Bu çalışma Wellcome Trust fon ile mümkün olmuştur. JM (080.964) ve SCW (080.948) bir Malavi-Fenerbahçe-Wellcome Trust öğrencilik tarafından Wellcome Trust burs ve DT tarafından desteklenmiştir.

1. Örnek Toplama Trombositler kolayca sıcaklık, ajitasyon veya depolama ile aktif hale getirilebilir ve bu yüzden dikkatle ele alınmalıdır. Trombosit hazırlanması için kan toplamak için vacutainers, bir çok klinik durumlarda kaçınılmazdır, ama emme potansiyel olarak trombosit aktivasyonu neden olabilir dikkatle düşünülmelidir. Araştırma hastanede kullanılan klinik protokol, bizim örnekleri dikkatle sodyum sitrat vacutainers toplanır. Bu ya da önceki çalışmada 12 erken trombosit aktivasyonu ile herhangi bir sorun yaşamamış. Biz spesifik olmayan kan grubu antijen toplama en aza indirmek için kan grubu O + kişilerden trombosit hazırlanması için kan toplamak. Bağış ayrıca bazı ilaçlar trombosit fonksiyonu etkilediği bilinmektedir bir önceki 7-10 gün içinde ilaç almamış. Trombosit açısından zengin plazma 1.1 hazırlanması (PRP) <ol><li> Yaklaşık 5 ml arasındaCM veya ağır sıtma (SM) bir sodyum sitrat Vacutainer hasta (BD ürün numarası 36276) bir sıtma saf bir ana ya da kan 2.5 ml tam kan. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj tam kan. Düşük sıcaklıklarda agrega için trombositlerin neden olabilir ° C 4 de santrifüj yok. </li><li> Dikkatlice temiz bir 15 ml tüp bulutlu süpernatant aktarın. Trombositler kolayca sıcaklık değişimleri ve fiziksel darbelere tarafından aktive edilir ve bu nedenle dikkatle ele alınmalıdır. Sallayarak veya tüp herhangi bir ani kalkış yapmayın. </li><li> &gt; 300 trombosit süspansiyonu saymak ve ayarlamak için bir Neubauer en haematocytometer kullanarak x 10 3 trombosit / sağlıklı donörlerden için ul ve &lt;150 x 10 3 trombosit / CM ve 1X fosfat tampon (pH 7.2-7.4; PBS) kullanılarak SM hastaların ul. Trombosit sayısı kolaylığı ve doğruluğunu sağlamak için yüksek seyreltme faktörü seçtiğinizden emin olun. </li></ol> Not: Sıtma patients sağlıklı bireyler 16,17,18 ile karşılaştırıldığında daha düşük bir trombosit sayısı vardır. CM ve UM Bu nedenle trombosit konsantrasyonları her sıtma tanı grubu içinde hastalar için ortalama trombosit sayısına göre ayarlanır. S. falciparum topaklanma fenotip CM izole yaygındır ve trombosit konsantrasyonu tüm CM durumlar için standart olduğu için küme boyutu veya sıklığı etkilemez güçlü bir bağlanma afinitesi bu nedenle düşük trombosit konsantrasyonları görüntüler. Trombosit bakımından yoksul plazma, 1.2 hazırlanması (PPP) <ol><li> PPP elde etmek için, 10 dakika boyunca 1500 x g&#39;de Yukarıda elde edilen PRP bir bölümü santrifüj. Trombosit çoğunluğu tüpün altındaki pellet haline getirilir. </li><li> PRP ve PPP ikisi de iki haftaya kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. İdeal olarak, topaklanma tahlil için taze trombosit kullanın. 8-10 gün sonra trombosit en aktif ve muhtemelen toplu olması muhtemeldir. </li></ol> 2. Parasite Kültür <ol><li> 5 dakika boyunca 370 x g&#39;de santrifüj ile 5-10 ml RPMI 1640 pelet pRBC üç kez yıkayın. Not: bu protokoldeki tüm kültürlerde yaklaşık 1 ml dolu hücre hacmi (PCV) başladı ve 5% hematokrit tutulur. Kültürler pRBC herhangi PCV ile başladı ve istenilen hematokrit ulaşmak için bulaşmamış RBC ve medya ile buna göre ayarlanabilir. </li><li> 25 mM HEPES,% 5 Albumax II ya da% 10 serum ve 40 ug /% 5 hematokrit elde etmek ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640 sıtma standart kültür ortamı ile bir kültür şişesi ve ek olarak pRBC yerleştirin. </li><li> Mühürleme ve inkübasyondan önce,% 92.5 azot,% 2.5 oksijen ve% 5 karbon dioksit karışımı ile kültür şişeleri nüfuz. Alternatif olarak, Trager-Jensen hava geçirmez bir mum kavanozu yöntem kullanılabilir. </li><li> PRBC hastalar doğrudan elde için, olgun parazitleri almak için% 5 CO 2 bir 37 ° C inkübatör 24-36 saat kendi kültürü şişesi kuluçkaya yatmaktadır. NOT: Most laboratuar ve kültür adapte hatları standart koşullar altında kültür bakımı çok kolaydır. Büyüme oranını korumak için farklı parazit aşamaları senkronize etmek için kullanılabilecek aşağıda tarif edildiği basit bir teknik vardır. </li><li> Aşağıda açıklandığı gibi ince bir kan yayma hazırlayın ve bir ışık mikroskobu altında parazit olgunlaşma inceleyin. </li></ol> 3. İnce Kan Film Slayt Hazırlama <ol><li> Düz bir yüzeye oturan bir buzlu cam slayt bir ucunda kan yaklaşık 10-15 ul yerleştirin. </li><li> Kan eşit ikinci slayt kenarına yayılmış kadar ikinci bir slayt kenarı ile kan damla dokunun. </li><li> Ilk slayt üzerinde çok fazla baskı uygulamadan, hızlı fakat nazikçe, açısı 45 ° de ikinci slayt tutarken, eşit yayılır kan ince bir film yapmak için ilk slayt boyunca kan kaydırın. Hava kuru. </li><li> 10 saniye metanol içinde slayt batırın. Hava kuru. </li><li> 2% Giemsa st slayt DipEn az 10 dakika boyunca Ain. Su temiz çalışır kadar yoğun durulayın. Hava kuru. </li><li> Bir ışık mikroskobu üzerinde 90-100x yağ emülsiyonu lens kullanarak slayt inceleyin </li></ol> 4. Aseksüel Aşamaları saflaştırılması ve Senkronizasyon Olgun P. arıtma falciparum pRBC topaklanma testi için gerekli bir adımdır. Gerçekten de, sadece olgun parazitler ilgili ligandları ifade edilen ve enfekte olan eritrositlerin yüzeyinden çıkıntı vardır, bu yaşam döngüsü aşamada olduğu gibi trombosit reseptörlerine bağlanma yeteneğine sahiptir. P. eşeysiz aşamaları arındırmak ve senkronize etmek için çeşitli yöntemler vardır falciparum: Geç eşeysiz aşamalarında Percoll degrade 19 ile zenginleştirilmiş olabilir; 20 sıralama veya jelatin sedimantasyon 21 protokolünü kullanarak manyetik hücre burada açıklanan.. Sorbitol-senkronizasyon (hiçbir n halkaları olgun aşamalarında elde etmek için 24-26 saat kültüre sonra, halka aşamaları 22 için seçer) jelatin yüzdürme gerçekleştirmek için eed. 4.1 Plasmagel Flotasyon Plasmagel flotasyon yoğun halka formları ve rozet dibine çöker ise daha düşük ağırlık çözüm kalmasını eritrositler knobbed seçmek için jelatin benzeri çözüm kullanır. Bu teknik, olgun bir sahne-enfekte olan eritrositlerin% 90 saflıkta kadar verir ve alan ve laboratuar izolatlarının her ikisi için de kullanılabilir. Bununla birlikte, daha önce belirtildiği gibi, yüzdürme plasmagel rozetleme pRBC yanı sıra, yüksek frekanslı rozetleme ile bu örneklerde daha düşük bir topaklanma frekans neden immatür aşamalarını ortadan kaldırır. Topaklanma trombositler tarafından nakline bağlama aracılı ise rozetlenmesini pRBC ve enfekte olmayan eritrositlerin bir etkileşim olduğundan, ancak, plasmagel flotasyon sonra rozetleme pRBC yokluğunda topaklanma testi etkilemez. Bu iki özellikleri dahil ligand farklıdır; özellikle rozetlenmesini aracılık bulaşmamış eritrositler üzerinde reseptör CR-1 tamamlayacak ile.<ol><li> ° C bir su banyosunda 37 ön ısıtılması Gelofusine çözeltisi ve serum / Albumax II içermeyen aracı. </li><li> 5 dakika boyunca 370 x g&#39;de oda sıcaklığında santrifüj ile temiz bir steril 15 ml tüp ve pelet hücreleri kültürü aktarın. </li><li> Süpernatan dikkatle aspire şekilde Gelofusine ve proteinsiz ortamda bir eşit hacmi içinde pelet ve süspansiyon hücreleri bozmamaya. </li><li> Steril bir 15 ml tüp karışımı aktarın ve net bir sınır bir üst ve alt düzeyi arasında görülebilir kadar 37 ° C inkübatör 15-20 dakika veya bekletin. </li><li> Dikkatlice yeni bir steril 15 ml tüp üst katman aktarmak ve taze RPMI 10 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 370 x g santrifüj ve dikkatle supernatant atın. </li><li> Ince kan smear ile parasitaemia ve gelişimsel aşamada değerlendirmek ve bölüm 4 açıklandığı gibi bir ışık mikroskobu altında inceleyin. </li></ol> NOT: enfekte eritrosit dependi 60-90% arasında Olgun pRBC aralığıkültürünün ilk parasitaemia üzerinde ng. Olgun parazitler yüksek oranda için, ≥ 10% bir başlangıç ​​parasitaemia ile kültürler kullanın. 5. Testi topaklanma <ol><li> 1 plasmagel yüzdürme sonra elde pRBC süspansiyon saymak ve ayarlamak için bir Neubauer en haematocytometer kullanın x 10 8 ul / pRBC. </li><li> Yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içinde, 20 mg / toplam hacminin% 10 ml son konsantrasyon ile PRP% 5 hematokrit, akridin de tekrar süspansiyon pRBC. Bunun yerine akridin portakal, parazit kültürleri kullanımdan önce 5 dakika boyunca 25 mg / ml etidyum bromür ile boyanmış olabilir. 200 ul reaksiyon karışımı örneğin, 10 ul olgun pRBC, 300 x 10 3 trombosit / sağlıklı donörler ya da 150 x 10 3 trombosit / SM hastaların ul ve proteinsiz ortamda 170 ul ikinci PRP ul 20 ul ekle. NOT: trombosit oranı: pRBC son reaksiyonlar olarak 20:1 olduğunu. Maxim izin verir gibi bu önemlidirum bir numunenin topaklanma frekansı tespit edilmesi. Daha az trombosit kontrollerde eklenirse o zaman tüm topaklanma nakline gelme şansına sahip olabilir değil. </li><li> Nakline topaklanma trombositlerin rolünü tespit etmek için enfekte olmamış kırmızı kan hücreleri ve PRP ve PPP ile pRBC, aynı şekilde aşağıdaki kontrolleri hazırlamak. </li><li> Bir 1.5-2.0 ml konik vidalı kapaklı flakon süspansiyonu aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 10-12 rpm&#39;de haddeleme ile nazik çalkalama altında şişe yerleştirin. </li><li> Bir bardak kayma ve floresan altında incelemek ile kaplayın, pRBC 10 ul pipetleme tarafından hazırlanan ıslak-slayt ± bir cam slayt trombosit karışımı ile küme oluşumu olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Numune 120 dakikalık bir toplam 15-20 dakika aralıklarla yapılabilir. Bir yığın üç veya daha fazla enfekte eritrositlerin bir toplam olarak kabul edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Saul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variant+surface+antigens+on+malaria-infected+red+blood+cells.">The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells.</a> Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).</li><li>Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+pathogenesis.">Malaria pathogenesis.</a> Science. 264, 1878-1883 (1994).</li><li>Newbold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-specific+adhesion+and+clinical+disease+in+Plasmodium+falciparum.">Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).</li><li>Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+study+of+the+pathology+of+fatal+malaria.+Evidence+for+widespread+endothelial+activation+and+a+potential+role+for+intercellular+adhesion+molecule-1+in+cerebral+sequestration.">An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration.</a> Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).</li><li>Fried, M., Duffy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Plasmodium+falciparum+to+chondroitin+sulfate+A+in+the+human+placenta.">Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta.</a> Science. 272, 1502-1504 (1996).</li><li>Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.+falciparum+rosetting+mediated+by+a+parasite-variant+erythrocyte+membrane+protein+and+complement-receptor+1.">P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1.</a> Nature. 388, 292-295 (1997).</li><li>Udomsangpetch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+-infected+erythrocytes+form+spontaneous+erythrocyte+rosettes.">Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes.</a> J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).</li><li>Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+Plasmodium+falciparum+var+gene+implicated+in+malaria+in+pregnancy.">Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy.</a> J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).</li><li>Biswas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+uses+gC1qR/HABP1/p32+as+a+receptor+to+bind+to+vascular+endothelium+and+for+platelet-mediated+clumping.">Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping.</a> PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).</li><li>Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+accumulation+in+brain+microvessels+in+fatal+pediatric+cerebral+malaria.">Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria.</a> J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).</li><li>Wassmer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+from+Malawian+patients+with+cerebral+malaria-possible+modulation+in+vivo+by+thrombocytopenia.">Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia.</a> J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).</li><li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor.">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422 (2011).</li><li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children.">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).</li><li>Arman, M., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+affect+the+outcome+of+Plasmodium+falciparum+platelet-mediated+clumping+assays.">Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays.</a> Malar. J. 7, 243 (2008).</li><li>Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombocytopenia+in+malaria+with+immunoglobulin+(IgM)+changes.">Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes.</a> Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).</li><li>Jy, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregates+as+markers+of+platelet+activation:+characterization+of+flow+cytometric+method+suitable+for+clinical+applications.">Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications.</a> Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).</li><li>Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection-induced+thrombocytopenia.">Infection-induced thrombocytopenia.</a> Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).</li><li>Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+humoral+immune+response+in+Plasmodium+falciparum+malaria.+II.+IgG+subclass+levels+of+anti-P.+falciparum+antibodies+in+different+sera.">Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera.</a> Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).</li><li>Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> MACS. 4, 7-8 (2000).</li><li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation.">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand.">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria.">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li><li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation.">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li><li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma:+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field.">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz doğrudan alanında klinik izolatlarının pRBC incelemek için kullanılan bir Platelet dolayımlı topaklanma testi tanımlamışlardır. Platelet dolayımlı topaklanma, S., karakteristik bir davranış falciparum&#39;un klinik izolat, CD36 bağlayıcı izole 12,23-24 sık ayrı bir yapıştırıcı fenotipi olarak tespit edilmiştir. 1) P. in vitro topaklanma fenotip güçlü: Biz üç ana noktaları belirlemek için bu testte kullanmış falciparum hastalık şiddeti ve tanı 2) CD36, 3 ile birlikte trombositler üzerinde topaklanma yeni reseptör P-selektin mediaties) CM hastalarda mevcut trombositopeni derecesi ile ilişkilidir Malavili çocuk izole içinde pRBC kümeleri daha da oluşumunu sınırlamak için yeterlidir in vitro 12. Topak oluşumu trombositlerin katılımı bölüm 6&#39;da tarif edildiği gibi bir ıslak-preparat hazırlama incelenerek gösterilmiştir. Trombositler yüksek hızda santrifüj ile TZP izole edilebilirkan grubu antijenik reaksiyonları en aza indirmek amacıyla, bununla birlikte, aşırı kullanımdan kaynaklanan ve yüksek hızlı santrifüj ile erken trombosit aktivasyonu en aza indirmek amacıyla bütün PRP kullanılır. Trombosit aktivitesi zayıf trombosit agonistleri, epinefrin veya 26&#39;da belirtildiği gibi, adenosin difosfat (ADP) 25 kullanılarak platelet agregasyonu testi ile ölçülebilir. Daha önce zayıf bir şekilde karakterize edilmiştir, tahlilin çeşitli yönleri, PRP kaynakları ve deney sonucunu kan antijen gruplarının etkisi seçiminin önemini bunlardan biri bulunmaktadır. Biz kan grubu O olan bireylerden PRP hazırlanan + ve bazı ilaç trombosit davranışını etkileyebilir gibi kan çizilir önceki son 7-10 gün içinde herhangi bir ilaç almamıştı. Başarı topaklanma etkileyebilecek diğer faktörler pRBC hematokrit, parasitaemia düzeyleri ve topaklanma testinin süresini içerir. Yüksek hematokrit ve trombosit ortak kullanılmasıbu küme gerçekten bir yığın olan ya da yoğun 15 dolu olduğu için olmadığını çok fazla hücre sadece birlikte oturan olup olmadığını söylemek zor olacaktır unt. Topaklanma da genellikle uzun inkübasyon süreleri ile artar. Bu topaklanma çalışmalar tasarlarken dikkat edilmesi gereken tüm yararlı kurallar vardır. Farklı klinik gruplarından örnekler bunu yapmak mümkün olup olmadığını paralel aynı donörden TZP kullanarak analiz edilebilir, ancak bu alanda siteleri gibi sınırlı kaynak ayarları transfüzyonu havuzu genellikle sınırlı olduğunu bulmak. Bu tahliller standardize etmek için tek bir O + verici olması zordur. Bu nedenle mümkün olan her yerde kan grubu uyumluluğu sağlamak için çeşitli O + bağış tespit. Kan bağışı bu yükü sadece bir bireysel girmemektedir birden çok donör kullanılması da büyük örnekleri boyutlarda durumlarda yararlıdır. Tek bir pe ise 15-20 dk Örnekleme noktaları çok daha mümkün olanrson ıslak-slayt hazırlıkları için izin ve üst üste örnekleme süreleri olmaksızın tahlil kinetik performans, deneyleri yürütüyor. Mikroskobik verilerin çoğu görsel ve biraz amacı, bu nedenle, hücre sayımı bir fazla kişi tarafından doğrulanır önemlidir. Bu durumda, her seferinde bir numune işleme kişisel etkinliğine bağlı olarak 3-4 numune bir gün arasında tam bir analiz izin verebilir. Platelet dolayımlı topaklanma klinik ve laboratuar izolat her ikisini de kullanarak gerçekleştirilebilir. Laboratuvar hatları için, CD36 bağlama parazit topaklanma frekansları en üst düzeye çıkarmak için kullanılır önerilir. Tahlil, örneğin rozetleme veya pRBC bağlayıcı, bu fenotip bir anlaşılamamıştır ve incelenen yönü aracılık edebilir, trombositlerin reseptörlerinin çalışma sağlayacak inhibisyon deneyleri topaklanma olarak kullanılan diğer aglütinasyon deneyleri ile akuple edilebilir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

Plasmodium falciparum sıtma enfeksiyonu ciddi bir çoğunluğu neden olur. Serebral sıtma (CM) altında yatan patofizyolojik mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve çeşitli hipotezler P. tarafından mikrodamarlar mekanik tıkanıklığı da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür falciparum-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC). Gerçekten de, yaşam döngüsünün içi eritrositik aşamasında, S. falciparum RBC membran üzerine yapışkan özellikleri değişen yüzey antijenleri ihraç ederek enfekte eritrosit yüzeyine değiştirmek için eşsiz bir yeteneği vardır. Bu post-kapiller venüllerde 1 mikrovasküler astar endotel hücrelerine yapışma birden fazla doku ve organlarda pRBC ihtiyati haciz sağlar. Böyle yaparak, parazitin olgun formları deforme enfekte eritrositlerin dalak boşluğu önlemek 2 ve daha uygun bir düşük oksijen basıncı 3 çevreleri kısıtlamak. Bu SEQUEST bir sonucu olarakrasyon, sadece olgunlaşmamış aseksüel parazitleri ve periferik kan tespit edilebilir gametocytes olduğunu. Mikrovasküler yatak üzerinde ifade çok sayıda ev sahibi reseptörlerine olgun pRBC bir Cytoadherence ve haciz şiddetli ve komplike olmayan hastalık ortaya çıkar. Ancak, kanıt birkaç satır sadece belirli yapışkan fenotipleri sıtma ciddi patolojik sonuçlar ile ilişkili olması muhtemel olduğunu göstermektedir. Bu tür özel ana parazit etkileşimleri bir örneği, belirli bir yapışma özelliklerine sahip pRBC bağlayıcı desteklemek için hücreler arası yapışma molekülü-1 kabiliyeti 4,5 serebral malarya gelişimi ile bağlantılı olmuştur in vitro olarak gösterilmiştir. Plasenta da chondrotin sülfat ile, sıtma ile enfekte gebe kadınlarda tercihli pRBC birikimi bir site olarak kabul edilmiştir bir sinsityotrofoblastlarda üzerinde ifade bu hat ana reseptör 6 olarak plasental intervillöz alanı. PRBC t rozetlenmesitamamlayıcı reseptör 1 (CD35) 7,8 ile o bulaşmamış eritrosit de ağır hastalık 9 ile ilişkilendirilmiştir. En son anlatılan S. biri falciparum&#39;un cytoadherence fenotipleri in vitro trombosit aracılı topaklar oluşturmak için pRBC kabiliyetidir. Bu tür pRBC kümeleri oluşumu CD36, trombosit yüzeyinde ifade edilen bir glikoprotein gerektirir. Endotel hücreleri ve trombositler de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde ifade başka bir insan reseptörü gC1qR/HABP1/p32, aynı zamanda kümeleri 10 oluşturmak için trombositler üzerinde pRBC yapışmasını kolaylaştırmak için gösterilmiştir. In vivo olarak oluşur topaklanma belirsizliğini koruyor, ancak CM 11 öldü Malavili çocukların beyin mikrovasküler açıklanan trombositlerin önemli birikimi için sorumlu olabilir olsun. Buna ek olarak, klinik yeteneği in vitro olarak gelme kültürleri izole doğrudan Malawi&#39;li 12 hastalığın şiddeti ile bağlantılıydı </sup&gt; Ve Mozambik hasta 13, (olmasa da Malili 14). Kötü karakterize pRBC topaklanma fenotip çeşitli yönleri ile, bu konuda mevcut çalışmalar standart bir prosedür takip değil. Bunun nedeni tahlil 15 doğasında bilinen yüksek değişkenliğin önemli bir konudur. Burada, P. in vitro trombosit aracılı clumping için bir yöntem sunar diğer gruplar için tutarlı bir yöntem için bir platform sağlamak ve gelecekteki çalışmalarda bu fenotip soruşturmada sınırlamalar konusunda bilinçlendirilmesi umuyor ile falciparum. Malavi merkezli olmak, biz yeni toplanmış klinik izolatları dondurulması için gerek kalmadan fenotip için incelenebilir avantajı ile, özellikle sınırlı bir kaynak ayarı için tasarlanmış bir protokol sağlar.

Yaklaşık% 70 P. olgun aşamaları kullanarak bir Platelet dolayımlı yığın testi için bir örnek plasmagel flotasyon ile zenginleştirmeden sonra falciparum, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Bir yığın üç veya daha fazla enfekte eritrositlerin bir toplamıdır. Akridin turuncu veya etidyum bromür ile boyanarak floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir olabilir. Etidyum bromür kırmızı 493 nm bir uyarma maksimum ve rodamin boyalar benzer 620 nm emisyon maksimum (, sahipken akridin turuncu, 502 nm dalga boyunda bir uyarım maksimum ve 525 nm (yeşil) bir emisyon maksimum, floresein için spektral benzer .) Bu noktalar gibi hücre yığınlar olarak ve floresan altında görünür ışık altında, normal olarak Kümelenmeye kolayca mikroskop altında tespit edilir, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi (sırasıyla akridin turuncu ve etidyum bromid boyalarla boyanmış zaman yeşil ve kırmızı akridin oranj kullanılarak 30 dakika zaman noktasında .) Kümeleri büyük, daha büyük hücre agrega un görünürder normal ışık ve yeşil ya da kırmızı altındaki en noktalar büyük ilgili boyalar için floresan. Boyalar hedef DNA ve bu nedenle leke çekirdekleri, trombosit ve bulaşmamış RBC çekirdeklerin onların eksikliği nedeniyle floresan mikroskop altında tespit olmadığından. 4.7 küçük pRBC kümeleri Rastgele oluşumu ± 1.6 nakline / yığın 30 dakika sonra ortaya çıkar. Yığın boyutunu önemli ölçüde çok sayıda pRBC / görsel sayılır olamazdı yığın içeren bazı kümeleri ile 120 dakika inkübasyondan sonra&gt; 15 pRBC / kümeleri bir ortalama artırır. Enfekte hücre sayısı çift tahlillerinde sayılır yığıntı / 1,000 enfekte olmuş hücrelerde mevcut gibi topaklanma fenotip sıklığı hesaplanır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneme topaklanma için iş akışı. Trombosit rICH ve fakir plazma (A) ve S. falciparum ile enfekte eritrosit kültürü (B) topaklanma testi (C) hazırlanmış ve daha sonra birleştirilir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Şekil 2. P. ile enfekte eritrositlerin topaklanma falciparum laboratuvar izole. 0 zamanında HB3 oluşturduğu kümeleri, 30 ve 120 trombosit açısından zengin plazma dakika (A) ve trombosit kötü plazma (B) kötü küme oluşumu. Testi Sınırlamalar Özellikle trombosit fonksiyonu ya da sonucu etkiler etkiler ve bunların çoğu zaten Arman ve Rowe 15 vurgulanmıştır sınırlamalar vardır. Burada differe de karşılaşılabilecek olası sorunları bazı sözTestin nt aşamaları: <ol><li> In vitro kültür klinik izolatlar adapte bazen uzun kültür süreleri topaklar oluşmasına izin vermek için yeteri kadar yüksek parasitaemia elde etmek için gerekli olan bir sorun olabilir. P. yüksek antijenik değişim oranları falciparum, kültür-adapte parazitin yapışkan fenotip kültüründe uzun zaman sonra orijinal bulaşmasını parazit nüfusun yansıtmıyor olabilir. </li><li> Kan grubu antijenleri bağlı olarak spesifik olmayan aglütinasyon önlemek için, trombosit vericisi aynı tahlilde kullanılan klinik izolatları veya evrensel verici kanı antijen grubu O-el ile kan grubu antijeni ile uyumlu olmalıdır. Ancak, kan grubu bireyler gibi Malavi gibi Afrika sitelerinde nadir O-ve bu nedenle yaygın olarak kullanılan trombosit kan grubu O + vericilerden elde edilen ve kan grubu için uyumlu olmak zorunda. </li><li> Islak bir slayt hazırlanması kümeleri sayma c olarak görüntü yakalama için hantal ve zorluarşın sürekli hareket halindeler. Genellikle, pRBC kapak kayma kenarlarında birikir ya da kolayca gerçek kümeleri ile karışabilir &quot;yanlış&quot; kümeleri oluşturan birbirine yapışma eğilimi gösterirler. Hücre hareketini azaltmak için, analizden önce oda sıcaklığında 15 dakika süreyle sedimente hücreleri sağlar. </li><li> Topaklanma testi zaman duyarlıdır ve bu nedenle sadece bir örnek en iyi doğruluk için her seferinde kişi başına analiz edilmesini sağlar. Iki farklı örnek için zaman örnekleme noktalarının kolayca aynı anda birden fazla numune taşıma eğer örnekleri arasında uyumsuz örnekleme zaman noktalarında çıkan, çakışabilir. Bu gibi durumlarda, sofistike yazılım kantitatif yığın boyutlarını hesaplamak olabilir ya da alternatif olarak hücre-spesifik antikorlar kümeleri bileşimini analiz etmek için kullanılabilir. Bu testte kullanılması muhtemel olduğu bu teknikleri büyük ölçüde kaynak kötü ortamlarda, verilerin önemini artırmak olsa da, bu tür teknikler ve ekipman hazır değildir. </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Bu yöntem, Platelet dolayımlı topaklanma fenotip inceler<em&gt; Plasmodium falciparum</emKlinik izolatlarında&gt; ile enfekte eritrositler (pRBC). Bu, trombosit açısından zengin plazma ve pRBC bir süspansiyonu izole edilmesi ve co-kuluçkaya yatırarak gerçekleştirilir.

Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü<em&gt; Plasmodium falciparum</emBir kaynak Poor Setting&gt; ile enfekte Eritrosit

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K Görüntüleme.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. Bu yöntem, Platelet dolayımlı topaklanma fenotip inceler Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositler (pRBC). Bu, trombosit açısından zengin plazma ve pRBC bir süspansiyonu izole edilmesi ve co-kuluçkaya yatırarak gerçekleştirilir.

Video: A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü<em&gt; Anofel</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Ayrılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla&gt; Geç Evre-enfekte Eritrositler

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.