Name: hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins
Uploaded: 2015-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins at JoVE.com

This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

Parazit Hücre Kültürleri 1. Hazırlık, Parazit Peletleri Koleksiyonu <ol><li> 1 L RPMI-1640 tozun 10 g, gentamisin sülfat, 66 mg, 2 g sodyum bikarbonat, 5.9 g HEPES tamponu, 50 mg hipoksantin ve 3.8 g dekstroz eklenerek RPMI-1640-HEPES ortamları hazırlamak steril dH 2 O 1 L damıtılmış su içinde her türlü toz çözünene kadar Tablo manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 0.22 mikron filtre kullanarak medya mikro filtrasyon gerçekleştirin. Steril şişelerde medyayı saklayın. </li><li> Bulaşmamış (taze) yıkayın RPMI kullanarak A + eritrositleri yazın. Eritrositlerin% 5 hematokrit (9.5 mi,% 10 RPMI + insan serumu içinde yıkandı, taze eritrositlerin 0.5 ml) hazırlayın. </li><li> % 15 insan serumu + RPMI (insan serumu ve 15 ml RPMI 85 mi) parazitlerin ekimi başlatmak için yapın. % 10 insan serumu ve RPMI (insan serumu ve 10 ml RPMI 90 mi), kırmızı kan hücreleri parazitlerin kültürlenmesini devam edin. </li><li> Kültür P. falsiparum (3D7 ve FCR-3 suşları) tip% 5 ve% 20 hematokrit parazitemya petri veya 75 cm 3 kültür şişesi A + insan eritrosit. Trager ve Jensen mum kavanozu 26 yöntemine göre, in vitro olarak kültür muhafaza edin. Alternatif olarak, kültürler% 9.5 CO2 ve% 3.4 N2 gazı muhafaza 37 ° C&#39;de inkübatör içinde korumaktadır. Kültür P. falciparum&#39;un RPMI 1640-HEPES ortam,% 10 insan serumu ile takviye edilmiştir. </li><li> P. senkronize % 65 Percoll kültürüne (Percoll + insan serum olmadan RPMI-1640 içinde 35 mi, 65 ml) ilave edilerek falciparum kültürü 27 konsantre edilir. </li><li> 3 kat sonuçlanan 5 dakika 2500 xg&#39;de Percoll&#39;un kültür konsantresini santrifüjleyin. Dikkatle, bir transfer pipet kullanarak aseptik koşullarda 27 altında ayrı bir tüp içine orta tabaka transferi schizontsun izole. </li><li> 5 dakika boyunca 7500 x g&#39;de santrifüjleme ile, fazla Percoll temizlemek için iki kez% 10 insan serumu + RPMI-1640 ile izole edilmiş kültürleri yıkayın. DiSüpernatan, aseptik koşullar altında 27 her scard. </li><li> Senkronize P. kültürleme Devam % 10 insan serumu + 27 RPMI-1640 falciparum şizont. </li><li> 10 mM Tris pH 8.8 ile Plasmodium enfekte olan eritrositlerin tedavisi ve 15 dakika 23 15000 xg&#39;de santrifüjleme ile schizontsun toplayın. Peletlere proteaz inhibitörü (aprotinin) içinde 5 ul ilave edildikten sonra -70 ° C&#39;de saklayın, parazit topakları. Protein ekstre etme, genomik DNA izolasyonu ve RNA izolasyonu için parazit topakları kullanın. </li></ol> 2. plazmid vektörünün hazırlanması <ol><li> P. genomik DNA izole yaklaşık% 20 parazitemya kültürlerinden hazırlanabilir falsiparum şizont peletler. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpü içinde peletlere pH 7.6 olan 10 mM Tris-HCI, 50 mM EDTA, pH 8.0,% 0.1 SDS ve 1 mg / ml proteinaz K, 600 ul ekle 26 G iğne takılı bir 1 ml şırınga ile pelet homojenleştirin. Şırınga doldurma AlternatifPelet karışımı bir mikrosantrifüj tüpü içine boşalma 20 kez. Bir 50 ° C su banyosu içinde tüp içeren homojenat O / N inkübe edin. </li><li> P + C, 600 ul (300 ul fenol ve kloroform 300 ul) homojenize edilmiş pelet eklenerek, kloroform (P + C) çıkarma - fenol gerçekleştirin. Cap tüpü sıkıca ve tüp uçtan uca ters çevirerek kuvvetlice karışımı sallayın. 2 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin ve tüp yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine bir mikropipet kullanılarak, üst sulu çözelti toplar. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Aşama 2.1.2 yeni bir tüp içinde, sulu tabaka kloroform 600 ul ekle. 2 dakika için 14,000 x g&#39;de 10 saniye ve santrifüj tüpü vorteksleyin. Bir mikropipet ile üst sulu tabaka ölçün ve yeni bir mikrosantrifüj tüp transfer. </li><li> Sulu, yumurtlama (sulu katman, 300 ul 5 M sodyum asetat pH izopropanol 5.5 + 330 ul, 30 ul ise), 5 M sodyum asetat pH 5.5 ve 0.1 hacim izopropanol ile 1 hacim eklemeadım 2.1.3 den er. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin tüpü. </li><li> DNA pelet çökeltmek için 10 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. Süpernatant atılır ve DNA fazla tuzu çıkarmak için% 70 etanol içinde 100 ul (etanol içinde 70 ul ve dH 2 O 30 ul) ile pelet yıkayın. -20 ° C&#39;de dH 2 O 50 ul saklayın DNA arasında değişir. </li><li> P. yükseltilmesi için elle ileri Tasarım ve yazılımı kullanarak ters primerleri veya Tablo 2&#39;de gösterildiği gibi, falsiparum genleri PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 ve PF3D7_0114100 önce proteome çalışmaları sentezleme plasmidi pT7CFE1-CHIS&#39;in çoklu klonlama sitelerinin gen dizilerinin klonlanması izin vermek için uygun sınırlama siteleri ile 16,18 tespit etmesidir. </li><li> Ilave bir 50 ul reaksiyon karışımı yapmak; Izole edilmiş P. 5 ul falsiparum genomik DNA&#39;sı, 10x tampon 5 ul, MgCl2 5ul, ileri primer, 1.5 ul, 1.5 ulters primer, T7 DNA polimerazı 0.5 ul dH 2 O 31.5 ul ve denatürasyon için 8 dakika boyunca 94 ° C &#39;de, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yerine, uzatma 1 dakika 30 saniye için 50 ° C, 9 72 ° C Tablo 1 &#39;de gösterilen genlerin amplifiye edilmesi için tavlama ve renatürasyon için min. </li><li> % 1 agaroz jeli (agaroz 1 g Tris asetat EDTA, 100 ml (TAE) tamponu) 32 ile ayrı ayrı PCR ürünleri. </li><li> Agaroz jelinden PCR ile çoğaltılan DNA bantları kesin bir DNA jel özütleme spin kolon DNA ihtiva eden jel dilimleri yerleştirmek ve 5 dakika boyunca -20 ° C&#39;de dondurun. 5 dakika için 14,000 x g&#39;de donmuş jel dilimlerinin ve santrifüj izopropanol 100 ul ekle. </li><li> Mikropipet kullanılarak sulu akış yoluyla adım 2.5 arasında bir toplama tüpü içinde, süzüldü ölçülür ve yeni bir tüpe aktarılır. 5 dakika için 14,000 x g&#39;de 5 M sodyum asetat ve santrifüj 0.1 hacim ekleyin. Süpernatantı atın ve inci dH 2 O 10 ulE DNA pelleti. </li><li> Plazmid 3 ul ve her bir tüpe, PCR gen ürünlerinin 5 ul ekleyerek iki ayrı tüplerde pT7CFE1-CHIS ekspresyon vektörü ve (2.6) ile birlikte saflaştınlmış DNA fragmanlarının Digest. Her bir tüpe belirli bir kısıtlama enzimleri 1 ul reaksiyon tampon maddesi, 2 ul ve dH 2 O 14 ul ekle </li><li> Sindirilmiş plasmid 3 ul, sindirilmiş DNA fragmanlarının 5 ul 10x ligaz tampon maddesi, 2 ul, ligaz 1 ul bir mikrosantrifüj tüpü içinde dH 2 O 9 ul ekle. 12 ° CO / N inkübe. </li><li> PH 5.5 ve 2 hacim etanol ile 3 M sodyum asetat ve 0.1 hacim ekleme adımında 2.14 tüpe (daki bağlama borular hacmi ise 20 ul 3 M sodyum asetat, etanol içinde, + 44 ul 2 ul). İyice karıştırın ve 15 dakika boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 15 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. Dikkatle pelet bozmadan mikro pipet kullanarak süpernatant kaldırmak. </li><li> % 70 etanol, t, 100 ul ekleadım 2.10 den pelet o. 5 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. Süpernatantı çıkarın ve atın. DNA pelet nükleaz içermeyen su, 10 ul ekle. </li></ol> Vitro İnsan Hücre Özgür İfade Sistemde Kullanılması 3. Protein Ekspresyonu <ol><li> Rekombinant pT7CFE1-CHIS plazmid DNA, 2 ul 5x transkripsiyon tamponu 4 ul NTP karışımı 4 ul, T7 RNA Polimeraz 2 ul ve nükleaz içermeyen su 8 ul 2-adım için ölçülerek transkripsiyon karışımından 20 ul hazırlanması DNA şablonları kullanarak Vitro Protein Ekspresyonu İnsan. Mikrosantrifüj tüpü içinde karıştırın ve bir su banyosunda 30 ° C&#39;de 75 dakika inkübe edilir. </li><li> Transkripsiyon karışımı 2 ul almak ve HeLa hücre lisatı, 12.5 ul, yardımcı proteinler 2.5 ul tuz çözeltisi A 1 ul, amino asitler 0.5 ul Met, amino asitler 0.5 ul ihtiva eden için karışım 23 ul eklemek Leu, 181; RNaz inhibitörü l, enerji karışımları 1.25 ul ve nükleaz içermeyen su 3.75 ul. </li><li> 90 dakika boyunca 30 ° C &#39;de aşama 3.2 için karışımı inkübe edin. Mağaza -20 ° C&#39;de ürünleri çevrilmiştir. </li><li> 1-adım için rekombinant pT7CFE1-CHIS plasmid DNA 3 ul, nükleaz içermeyen su, 2 ul reaksiyon karışımı 5 ul HeLa lizat 12.5 ul ve yardımcı proteinlerinin 2.5 ul ekleyerek transkripsiyon ve çeviri karışımı 25 ul hazırlanması DNA şablonları İnsan Coupled IVT Protein Ekspresyonu. </li><li> 30 ° C&#39;de 90 dakika ila 6 saat süreyle için adım 3.4 reaksiyon karışımı inkübe edin. Çeviri ürünleri de Mağaza -20 ° C. </li></ol> Sentezlenen rekombinant proteinler, 4. saflaştırılması <ol><li> Bu saflaştırma karışımına 100 ul yapmak için ürünün 25 ul 1x saflaştırma tamponunda 75 ul ekle. </li><li> Saflaştırma mikst 100 ul nikel kenetleme reçinesi 100 ul ekleure. Yıkama Ni-reçine iki kez dH 2 O 300 ul ve bağlayıcı tampon 300 ul ekleyerek. Aşırı etanolü ortadan kaldırmak için 1 dakika için 14,000 x g&#39;de reçine ve santrifüj yeniden askıya. </li><li> Aşama nikel kenetleme reçinesi 4,2-100 ul saflaştırma karışımına 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 60 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> 1 dakika boyunca 14.000 xg&#39;de karışımı Santrifüj ve &quot;akışı&quot; olarak etiketlenmiş Taze bir tüp içine süpernatant toplamak. </li><li> 1x yıkama tamponu içinde 100 ul (20 mM imidazol, 250, pH 8 mM NaH 2 PO 4, 2.5 M NaCl ve dH 2 O) ile yıkayın reçinesi. 1 dakika boyunca 14.000 xg&#39;de Santrifüj ve &quot;yıkama&quot; etiketli taze tüp içinde süpernatant toplamak. Adımı yineleyin 4.5 kez. </li><li> 1x elüsyon tamponu 100 ul ekle (pH 8.0, 100 mM imidazol, 250 mM Na-2 PO 4, 2.5 M NaCI ve DH 2 O) reçineye ve 15 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin. İki kez elüsyon adımı yapın. Herzaman &quot;elüat&quot; taze mikrosantrifüj tüpleri ve etiket içine süpernatant toplamak. </li><li> Aşama 4.5 de tarif edildiği gibi yıkanmasından sonra, iki kez reçine yıkayın. Mağaza -20 ° C veya daha düşük sıcaklıklarda aracılığıyla yıkar ve elüsyon örnekleri akış. Reçine, 4 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekir. SDS-PAGE ve immunoblotting analizi için, her numune için 30 ul kullanın. </li></ol> 5. Coomassie (Bradford) Protein Deneyi 34 <ol><li> Konsantrasyon, standart sığır serum albümini (BSA) çözelti hazırlayın 20 ug / ml, 40 ug / ml (BSA içinde 20 ul karışımı (BSA (2 mg / ml) ve dH 2 O 90 ul 10 ul karışımı) (2 mg / ml) ve DH 2 O), 80 ul, 60 ug / ml ((2 mg BSA (2 mg / ml) ve DH 2 O), 70 ul, 80 ug / ml (BSA içinde 40 ul karışımı 30 ul karıştırın / ml) ve DH 2 O), 60 ul, 100 ug / ml (BSA (2 mg / ml) 50 ul ve DH 2 O) 50 ul, 160 ug / ml (BSA içinde 80 ul mix (2 mg / ml) ve dH 20 ul2 O) ve 200 ug / ml (BSA, 100 ul (2 mg / ml). </li><li> Ölçü aşama 4,7 boyunca akış, yıkama ve elüat numune 5 ul. DH 2 O. 95 ul ekleyin </li><li> Adım 5.1 ve 5.2 arasında karışımlarına Coomassie mavisi reaktif 5 ml. Sn daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir, 10 için parafilm ve vorteks Tüpleri örtün. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, Aşama 5.3 protein borular 650 nm dalga boyunda optik yoğunluk (OD) ölçün. OD okuma vs Plot konsantrasyonu protein konsantrasyonlarını belirlemek için 34. </li></ol> 6. Western Blot <ol><li> P. şizont özler 5 ul ekle falciparum, Escherichia coli 2 ul rekombinant rhOP-3 proteinler 31 belirtilmiştir, yeniden birleştirici proteinlerin 5 ul tüpleri ayırmak için afinite yöntemi kullanılarak 2-adım ve in vitro insan ekspresyon sistemlerinde 1 adım ve protein ürünleri 10 ul saflaştırılmış kullanılarak ifade edilir. </li&gt; <li> Çözündürülmüş protein örnekleri yapmak için 20 ul bir son hacim için, her bir tüpe elektroforez örnek tamponu ihtiva eden merkaptoetanol ekleyin. 2 dakika süreyle tüpleri kaynatın. </li><li> Proteinleri ayırmak için% 10 SDS-PAGE jelleri üzerine çözündürülmüş protein örneklerinin yükleyin. </li><li> 2 saat için bir yarı kuru VVestern blot odasındaki jel başına 35 mA akımda elektroforezlenerek nitroselüloz kağıda (NCP), SDS-PAGE jelleri ayrılmış proteinler aktarın. </li><li> % 2 yağsız süt ile transferi aşağıdaki Blok NCP&#39;ler. </li><li> Inkübe 1 seyreltilmiş aşağıdaki poliklonal antikorlarla NCP&#39;ler bloke: batı blotting gerçekleştirmek için% 2 süt 100; tavşan antikoru P. özgü 676. 21 falsiparum Merozoit rhoptries, P. 20, belirli fare antikorları ve P. yoelii P. özgü berghei Merozoit rhoptries antiserumlar # 685 Maurer için spesifik falsiparum parasitophorous vacuole&#39;nin proteini, SERA (serin bakımından zengin antijeni) 22 ve antikorlar217; s yarık protein KMYK-2TM 28. </li><li> 1 de NCP&#39;ler inkübe: 100 seyreltilmiş normal fare ve tavşan serumu ve SP2 miyelom hücrelerinin harcanan kültürün üzerinde yüzer (SCS) olarak negatif kontroller. </li><li> 4 ºC O / N de antikorlar ve kontroller ile NCP&#39;ler kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Blot ile yıkayın NCP 4x tampon ve yaban turpu peroksidazı (HRP) konjuge edilmiş türler, belirli sekonder antikor ile inkübe NCP suyla 1: 2,% süt 1000. </li><li> Leke tamponu ile yıkayın NCP 4x. Inkübe renk gelişimi çözeltisi ile yıkandı, NCP A + B (Çözelti A: tampon 1x Blot 50ml ekleyebilir ve H2O 2 30 ul; Çözelti B: 10 ml metanol ve 3-kloro-naftol, 30 mg) eklemek için 30 Karanlıkta min. Kolorimetrik western blot sonuçlarını analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania.+cell-free+expression+system.">Leishmania. cell-free expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li><li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+construction+of+expressed+proteomes+using+a+Leishmania+tarentolae.+based+cell-free+expression+system.">Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system.</a> PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+A+method+for+high-level+over-expression+of+Plasmodium.+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Birkholtz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+plasmodial+proteins+for+structural+studies+and+functional+annotation.">Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation.</a> Malar. J. 7, 197 (2008).</li><li>Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+P.+falciparum.+infection+with+protein+microarrays.">Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays.</a> Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Robledo, J. A., Vasta, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+from+protozoan+parasites.">Production of recombinant proteins from protozoan parasites.</a> Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).</li><li>Gowda, D. C., Davidson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+the+malaria+parasite.">Protein glycosylation in the malaria parasite.</a> Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).</li><li>Goshima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+factory+for+converting+the+transcriptome+into+an+in+vitro-expressed+proteome.">Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome.</a> Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).</li><li>Hinnebusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).</li><li>Hino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+cell-free+protein+synthesis+based+on+a+crude+cell+extract+from+Escherichia+coli.,+wheat+germ,+and+rabbit+reticulocytes.">Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes.</a> Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).</li><li>Le Roch, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+gene+function+by+expression+profiling+of+the+malaria+parasite+life+cycle.">Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle.</a> Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).</li><li>Makrides, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+achieving+high-level+expression+of+genes+in+Escherichia+coli.">Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.</a> Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).</li><li>Mehlin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+proteins+from+Plasmodium+falciparum.:+results+from+1000+genes.">Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).</li><li>Mikami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+cell-derived+in+vitro+coupled+transcription/translation+system+optimized+for+production+of+recombinant+proteins.">A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.</a> Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+rhoptry:+Enriched+isolated+from+Plasmodium.+merozoites.">Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites.</a> Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+protein+located+in+Maurer&#8217;s+clefts+underneath+knobs+and+protein+localization+in+association+with+Rhop-3+and+SERA+in+the+intracellular+network+of+infected+erythrocytes.">Plasmodium falciparum. protein located in Maurer&#8217;s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes.</a> Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium.+gene+family+encoding+Maurer&#8217;s+cleft+membrane+proteins:+Structural+properties+and+expression+profiling.">A Plasmodium. gene family encoding Maurer&#8217;s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling.</a> Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+yoelii.:+Novel+rhoptry+proteins+identified+within+the+body+of+merozoite+rhoptries+in+rodent+Plasmodium+malaria.">Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria.</a> Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+merozoite+rhoptries,+identification+of+novel+rhoptry+associated+proteins+from+P.+yoelii.,+P.+chabaudi.,+P.+berghei.+and+conserved+interspecies+reactivity+of+organelles+and+proteins+with+P.+falciparum.+rhoptry-specific+antibodies.">Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies.</a> Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+rhoptry+proteins+of+140/130/110kd+(Rhop-H)+are+located+in+an+electron+lucent+compartment+in+the+neck+of+the+rhoptries.">Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries.</a> J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

We do not have any competing financial interests in this study.

vitro insan hücre barındırmayan sentezleme sistemi ve arıtma iki adımı kullanarak proteinin başarılı bir şekilde ifadesi için önemli adımlardır: 1) başarılı bir yükseltme ve pT7CFE-CHIS plazmid vektörü içine genlerin klonlanması; 2) 30 o C RNA transkripsiyonu; RNaz inhibitör varlığında, 30 ° C&#39;de protein 3) yapıldı; 4) poliklonal ve monoklonal antikorlar kullanılarak reçine Ni ve 5 ile kaplı haplar), batı lekesi üzerinde analiz sonuçları kullanılarak afinite bazlı saf...

Sıtma araştırmada, prokaryotik ya da ökaryotik hücre bazlı sistemler kullanılarak imünojenik protein ekspresyonu, bir sorun olmaya devam etmektedir. Plasmodium genomu ve bilinmeyen post-translasyonel mekanizmalar 14,7, AT zenginliği, antikor üretimi ve aşı çalışmaları için uygun bir şekilde katlanmış ve immünojenik proteinlerini elde etmekle bağlantılı güçlükler katkıda bulunur. Escherichia coli gibi prokaryotik sistemlerde rekombinan protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Prokaryotik sistemleri, etkili, düşük maliyetli olan rekombinant proteinin yüksek verimlerinin üretilmesi ve birden çok klonlama vektörleri. E. Ev Sahipliği E. coli hücrelerini dönüştürmek için kolay ve hızlı bir şekilde hücreler büyür. Bununla birlikte, prokaryotik sistemler gibi amino asit ikamesi, post-translasyonel modifikasyon, inklüzyon gövdelerinin 24 içinde kirlenme heterojen ürünlerin ve rekombinant proteinlerin birikmesi riski eksikliği gibi sınırlılıklara sahiptir. IçindeMehlin ve arkadaşları tarafından çalışma. (2006), 1000, açık okuma çerçeveleri (ORF) olarak ifade edildi. Ifade edilen proteinlerin yaklaşık% 7 çözünen 14 idi. gözlenen çözünmeme genlerinin önyargılı doğası ve zengin genom 14 AT Plasmodium tarafından ideal kullanılan kodonların yüksek frekans kaynaklanmaktadır. Bu problemin üstesinden gelmek için bir alternatif strateji, plazmidler veya nadir kodonları ya da frekansları 3 eşleşen kodonları tanıyan tRNAs ihtiva eden konakçı hücreler kullanılarak geliştirilmiştir. Hatta bu en iyi duruma gerçekleştirdikten sonra, proteinler, çok küçük bölümleri, çözülebilir aktif 14 imünojenik olarak ifade edilmiştir. hücresiz sentezleme sistemleri, ribozom, başlatma faktörleri, uzatma faktörleri (çevirileri faktörler), tRNA ve aminoasil-tRNA sentetaz olarak transkripsiyonu ve translasyonu için gerekli olan tüm bileşenleri içerir. Hem transkripsiyon ve translasyon reaksiyonları tek aşamalı prosedür 11,29 içinde birleştirilir. transcrimRNA uygun bir miktar farklı boru 11,29 çeviri makine ile inkübe edilmeden önce ption Reaksiyon tüpü içinde gerçekleştirilir. Bu yöntemler, Plasmodium sp., Protein ekspresyonu başarılı olsa da, önemli bir dezavantajı, yaklaşık 22 saat 29 olan protein ekspresyonu için zaman dilimidir. Buna ek olarak, protokoller 29 eklenmek üzere malzeme yüksek maliyet, bileşen hazırlıkları emek-yoğun hücre lizatının hazırlıkları ve tutarsızlıklar, bu sistemler ulaşılamaz olun. Bir hücre özgür ifade sisteminin geliştirilmesi için araştırmacıların ana odak bu hızlı genetik modifikasyon, yüksek konsantrasyonlarda ve yalındır lisatı hazırlıkları 1 hızlı verim gibi faktörlere bağlıdır. Maya, memeli hücre çizgileri, bakulovirüs dolayımlı sentezleme sistemi, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum ve parazitik ekspresyon sistemleri su olarak ökaryotik sistemlerdeLeishmania olarak kanal yeniden birleştirici protein ekspresyonu 7 kullanılmaktadır. Ökaryotik sistemler filogenetik ilişkiyi paylaşmak ve bu nedenle de bu tür glikosilasyon, asilleme, disülfür bağı oluşumu, hastabakıcı etkileşimi, proteoliz ve alt hücresel bölümlendirme gibi özelliklere paylaşabilirsiniz. Ökaryotlarda protein salgılanması olayları birikmesini önlemek ve ifade sistemleri 13 toksisite azalır. bunlar, büyük ölçekli protein ekspresyonu için ve yüksek verim 4 elde etmek için uygun olan maya sistemlerinin kullanılması tercih edilir. İki P. falsiparum proteinleri PfCP-29 ve Pvs25 maya sistemi 4 kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, proteinlerin çoğu sentezinde önemli bir dezavantajı, düzensiz N ve O-glikosilasyon modelleri, uygun olmayan katlama ve doğal biçiminde 4 proteinlerin kesme oldu. Rekombinant proteinlerin sentezi için memeli hücrelerinin kullanımı, emek yoğun ve masraflı olup bustabil yeniden birleştirici hücre çizgileri 4 muhafaza etmek sive. Bu nedenle, memeli hücreleri, protein sinyalizasyon, protein etkileşimleri ve parazit konakçı etkileşimleri analiz için sınırlı kalmıştır ve DNA aşıları 4 test etmek için. Burada tarif edilen insan DNA&#39;sı ve mRNA in vitro protein ekspresyonu, hücre içermeyen sistemi 3 saat proteinleri eksprese eden bir HeLa hücre-türevli, memeli-bazlı bir sistemdir. Proteinler kimlik ve saf hale getirilmesini kolaylaştıran bir C-terminali etiket pT7CFE1-CHIS ekspresyon vektörü olan kullanılarak ifade edilir. HeLa tabanlı sistem, böylece çeviri sisteminin etkinliğinin artırılması, çeviri başlatma faktörleri ve çeviri regülatörü ile takviye edilmiştir. Proteinler hızla çevrilmiştir filtrelenmiş, belirlenmiş ve çeşitli immünolojik ve yapısal uygulamalar 15 kullanılmak üzere işlenebilir. Buğday tohumu ve tavşan retikülosit gibi ökaryotik hücre içermeyen sentezleme sistemleri şu anda var ekspresyonu için kullanılanPlasmodium proteinleri de dahil olmak üzere 11,29 ious ökaryotik proteinler. Buna ek olarak, E. E. coli göre hücre içermeyen sistemler de ökaryotik protein ekspresyonu için kullanılmaktadır 11. Tablo 1, sistemin özelliklerinin yanı sıra, protein ekspresyonu için sistemler kullanılarak kolaylığı karşılaştırarak farklı hücre serbest sentezleme sistemleri özetlemektedir. diğerlerine kıyasla insan hücresi serbest sistemi sonrası ve co-translasyonel modifikasyonlar yapmak yeteneğine sahiptir ve daha az pahalıdır. Kodon optimizasyonu da mümkündür ve bütün reaksiyonlar, 3 saat içinde uygulanabilir. HeLa sistem laboratuvar ortamında protein sentezi için ideal bir çeviri sistemidir. Diğer hücre barındırmayan sistemler üzerinde insan hücre serbest sentezleme sistemlerinin önemli bir avantajı, farklı organ ve dokularda türetilen birkaç farklı hücre hatları mevcudiyetidir. Hücresiz sistemlerin pek çok çeşidi, hücre hattı ile ilgili olarak dizayn edilebilir. özütMemeli hücrelerinden türetilen ler başka hücre özgür ifade sistemlerine göre büyük proteinleri sentezlemek için yüksek verimliliğe sahiptir. Bu hücresiz sentezleme sistemleri, aynı zamanda, mikro dizileri 30 gibi teşhis ve protein karakterizasyon uygulamalarında kullanılabilir. Popüler HeLa hücre hatları, en yaygın olarak protein 33 ekspresyonunu gerçekleştirmek için kullanılır. HeLa hücre hatları, endoplazmik retikulum post-translasyonel glikosilasyon modifikasyon aktivitesi 33 yokluğuna yol az gelişmiştir. Bununla birlikte, bu sistem, aynı zamanda, Plasmodium glikosilasyon sonrası değişikliği bir 29 yoksun olarak Plasmodium protein sentezi için yararlı olduğuna inanılmaktadır. HeLa hücre serbest transkripsiyon için protokol, ucuz, kolay uygulanabilir ve proteinlerin saflaştırılması ve daha sonraki alt akış uygulamaları için hazır, 90 dakika içinde ifade edilebilir.

<table><tbody><tr><td>2-step &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; human cell free expression system</td><td>Thermo Fisher</td><td>88856</td><td>Discontinued. Always store at -80 &amp;deg;C. Do not thaw in warm water</td></tr><tr><td>1-step &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; coupled translation system</td><td>Thermo fischer</td><td>88860</td><td>Always store at -80 &amp;deg;C. Do not thaw in warm water</td></tr><tr><td>ProBond Purification system</td><td>Invitrogen</td><td>K850-01</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Probond Nickel-Chelating Resin</td><td>Invitrogen</td><td>R801-01</td><td>Store at 4&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.</td></tr><tr><td>A+ Human Blood</td><td>Interstate Blood Bank</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

Sıtma önemli küresel morbidite ve mortaliteye neden. Hiçbir rutin aşı mevcut değildir. Bir aşının olmaması için en önemli nedenlerinden biri, uygun aşı adayları belirleme mücadeledir. Sıtma proteinleri prokaryotik ve ökaryotik hücre tabanlı ifade sistemleri zayıf düşürülmüş immünojenikliği giden uygunsuz katlama, genellikle çözünmez glıkosıle ve tabi olan kullanarak dile getirdi. buğday tohumu, tavşan retikülosit lizat ve Escherichia coli lisat hücresiz sentezleme sistemleri şu anda sıtma protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Ancak, ifade, zaman ve proteinlerin yanlış glikolizasyonu uzunluğu hala bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu &quot;in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemleri&quot; olarak adlandırılan HeLa göre hücresiz sentezleme sistemleri kullanılarak in vitro Plasmodium proteinlerin sentezlenmesini göstermektedir. 2 HeLa tabanlı cep özgür ifade sistemleri 75 dakika ve transcrib 3 ul mRNA uyarlamaked mRNA, 90 dakika proteinleri çevirmek yeterlidir. 1 adım sentezleme sistemi, bir transkripsiyon ve translasyon bağlanmış sentezleme sistemidir; transkripsiyonu ve eş için 3 saat içinde oluşur. süreci de ek enerji sağlayarak 6 saat süreyle uzatılabilir. 2 adımlı sentezleme sisteminde, mRNA, ilk transkripsiyonu ve daha sonra protein ekspresyonu için yapıldı karışımına ilave edildi. Biz sıtma proteinleri ifade açıklanmıştır; bir hidrofobik PF3D7_0114100 Maurer&#39;in Yarık - 2 transmembran (KMYKK-2TM) proteini, bir hidrofilik PF3D7_0925900 proteini ve HeLa göre hücresiz sentezleme sistemi kullanılarak protein PF3D7_1361800 ihtiva eden bir armadillonun tekrarlar. Proteinler 2-adım ve 1 adım ifadesi stratejilerini kullanan mikro hacimlerde ifade edilir. Bir afinite saflaştırma yöntemi de tarif edilir ve in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemi kullanılarak ifade edilen proteinlerin 25 ul saflaştırmak için. Protein verimi Bradford tahliliyle belirlenir ve ekspreseve saflaştırılmış proteinler Western lekesi analizi ile teyit edilebilir. Sentezlenen rekombinant proteinler, aşılar, bağışıklık ve protein dizilemesi için kullanılabilir.

Spesifik antikorlar ile reaktivite ile eksprese edilen rekombinant proteinleri Doğrulama ifade edilen proteinlerin düzgün katlanmasını teyit önemli bir ilk adımdır. Rekombinant sıtma proteinler bir adım ve in vitro insan hücre özgür ifade sistemlerinde iki adımı kullanarak ifade edildi. Rekombinant proteinler, saflaştırılmış Ni-kelat yapıcı afinite yöntemdir. Daha sonra, SDS-PAGE, ayrılmış yeniden birleştirici proteinlerin western blotting bütün Merozoit rhoptries karşı antisera kullanıl?...

Watch this Scientific Journal Video about HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins at JoVE.com

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

12.0K Görüntüleme.  Cleveland State University.  Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır. 

Video: HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Biyokimya

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Biyoloji

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of Plasmodium deposited by mosquitoes in the skin of vertebrate hosts undergoes a phase of mandatory development in the liver before initiating clinical malaria. We know little about the biology of Plasmodium development in the liver; access to the sporozoite stage and the ability to genetically modify such sporozoites are critical tools for studying the nature of Plasmodium infection and the resulting immune response in the liver. Here, we present a comprehensive protocol for the generation of transgenic Plasmodium berghei sporozoites. We genetically modify blood-stage P. berghei and use this form to infect Anopheles mosquitoes when they take a blood meal. After the transgenic parasites undergo development in the mosquitoes, we isolate the sporozoite stage of the parasite from the mosquito salivary glands for in vivo and in vitro experimentation. We demonstrate the validity of the protocol by generating sporozoites of a novel strain of P. berghei expressing the green fluorescent protein (GFP) subunit 11 (GFP11), and show how it could be used to investigate the biology of liver-stage malaria.

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is transmitted through inoculation of the sporozoite stage of Plasmodium by infected mosquitoes. Transgenic Plasmodium has allowed us to understand the biology of malaria better and has contributed directly to malaria vaccine development efforts. Here, we describe a streamlined methodology to generate transgenic Plasmodium berghei sporozoites.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

<meta charset="utf8"></head><body>Leishmania Translasyonel Ekstrakt (LTE) Üretimi için Kolaylaştırılmış Protokol

Production and Optimization of LTE, a Leishmania tarentolae Derived Cell-Free Protein Expression System for Recombinant Protein Production

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate Leishmania tarentolae, referred to as Leishmania Translational Extract or LTE. Although this organism originally evolved as a parasite of geckos, it can be cultivated easily and inexpensively in flasks or bioreactors. Unlike Leishmania major, it is non-pathogenic to humans and does not require special laboratory precautions. Another advantage of using Leishmania for CFPS is that the addition of a single antisense oligonucleotide to the CFPS, targeting a conserved splice leader sequence on the 5'-end of all protein-coding RNAs, can suppress endogenous protein expression. We provide procedures for cell disruption and lysate processing, which have been simplified and improved compared to previous versions. These procedures start with simple flask cultures. Additionally, we explain how to introduce genetic information using vectors containing species-independent translation initiation sites (SITS) and how to perform straightforward batch optimization and quality control to ensure consistent protein expression quality.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: LTE Ökaryotik Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemini Kullanarak Protein Üretimi

Leishmania Translational Extract (LTE) is a eukaryotic cell-free protein expression system derived from the single-celled parasite, Leishmania tarentolae. This optimized protocol makes LTE simple and cost-effective to manufacture. It is suitable for various applications focused on the multiparallel expression and study of complex eukaryotic proteins and their interactions.

Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate ...

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması

Yöntemler Küçük RNA'ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu

Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu

Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu