Bu protokol, plazmodium falciparum enfekte eritrositlerin fagositozunun opsonize edilip indükleme yeteneğini ölçmeye olanak sağlar. Doğal olarak parazit enfeksiyonuna maruz kalan bireylerin serumunda bulunan antikorlar ve parazit antijenleri ile bağışıklama ile indüklenenler test edilebilir. Prosedürü benimle göstermek Maiken Visti olacak, laboratuvarımdan bir teknisyen.
Bir fagositoz analizi için bir THP-1 hücre kültürü kurmak için, deneme den bir gün önce 25 santimetre kare kültür şişesi ve 2.5 kat 10 thp bir hücre kültürü orta mililitre başına beşinci hücrelere bir konsantrasyon hücreleri tohum. Deney günü, deney bloğundan en az bir saat önce, 150 mikrolitre steril 2%FBS'lik, 96 kuyulu plakaların en altına, her kuyuda PBS'de. Orta-geç evre trophozoit-enfekte eritrositler hasat ve arınma için, parazit kültür orta 10 mililitre paketlenmiş P falciparum parazit kültürü yaklaşık 1.2 mililitre hazırlamak, en az% 5 paraziti ile ve manyetik bir sütun eklemek.
50 mililitre parazit kültür ortamı ile sütunu yıkayın. Enfekte eritrositleri uzaklaştırmak için, kolonmıknatıstan çıkarın ve 50 mililitre parazit kültür ortamıyla yıkayın. Sonra, santrifüj ile enfekte eritrosittoplamak ve sayma için taze parazit kültür ortamı bir mililitre pelet resuspend.
Saflaştırılmış enfekte eritrosit süspansiyonuna 3,3 kat 10 ile ethidyum bromür içeren parazit kültür ortamında mililitre başına yedinci hücrelere, mililitre başına 2,5 mikrogramlık son konsantrasyona ayarlayın. Ardından, plakayı bir atık kabına vurarak bloklama çözümlerini 96 kuyulu bir plakadan çıkarın. Sonra bir kağıt havlu üzerinde herhangi bir fazlalık çıkarın ve ethidium bromür etiketi enfekte eritrosit süspansiyon 30 mikrolitre ekleyin ama bir iyi plakanın üst yarısında.
Boş kuyuya 30 mikrolitre parazit kültür ortamı ekleyin ve odayı ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, her kuyuya 170 mikrolitre parazit kültür ortamı ekleyin ve enfekte eritrositleri santrifüj le plakanın altına çökün. Bir atık konteyner içine plaka flicking tarafından supernatant çıkarın ve ethidium bromür etiketli enfekte eritrositler iki kez daha yıkayın, iyi başına parazit kültür orta 200 mikrolitre ile, sadece gösterildiği gibi.
İkinci yıkamadan sonra, peletleri rahatsız etmeden, her kuyudaki süpernatantın tüm hacmini dikkatlice çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Ve daha önce parazit kültür ortamında hazırlanan uygun kontroller ve test örnekleri de dahil olmak üzere 30 mikrolitre antikor çözeltisi içinde ethidium bromür etiketli enfekte eritrositleri yeniden askıya alın. Daha sonra, ışıktan korunan, 45 dakika boyunca 37 derece santigrat plaka yerleştirin.
Enfekte eritrositler opsonized edilirken, santrifüj tarafından THP-1 hücreleri toplamak, ve taze 12 mililitre pelet resuspend, önceden ısıtılmış THP-1 hücre kültürü ortamı. İkinci bir santrifüjden sonra, sayım için THP-1 hücre kültür ortamının bir mililitresinde peleti yeniden askıya alın ve hücre konsantrasyonunu THP-1 hücre kültürü ortamındaki mililitre başına beşinci hücrelere beş katına 10'a ayarlayın. Engelleme çözeltisini ikinci 96 kuyuplakasından çıkarın ve her kuyuya 100 mikrolitre THP-1 hücresi ekleyin.
Sonra, hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Opsonizasyon kuluçka sonunda, opsonizasyon plaka her kuyuya parazit kültür orta 170 mikrolitre ekleyin ve santrifüj ile plaka nın altına enfekte eritrositler tortu. Opsonize enfekte eritrositleri her kuyuda 200 mikrolitre parazit kültür ortamı ile iki kez yıkayın, ikinci yıkamadan sonra süpernatantı dikkatlice çıkarmak için çok kanallı pipet kullanın.
Her kuyuda önceden ısıtılmış THP-1 hücre kültürü ortamının 100 mikrolitresinde opsonize edilmiş enfekte eritrositleri yeniden askıya alın ve her opsonize edilmiş enfekte eritrosit süspansiyonunun 50 mikrolitresini fagositoz plakasındaki bir kuyuya aktarın. Tüm hücreler eklendiğinde, plakayı ışıktan korunan en fazla 40 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Kuluçka sonunda, fagositoz'u dört santigrat derecede santrifüjle durdurun.
Supernatant çıkarın ve iyi başına oda sıcaklığında amonyum klorür lysing çözeltisi 150 mikrolitre ile pelet resuspend. Tam üç dakika sonra, lysis durdurmak için PBS% 2 FBS buz soğuk 100 mikrolitre ekleyin ve santrifüj ile bozulmamış hücreleri tortu. Daha sonra, temiz başına PBS taze buz soğuk 200 mikrolitre ile hücreleri üç kez yıkayın, yıkama başına.
Son yıkamadan sonra, iyi başına PBS taze buz soğuk% 2 FBS 200 mikrolitre hücre pelet resuspend. Akış sitometrisi alımı ve analizi için, hücreleri hemen bir akış sitometresine yükleyin ve thp-1 hücrelerini kapamak için enfekte eritrositler olmadan kuyular için doğrusal ileri ve doğrusal yan dağılım çizimini kullanın. Bu kapıda 10.000 olay edinin ve ethidium bromür floresans yoğunluğunu ölçmek için bir histogram komplokurmak için pozitif kontrol ile opsonized enfekte eritrositler ile THP-1 hücreleri kullanın.
Analiz için, enfekte eritrositler olmadan kuyular için doğrusal ileri karşı doğrusal yan dağılım çizimini açın ve THP-1 hücrelerini açın. Daha sonra, bir FL-3 histogram ı pozitif bir kapı ayarlayın ve ethidyum bromür-pozitif THP-1 hücrelerinin yüzdesini belirlemek için diğer örnek kuyuların üzerine bu kapıları kopyalayın. Test edilen her örnek için fagositoz mutlak değer olarak veya pozitif kontrolü maksimum olarak kullanarak yüzde olarak hesaplanan göreli fagositoz olarak rapor edilebilir.
THP-1 hücreleri akış sitometrisi ile FC gama reseptör yüzey ekspresyonu için periyodik olarak kontrol edilmelidir. Hücreler CD16 için negatif, CD32 ve CD64 pozitif olmalıdır. Bu opsonizasyon deneyinde, THP-1 hücreleri ilk olarak ileri ve yan dağılım profillerine göre, ethidyum bromür etiketli hücrelerin yüzdesinin ölçülmesine izin vermek için, en az bir antikor enfekte eritrosit ezili mezhebine göre fagositize edilmiş hücrelerin göstergesi olarak geçitlendi.
Negatif kontrol örneklerinin tümü FL3 kanalında tek bir negatif tepe oluşturmalıdır ve ethidyum bromür belirtecinde çok az olay gözlenmiştir. Buna göre, mutlak ethidyum bromür-pozitif THP-1 hücreleri ve göreceli fagositon yüzdesi olarak ortalama fagositoz değerleri çok düşük olmalıdır. Buna karşılık, pozitif kontrol iki tepe, negatif bir tepe ve açıkça pozitif ve iyi ayrılmış tepe ethidyum bromür belirteci içinde bulunan izleri oluşturmalıdır.
Ortalama fagositoz değerleri normalde pozitif kontrol için en yüksek, sıtmaya maruz kalan kadın havuzu ve sıtmaya maruz kalan tek kadın kontrolleri takip. Bu metodoloji tutarlı sonuçlar üretse de, ayarlanan çizgilerin eğim katsayısında sapmalar gözlenmiştir. Bu nedenle, özellikle tüm örnekleri tek bir denemede çalıştırmak mümkün değilse, göreli değerlerin kullanılması önerilir.
Deneyi önceden dikkatlice planladığından, hem THP-1 hücrelerini hem de parazitleri buna göre hazırladığından, sadece %80'den fazla saflığa sahip tropositler kullandığınızdan emin olun Ayrıca, deneyin kalitesinin değerlendirilmesine ve veri analizini kolaylaştırabilmek için her zaman uygun kontrolleri dahil etmeye hazır olun.
