Bu çalışma NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) ve NIH hibe AR052785 ve AR046786 (AEO ve W.-MW) tarafından desteklenmiştir.

1. Cilt Diseksiyon için 0 ila 2 gün Eski Yenidoğan Fare hazırlayın <ol><li> En az 20 dakika süreyle bir CO 2 odalarını kullanarak fare yavrular Euthanize. Kadar diseksiyonu kadar bir saat için buz üzerinde yavrular bırakın. P0-P2 fareler oldukça eski fareden hazırlanan hücreler olarak tavsiye edilir progenitör kapasitesi düşmüş düşük greft verimleri sonuçlar. % 70 etanol bir tabak (adım 1.3) ve yıkama solüsyonu üç yemekler (adım 3) hazırlayın cildin diseksiyon yapmaya hazır. Dispase Çözüm çözülme ve 4 bırakın ° C Servikal ötanazi sağlamak için CO 2 aşırı maruz kalma sonrasında yavruların yerinden. </li><li> Buz ve steril bir akış kaputu transferi bir kültür çanak ötenazi yavrular yerleştirin. </li><li> Kısaca steril kültür çanağı üzerine% 70 etanol ve yerde daldırarak yavrular yıkayın. </li></ol> 2. Fare Cilt teşrih <ol><li> Steril makas ile gövde tabanına her uzuv ve kuyruk kesiniz. </li><li> Cu çifti arasında sıkıca vücut tutunSVEd forseps ve baş yatan fasya nüfuz etmeden bir neşter kullanılarak kuyruk dorsal cilt boyunca bir kesi yapmak. </li><li> Dikkatlice uzakta fare orta hattan cilt soyma. </li><li> Kavisli bir forseps uzun kenarı ile sıkıca maruz fare tutun ve fare posterior sonunda deri altında kavisli bir forseps bir çift ekleyin ve hafifçe fare ventral yarısında doğru kalça üzerine deri çekin. </li><li> Dikkatle tek bir hareketle tamamen fare kapalı cilt soyma ve karkas atın. </li></ol> 3. Dispase Çözüm Cilt ve İnkübasyon yıkayın <ol><li> Dermis yüzü yıkama solüsyonunun ilk çanak cildin aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Cilt Dağılın ve forseps ile karıştırılır. Sonraki kaplamayı diseksiyon ise yıkama solüsyonunun ilk çanak cilt bırakın. </li><li> Yıkama çözeltisinde ilk çanak içinde bir sonraki parçalara deri yerleştirdikten sonra, yıkama çözeltisi, ikinci çanak için önce deri aktarın. Inci derileri tutune ikinci yıkama solüsyonu bütün derilerden toplanana kadar. Nihai yıkama derileri tüm transfer, kısaca ajitasyon. </li><li> Steril bir 10 cm kültür çanak için 10 ml buz soğuk dispase ekleyin. Dispase Çözüm için cilt aktarın ve cilt Dermis tarafı aşağı dümdüz. </li><li> 4 de 8-16 saat boyunca cildi Float ° C (alternatif seçenek: 1 saat 37 ° C&#39;de). </li></ol> 4. Ayrı Dermis ve epidermis <ol><li> Yeni bir steril kültür çanak için cilt aktarın ve cilt Dermis tarafı aşağı dümdüz. Bir neşteri ile bir köşeden dermis dikkatlice basılı tutun. </li><li> Forseps ile epidermis kavrayın ve yavaşça sıyırın dermis. Epidermis uzakta tek parça olarak soyma gerekir. Epidermis beyaz ve ince olacak ve dermis, kahverengimsi kalın ve jelatinimsi olmalıdır. </li><li> Ayrı steril kültür kaplarına iki dokular ayırın. <ol class="lalpha"><li> Bir dermal özgü gen demonte / aşırı greft yapmak için, dermis almak ve t ile çok küçük parçalar halinde doğrayınwo neşter. Epidermis atın. Enfeksiyonu (adım 7) günü, lentiviral enfekte cilt hücreleri birleştirmek için taze, işlenmemiş epidermal hücreler hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih. </li><li> Epidermal özgü gen demonte / aşırı greft yapmak için, 6 içine her epidermisin dilim - 8 küçük parçalar. Dermis atın. Enfeksiyonu (adım 7) günü, lentiviral enfekte epidermal hücreleri ile birleştirmek için taze, işlenmemiş deri hücrelerini hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih. </li></ol></li></ol> 5. Kıyılmış Doku Primer Fare Dermal Hücreleri (MDCS) ayrışır <ol><li> 1 saat boyunca 37 ° C &#39;de taze collagenase Çözelti, dermal parçalar inkübe edilerek MDCS ayrışır. Yavru fare başına kollajenaz Çözüm 10 ml kullanın. </li><li> Yavaşça solüsyon içeren dermis her 10 dk karıştırın. Bir mikroskop altında ayrışma derecesini kontrol edin; sindirilmiş hücre süspansiyonu çoğunlukla tek hücre olmalıdır. Çözüm açık itibaren bulutlu değiştirmek gerekirdermal hücrelerin dermis uzaklaşılmış. </li><li> Kollajenaz aktivitesini azaltmak için% 10 nihai hacmi dermis içeren Kollajenaz Çözüm FBS ekleyin. </li><li> Sindirilmemiş iri küme ve bütün köklerinin kaldırmak için yeni bir 50 ml tüp içine bir 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirir. 30 ml başına DMEM/10% FBS 10 ml ekleyin akan daha kollajenaz sulandırmak için. </li><li> Santrifüj tüpleri daha bütün köklerinin kaldırmak için 5 dakika süreyle bir masa santrifüj 30 xg&#39;de sindirilmiş dermis içeren. </li><li> Yeni bir 50 ml tüp süpernatantı dikkatle aktarın. 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg&#39;de santrifüj Pelet hücreleri. </li><li> DMEM/10% FBS ile hücrelerin (yavru başına 1 ml) süspanse edin ve hücreleri saymak. Enfeksiyonu için Amniomax C-100 medya (adım 7) Levha hücreleri veya (adım 9) greft lentivirüs-enfekte KC ile birleştirmek. Tipik verim yavru başına 20 x 10 6 hücre olduğunu. </li></ol> 6. Birincil Keratinosit çözerlerKıyılmış Doku dan s (KC) <ol><li> 15 dakika boyunca 37 ° C &#39;de taze çözülmüş% 0.05 tripsin-EDTA ile epidermal parçalar inkübe edilerek KC ayrışır. Pup fare başına Tripsin-EDTA 7 ml kullanımı. </li><li> Epidermis her 5 dk içeren yavaşça girdap çözüm. </li><li> Tripsin aktivitesini azaltmak için tripsin-EDTA içeren epidermis Nötralleştirme Çözüm eşit hacmi ekleyin. </li><li> 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg&#39;de santrifüj Pelet hücreleri. Kalan sindirilmemiş dokusu üstünde yüzer olmalıdır. </li><li> Dikkatlice sindirilmemiş doku ile süpernatant çoğu kapalı dökün. Rahatsız edici hücre pelletini olmadan bir 10 ml pipet ile kalan Süpernatantı. PBS ile hücre pelletini tekrar. Durumda KCS tamamen pelet değil, süpernatant çoğu kapalı dökün ve en hücrelerin peletlenmiş kadar santrifüj tekrarlayın. </li><li> Kalan doku veya kümeleri kaldırmak için yeni bir tüpe 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu süzün. </li><li> Santrifüj Pelet hücreleri5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg. </li><li> CnT-07 ortamı ya da PBS (PUP başına 1 ml) ve sayım hücrelerde yeniden süspanse hücreler. Enfeksiyonu için kaplama hücreleri (adım 7) CnT-07 kullanın (adım 9) greft lentivirüs-enfekte MDCS ile birleştirmek PBS kullanın. Tipik verim yavru başına 3-10 x 10 6 hücre olduğunu. </li></ol> 7. ShRNA veya cDNA içerenler Lentivirus ile Primer Hücre Infect Enfeksiyon gününde (adım 9) aşılama günü virüsle enfekte olan hücreleri birleştirmek için taze, işlenmemiş primer KCS veya MDCS hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih. <ol><li><ol class="lalpha"><li> MDCS için plaka 4 x 10 37 AmnioMAX-C100 medya ve inkübe ile 10-cm plaka başına 6 MDCS ° C,% 50 hücre yoğunluğu ertesi gün enfeksiyon için +% 5 CO 2. MDCS genellikle 3-4 plakaları bir aşı üretmek için kullanılır, ve plakalar 10-12 toplam bir deneyde, üç greft üretmek için ihtiyaç vardır. Alternatif olarak, MDCS eklemek izin ve f yayıldıya da 37 az 2 saat, en az ° C ±% 5 CO2 ve enfeksiyon hücre kaplama aynı gün yerine getirir. MDCS fibroblast benzeri morfolojiye sahip olacaktır. </li><li> KC için, plaka 12 x 10 37 CnT-07 medya ve inkübe ile 10-cm plaka başına 6 KC ° C ertesi gün enfeksiyon için +% 5 CO 2. Alternatif olarak, KC 37 az 2 saat en az takın ve yaymak izin ° C +% 5 CO 2 ve aynı gün enfeksiyonu gerçekleştirin. KC Genellikle 3-4 tabak bir greft oluşturmak için kullanılır. 10-12 plakaları toplam bir deney için üç greft üretmek için ihtiyaç vardır. KCS arnavut morfolojisi sahip olacaktır. </li></ol></li><li> 37, 8 ug / ml Polybrene Çözelti ° C ±% 5 CO2 ile 5-10 dakika için hücreler Preincubate. </li><li> Değişim medya ve lentivirüs eklemek + 8 mg / ml Polybrene Çözüm. Lentiviral titresi inşa kullanılan ve enfeksiyon öncesi tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. </li><li> 32, 1 saat boyunca bir masa üstü santrifüjü 200 x g&#39;de santrifüjleyin ° plakaları; Lentivirüs ile hücreleri enfekte etme C. </li><li> Lentivirüs içeren ortamları çıkarın ve taze medya ekleyin. KC için, taze medya geri eklemeden önce bir kez PBS ile hücreleri yıkayın. Genellikle enfekte hücreleri kurtarmak 37 gecede ° C +% 5 CO 2. Alternatif olarak, 37 iyileşme en az iki saat izin ° C aşı için hücreler tripsinize önce +% 5 CO2. Temsilcisi Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi enfeksiyon verimliliğini kontrol etmek için kültür bulaşmış hücrelerin küçük bir kısmı için devam edin. </li></ol> 8. Aşılama için Enfekte Hücreler hazırlayın <ol><li> 4-6 arasındaki adımları kullanarak cilt taze primer MDCS veya KCS ayırın. Buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Hücreleri saymak. </li><li><ol class="lalpha"><li> Dermal spesifik gen devirme / ekspresyonu için aşı, 8 dk için 37 ° C sıcaklıkta% 0.05 tripsin-EDTA ile plakalar enfekte MDCS ayrışır. </li><li> Epidermal özgü gen demonte / aşırı greft için plakalar USI enfekte KC ayırmak37 ng% 0.125 Tripsin-EDTA ° C de 15 dakika. </li></ol></li><li> DMEM +% 10 FBS (MDCS) veya Nötralleştirme Çözüm (KC) kullanarak tripsin aktivitesini nötralize. 50 ml&#39;lik bir tüpe hücreler tripsinize aktarın. </li><li> 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg&#39;de santrifüj Pelet hücreleri. </li><li> Buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Hücreleri saymak. </li><li> Taze hazırlanmış işlenmemiş mevkidaşı ile hücre tipi virüsle enfekte olan hücreleri birleştirin. Bir greft için, 4 ° C&#39;de buz soğuk steril PBS ve pelet bir masaüstü santrifüj hücre bulamaç 7-10 x 10 6 KCS ile 7-10 x 10 6 MDCS birleştirmek 50 -100 ul buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Nu / nu fare odaları hazır olana kadar buz üzerinde hücreleri tutun. </li></ol> 9. Nu / nu Fare Back üzerine Yara Yatak ve Fix Odası Oluştur Greftleme bir gün önce% 70 etanol içinde iliklerine tarafından otoklav ve steril silikon odaları ile cerrahi aletleri sterilize edin. 70% etha değiştirinodaları kullanmadan önce steril PBS ile nol. <ol><li> Anestetize nu / nu fare (7-12 haftalık dişi) intraperitoneal (100 μl/10 g vücut ağırlığı) ya da başka bir tercih edilen yöntemi yolu ile ketamin (8 mg / ml) / ksilazin (1.6 mg / ml) kullanarak. Göz yağlayıcı. Farenin altındaki Sıra ısıtma pedi. </li><li> Iyot ile çıplak fare geri deriyi dezenfekte ve alkol bezlerden ile temizleyin. </li><li> 1-3 topikal kesi site% 0.25 bupivakain düşer ekleyin. Forseps ile boyun tabanındaki çıplak fare geri cilt sıkıştırın. </li><li> Steril makasla sıkışmak deride küçük dairesel delik (çapı ~ 1 cm) kesin. </li><li> Yara yatağı üzerine steril odasına yerleştirin ve cilt çevreleyen odaya kenarlarını kaplayacak. </li><li> Şekil 2A gösterildiği gibi kamara kenarlarında dikiş (kamara başına 6 dikiş) ile yerine Güvenli odası. </li><li> odaları hazır, yavaşça girdap hücre çamur ve 1 ml enjektöre bağlanmış 23 gauge iğne içine çekmek. Hücre bulamaç yavaşça alt yoğunlaşmış iseiğne içine çizmeden önce 1 ml pipet ucu ile tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Delinme iğne ile oda ve yavaş yara üzerine hücreleri damla. </li><li> Temiz, otoklavlanmış kafesleri içine yerleştirin fareler. House 2 kafes başına fareler ve içme suyu için antibiyotik ve Tylenol (3 mg / ml) ekleyin. Bizim tecrübelerimize göre, kafes başına iki dişi farelerde olumsuz odasına travma, greft, veya hayvan sağlamamıştır. </li><li> Yarım kafesinin altında ısınma pedi yerleştirin ve anestezi kapalı giyer kadar fareler gözlemlemek. </li></ol> 10. 7-9 gün sonra Odası kaldır <ol><li> Adım 9.1 &#39;de olduğu gibi odacıklı nu / nu fare anestetize. Göz yağlayıcı. </li><li> Iyot odasının etrafında deriyi dezenfekte ve alkol bezlerden ile temizleyin. </li><li> Dikkatlice dikiş kesip odasından çıkarın. </li><li> Yavaşça fare odası çıkarın. Odaya yeni deri grefti sopa, forseps kullanarak odasından odasının parçası ve yavaşça ayrı greft kaldırırsanız. Odanın çıkarılması sırasında greft basılı tutun. Greft loo gerekirŞekil 2B gibi k mat ve opak. </li><li> Yeri (2 ilmek) içine açık yara ve dikiş üzerine antibiyotik ince bir film ile bir yapışmaz pad uygulayın. </li><li> Ped güvenli ve yara korumak için fare etrafında bandaj sarın. Yerine bandaj dikin. </li><li> Silikon odaları sabunla ovarak temizlenmeli ve iyice deiyonize su ile durulanır. % 70 gecede etanol, hava kuru ve mağaza odaları bekletin. </li></ol> 11. Saç Büyüme için Fare inceleyin <ol><li> Odasının kaldırılması 3 gün sonra bandaj ve pedi çıkarın. Greft kuru ve kahverengi renkte opak olmalıdır. </li><li> Saç büyümesi için periyodik farelerde kontrol edin. Saç greft sonra 16 gün de göstermeye başlamalıdır. </li></ol> Prosedür Anahat 1. Gün (2-3 saat): yenidoğan yavrular Kurban deri kaldırmak ve 4 ° C gecede dispase üzerine bırakın. 2. Gün (2-3 saat): derinin primer hücreler izole veönerilen hücre yoğunluğu plaka. 3. Gün (3-4 saat): lentivirüs sahip hücreler Infect. Yenidoğan yavruların başka bir dizi deri çıkarın ve 4 ° C gecede dispase üzerine bırakın. 4. Gün (6-8 saat): derinin primer hücreler izole, saymak ve buz üzerinde bırakın. Tripsinizasyonla ve santrifüj ile lentivirüs-enfekte hücreleri Kurtar, saymak ve greft başına PBS 50-100 ul içine 7-10 x 10 6 dermal hücrelerin ve keratinositlerin birleştirir. Fare üzerindeki yara yatağı oluşturma, kamara takın ve yatak yara hücre karışımı uygulanır. Alternatif Prosedürü Outlines Alternatif yordamı anahatları dört gün üç prosedürü kısaltacaktır. <ol><li> Bir saat (tahmini süre 5-7 saat) için 37 ° C&#39;de dispase fare derileri davranarak Gün 1 ve Gün 2 birleştirin. </li><li> İki saat boyunca kaplama hücreleri (tahmini süre 5-7 saat) sonra lentivirüs ile hücreleri nüfuz ederek Gün 2 ve 3. Gün birleştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIM+and+cortactin+antagonism+regulates+ciliogenesis+and+hedgehog+signaling.">MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling.</a> Dev Cell. 19, 270-283 (2010).</li><li>Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+dermal+papilla+cells+in+hydrogels+reveals+intrinsic+differences+between+Sox2-positive+and+-negative+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).</li><li>Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+procedure+to+reconstitute+hair-producing+skin.">A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).</li><li>Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+mouse+models+for+hair+follicle+reconstitution.">Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution.</a> Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).</li><li>Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+regulation+of+murine+hair+growth:+insights+from+grafting+defined+cell+populations+onto+nude+mice.">In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice.</a> J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li><li>Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+mouse+vibrissal+dermal+papilla+cells+and+de+novo+hair+follicle+induction.">Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.</a> Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).</li><li>Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+dermal+papilla+cells+is+required+for+their+hair+follicle-inductive+properties.">BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties.</a> Genes Dev. 22, 543-557 (2008).</li><li>Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-lox-regulated+conditional+RNA+interference+from+transgenes.">Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).</li><li>Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+hair+follicle+development+in+vivo:+determination+of+follicle+formation,+hair+growth,+and+hair+quality+by+dermal+cells.">Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).</li><li>Woo, W. -. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop.">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).</li><li>Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly(ethylene-co-vinyl+alcohol)+membranes+for+hair+follicle+regeneration.">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li><li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+from+dissociated+cells:+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells.">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Saç sulandırıldıktan deneyleri de novo saç folikülünün oluşum mekanizmasını incelemek için eşsiz bir organ yenilenmesini model sağlar. Burada, biz saç folikülü oluşumu gen fonksiyonu belirlemek için kullanışlı bir modifiye kamara saç testi açıklamak. Bizim bu tahlil epidermis hücre tipleri ya da gen ekspresyonu ya da devirme elde etmek için bir teknik lentiviral ifade tanıtmak için modifiye bildirilen oda saç sulandırma tahlil 5, 6,11, esas alınmaktadır. Bizim assay doku-spesifik genetik nakavt oluşturmadan hızlı bir alternatif sunuyor. Bu test bize greft toplama lentivirüs primer hücreler bulaşmasını kadar az üç hafta içinde saç folikülü oluşumu gen fonksiyonu göstermek için izin veriyor. Tüm tahlil bir hücre tipinde 12 içine lentivirüs ile kombinasyon shRNA / cDNA teslim kullanılarak genetik etkileşimleri gidermek için uzatılabilir gibi dermal ve epidermal hücre tip arasında sinyal inceleme sağlares. Ince kusurları gözlemlemek zor iken Bizim saç testi iyi, saç folikülü rejenerasyon güçlü kazanç veya kayıp fonksiyon-fenotipleri tespit için uygundur. Biz başarıyla saç rejenerasyon tahlil 1,12 kullanarak birkaç gen dermal özgü gen fonksiyonu göstermiştir. GFP işaretleyici dayanarak shRNA 10 ifade lentivirüs vektöründen ortak ifade, biz donör dermal hücrelerde eksprese shRNA rejenere saç greft devam ettiği gösterilmiştir. GFP pozitif hücreler rejenere saç köklerinin (Şekil 3) dermal papilla (DP) mevcuttu. Hücreleri dolayısıyla gözlenen saç folikülü fenotipi null genetik hypomorph bir dizi vardı, GFP düzeylerde ifade olarak DP hücreler olasılıkla gen demonte farklı düzeylerde oluşuyordu. Bu tahlil için bir gelişme graftin önce yüksek shRNA eksprese eden hücreler için hızlı ve etkili bir seçim kurmak için olacaktırg kuvvetli GFP-ifade eden hücrelere arındırmak için FACS kullanılması. Alternatif bu tahlil 9 mutant ya da koşullu knockout hücre ikame etmektir. Primer dermal geçişli hücreler bir kez DP etki yavaş yavaş kaybolması gibi diğer yandan, DP hücre fonksiyonunu koruyan bir kültür sistemi çok yararlıdır. Potansiyel kültür sistemleri yapay niş veya toplama kültürlerden 2,7,8,13 türetilen biyomalzemelerin kullanımını içerir. Başka bir gelişme bu dermal-spesifik kaybı ya da taze keratinositler oluşturmak için fare yavruların bir ikinci birimler kümesi (adım 7) &#39;nin kullanımını azaltır gibi yüksek bir hücre geri kazanım oranı ile, güvenilir bir epidermal hücre dondurma yöntemi kazanç-of-üretmek için olacaktır fonksiyon çalışmaları. Saç büyüme biraz daha eşitlenmiş ve follikül yönelim daha rastgele olmasına rağmen bu kamara saç testi, saç folikülü yoğunluğu ve normal fare derisine benzer kalitede üretir. Saç rejenerasyon genetik testin birkaç sınırlamalar dahil olmak üzereE lentivirüs ve hücre sayıları büyük miktarda ihtiyacı ve bu tür yama ve flep testleri 3,4,14 gibi saç sulandırma testlerinin diğer formları ile karşılaştırıldığında cerrahi yöntemler açısından yoğun çok emek. Ancak, saç büyüme tespit etmek için saç folikülleri ve zaman çizelgesinin kalitesi diğer deneyleri 4 üstündür. Bizim hedef saç rejenerasyon tahlil varolan genetik modellere hızlı ve kolay bir arkadaşı sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> # Katalog </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Hücre K Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Ek </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> , Kollajenaz Tip 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Doku kültürü çanak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon Makaslar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> kavisli </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Kaynağı </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Size hayır. 10 </td></tr><tr><td> 70 mikron hücre boyama </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konik santrifüj tüpüne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49d </td><td></td></tr><tr><td> Alkol swablar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23 gauge iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Göz yağlayıcı </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-lodine bezlerden </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Dikişler </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Esnek bandaj </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Yapışmaz pansuman </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Malzemeler </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözüm yıkayın PBS 500 mg / ml Penisilin / Streptomisin 12.5 mg / ml Fungizone 100 mg / ml gentamisin Dispase çözümü HBSS 2.5 mg / ml nihai dispase 100 mg / ml gentamisin Nötralizasyon medya HBSS % 15 (v / v) FBS Kollajenaz çözüm % 0.25 (w / v), kollajenaz Tip 1 ontent &quot;&gt; 100 ug / ml penisilin / streptomisin 2.5 mg / ml Fungizone 50 mg / ml gentamisin Polybrene çözümü HBSS 8 ug / mL &#39;lik (ağırlık / hacim) Polybrene </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

Saç folikülü morfolojilerinden, epitel kökenli keratinositlerin ve altta yatan mezenşimi arasındaki etkileşimi gerektiren karmaşık bir süreçtir, organ gelişimi ve doku-spesifik sinyal incelemek için cazip bir model sistemidir. Saç folikül gelişimi olmasına rağmen bu süreç için önemli faktörler genetik uysal, hızlı ve tekrarlanabilir analiz bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada hedeflenen ekspresyonu ya da bir doku-spesifik bir şekilde lentivirüs kullanarak faktör shRNA-aracılı devirme oluşturmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Bir saç rejenerasyon modeli 5, 6, 11 değiştirilmiş bir sürümünü kullanarak, saç folikülü morfolojilerinden yol epitelyal-mezenkimal sinyal yollarının çalışma kolaylaştırmak için sağlam kazanç veya birincil fare keratinositler ve dermal hücrelerin kaybı fonksiyon-analizi elde edebilirsiniz . Biz lentivirüs contai teslim, taze Birincil fare keratinosit ve dermal papilla hücrelerini ve bunların öncüleri içeren dermal hücreleri izole etmek nasıl tarifhücre popülasyonlarının birine shRNA ya da cDNA ya da vaziyette, ve çıplak farelerin sırt üzerinde tam olarak oluşmuş saç kökü oluşturmak için hücrelerin bir araya getirir. Bu yaklaşım, üç hafta içinde saç köklerinin üretmek için gerekli doku-spesifik faktörlerin analizine olanak ve mevcut genetik modellere hızlı ve kolay bir arkadaşı sağlar.

Şekil 1 &#39;de bir 3-haftalık rejeneratif saç aşı olarak, düzeltilir (SMO), kritik bir Shh sinyal bileşeninin dermal-özgü lentiviral shRNA portatif bir sonucu göstermektedir. Yalnız lentiviral vektör kullanarak Kontrol greftler sağlam saç büyüme (Şekil 1A) göstermektedir. Buna karşılık, saç büyüme (Şekil 1B) kaybına SMO sonuçlarının dermal özgü devirme. Hematoksilen ve eozin leke saç kontrol folikülleri ve deneysel koşullar (Şekil 1C, D) sahne resmediyor. Benzer tedaviler saç büyüme fenotipi lentiviral vektör yalnız enfeksiyonu ile pozitif kontrol dahil olmak üzere, deneyler arasındaki değişken olabilir. Bu nedenle her zaman pozitif kontrol greft greft% 30 yara izi veya greftler tamamlanmamış ek bir sonucu olarak bozulabilir bir referans olarak, her deneyde de dahil edilmelidir. Yeniden bir faktör cDNA örneğin eksprese olarak iki etken arasındaki etkileşim test durumunda,Başka bir faktör scue shRNA aracılı demonte bir zaman tezahür her deneyde kaybı fonksiyon-sonuç knockdown yalnız greft içermelidir. Bu, belirli bir gen saç folikülü rejenerasyon yolu ve nasıl iki gen etkileşim bozulacaktır nasıl belirlemek için gerekli bir dizi sağlayacaktır. Bölmesinin (Şekil 2A) çıkarılması dikkatle yapılması gerekmektedir. Yeni kurulan greft donuk bir yüzey (Şekil 2B) ile hafif opak olmalıdır. Greft greft yara yatağa bağlı kalır emin olmak için önemlidir bu yüzden yavaşça bir tarafı kaldırarak, odasına yapışabilir. Greft üç gün sonra oldukça istikrarlı ve soyunma çıkarırken biraz zorluk sunmalıdır. Sağlam saç büyüme üç hafta (Şekil 2C) sonra uyulmalıdır. MDCS veya KCS ya da yokluğu, saç (Şekil 2B) 11 olmaksızın, geri kazanılmış bir yara bölgesinde neden olur. Birindeki hücre ölüm ya da hücre kaybınaŞekil 1B &#39;de gösterildiği gibi dermal-SMO devirme azaltılmış saç rejenerasyon aksine, saç içinde hücre tipleri de sonuçlanır. Başarılı bir tahlil sağlamak için, aşılama öncesinde uygun ekspresyonu ya da devirme verim ile% 90&#39;dan daha fazla hücrelerin viral enfeksiyon elde etmek için çok önemlidir. Aşılama işlemi sırasında kısıtlamaları nedeniyle, biz bir aşılama deney başlamadan önce sorun çekim viral enfeksiyon verimliliği, tavsiye ve her zaman kaybı veya kazancı-of-ekspresyonu doğrulamak için prosedür aşılama günü hücrelerinin küçük bir bölümünü kaydedebilirsiniz. Lentiviral titresi inşa kullanılan ve enfeksiyon 90-100% verim elde etmek için önce tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. Biz lentiviral vektöründen coexpressed GFP ile viral enfeksiyon etkinliğini izlemek. Biz rutin knockdown veya aşırı ölçüde belirlemek için kantitatif PCR ve / veya Western Blot gerçekleştirin. Etiketlemek için floresan etiketleri ile çift-ekspresyon vektörleri kullanmakviral enfekte hücreler sinyal ve olgun greftler bizim yapıları eksprese eden hücrelerin sayısı perdurance bildirmek için bir yol sağlar. Bu vektör lentiviral SMO shRNA ile kombinasyon halinde pSicoR-CMV-GFP 10 bir CMV promoter ile tahrik GFP kullanır. Şekil 3, biz GFP temsilcisi saç kökü dermal papilla olarak lentivirally-ifade edilir 3 haftalık dermal özgü greft göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Şekil 1. Saç folikülü büyüme histolojik analiz. (A) boş lentiviral vektör ve işlenmemiş keratinositler ile enfekte deri hücreleri ile kontrol saç rejenerasyon greft görüntüle. (B) dermal hücrelerde lentiviral shRNA kullanılarak düzeltilir knockdown saç köklerinin dökülmesi tedavisiz keratinositler sonuçları ile birlikte. (C) Hematoksilen ve eozin boyama anagen kıl f gösterirkontrol greftlerde ollicles dermis içine doğru uzanır ve (D) düzeltilir knockdown saç folikülleri bodur ve büyük ölçüde eksik kalır. Tüm görüntüler üç hafta greftleme sonrası vardır. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Şekil 2. Birincil hücreler Aşılama. Sütüre bölmeli gövde primer dermal hücrelerin ve keratinositlerin (A) nu / nu fare. (B) Odanın kaldırılmasını yeni donuk ve karakter opak olduğu cilt oluşur ortaya çıkarır. (C) greft Tam yetiştirilen tüyleri kullanarak yaban- aşılama sonrası üç hafta az ilköğretim dermal hücrelerin ve keratinositlerin yazın. (D) keratinositler primer dermal hücrelerin eklenmesi üç hafta sonra hiçbir saç yol açar. Benzer sonuçlar dermal hücrelerin primer keratinositlerin ilavesi ile görülür. Şekil 3,. 3 hafta eski rejenere greft dermal papilla dermal papilla GFP Bakım. Konfokal görüntüler. GFP lentiviral vektöründen dermal hücre popülasyonu ifade ve dermal papilla (yeşil) saptandı. Versican (kırmızı) dermal papilla ve çekirdekleri Hoechst (mavi) ile etiket vardı demarcates. Not GFP dermal hücrelerde değil fakat çevreleyen, keratinositler içerisinde spesifik olarak ifade edilir. Ölçek çubuğu 20 mikron gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration at JoVE.com

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Kazanç ya da kayıp fonksiyon-arabuluculuk lentivirüs kullanarak bir saç kökü yenilenme modeli Doku özgü analizi.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine. Kazanç ya da kayıp fonksiyon-arabuluculuk lentivirüs kullanarak bir saç kökü yenilenme modeli Doku özgü analizi.

Video: Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Biyoloji

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Embriyo sırasında Fonksiyonel Artıklık Test Ters Genetik Yaklaşım

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Ekstraksiyon ve İnsan ve Maymun Saç gelen Kortizol Analizi

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Gri tonlama Analizi İle Farelerde Saç Dökülmesi Kantitatif Analiz Yeni Bir Teknik

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...