Çin Burs Konseyi'nin (CSC) J.Z. ve Kanser Genomik Merkezi Hollanda'ya (CGC) desteğini kabul ediyoruz. NL) P.t.D.'ye.

1. Batı şişkinliği kullanılarak TGF-β kaynaklı SMAD2 fosforilasyonunun analizi
NOT: Premalign insan göğsü MCF10A-Ras hücreleri, TGF-β sinyal yanıtlarını araştırmak için örnek olarak kullanılmıştır33. Prensip olarak, aşağıda açıklanan yöntemler diğer TGF-β duyarlı hücre hatları için de geçerlidir.
<ol><li>Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM)/F12'sinde %5 at serumu ile L-glutamin içeren 37 °C'de meme epitel hücre hattı MCF10A-Ras'ı kültüre edin, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 10 mg/mL insülin, 100 ng/mL kolera enterotoksin, 0.5 mg/mL hidrokortizon ve 1:100 penisilin-streptomisin (Pen-Strep).</li>
	<li>Trypsinize MCF10A-Ras hücreleri 1 dakika boyunca % 0.25 trypsin-EDTA'nın 1 mL'si ile ve bir hücre sayacı kullanarak uygulanabilir hücreleri sayar.</li>
	<li>Tohum hücreleri 5×10 5 hücre / kuyu yoğunluğunda 6 kuyulu plakalarhalinde.</li>
	<li>Gece büyümeden sonra, hücreleri 1 saat boyunca TGF-β (5 ng/mL) veya ligand tampon (4 mM HCl, %0,1 yağ asidi içermeyen sığır serum albümini (BSA)) ile tedavi edin ve ardından kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez hafifçe yıkayın.</li>
	<li>Buz üzerinde 6 kuyulu plakalarda serin hücreler ve 150 μL önceden soğutulmuş radyo immün çökeltme testi (RIPA) liziz tamponu (150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.5% sodyum deoksikolat, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 ve taze eklenen mini proteaz inhibitörü kokteyli). Lizinin 10 dakika boyunca buz üzerinde ilerlemesine izin verin.</li>
	<li>Yapışan hücreleri plastik bir hücre kazıyıcı kullanarak tabaktan kazıyın, ardından hücre süspansiyonunu önceden soğmuş bir mikrosantrifüj tüpüne hafifçe aktarın.</li>
	<li>Hücreyi 4 °C'de 150 santrifüj kuvvetinde(x g)10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı taze bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Deterjan uyumlu (DC) protein test kiti kullanarak protein konsantrasyonu ölçün.</li>
	<li>Her numuneden %10 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) jeline 30 μg protein yükleyin ve jeli 1,5-2 saat boyunca 100 V voltajda çalıştırın.</li>
	<li>Proteinleri jelden 1-1,5 saat boyunca 110 V voltajda 45-μm polivinylidene difluorid (PVDF) membranına aktarın.</li>
	<li>PVDF membranını protein tarafı (jelle bakan taraf) yukarı bakacak şekilde uygun bir kaba aktarın ve zarı damıtılmış suda kısa bir süre durulayın.</li>
	<li>Suyu atın, Ponceau S çözeltisi ekleyin ve zarı 1-2 dakika sallanan bir platforma koyun.</li>
	<li>Zarı hızlı bir şekilde durulayıp 1 dakika yıkayarak damıtılmış suyla lekeden arındırın.</li>
	<li>Ardından, PVDF zarını bir ışık kutusuna koyun ve eşit toplam protein yüklemelerini kontrol etmek için bir resim çekin.</li>
	<li>Membranı Tris tamponlu salin ile Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl ve % 0.1 Tween 20) ile görünür bir leke görene kadar yıkayın.</li>
	<li>Membranı bloke tamponuna koyun (TBST çözeltisinde% 5 yağsız süt) ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Membranı TBST ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Membranı fosfot-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, ev yapımı 34),toplam SMAD2/3 1:1000 ve gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH; 1:1000) karşı primer antikorlarla kuluçkaya bırakın, gece 4 °C'de.</li>
	<li>Membranı TBST ile iki kez yıkayın ve membranı tavşan veya fareye karşı ikincil bir antikorla (1:5000) 2 saat kuluçkaya bırakın.</li>
	<li>PVDF membranını Batı ECL substratı ile 30 saniye kuluçkaya yatırın ve bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyali algılayın.</li>
	<li>Biyolojik triplikat elde etmek için deneyleri en az üç kez tekrarlayın.</li>
</ol>2. TGF-β kaynaklı SMAD3 bağımlı transkripsiyonal yanıtların analizi
<ol><li>SMAD3/SMAD4 bağımlı CAGA12-luciferaz transkripsiyon muhabir tahlilini gerçekleştirin.<ol>
<li>Adım 1'de açıklandığı gibi kültür ve trypsinize MCF10A-Ras hücreleri. Tohum hücreleri 5×10 4 hücre / kuyuda24 kuyu plakalarına koyun ve hücrelerin bir gecede yapışmasını sağlar.</li>
		<li>Tohumlamadan sonraki gün, her kuyudaki hücreleri TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferaz transkripsiyonal muhabirin polietilenini (PEI) kullanarak β-galaktosidaz ekspresyon yapının35 ve 80 ng'lik yapısı ile birlikte tercüme edin. β-galaktosidaz transfeksiyon, farklı kuyular arasındaki transfeksiyon verimliliğindeki farklılıkları normalleştirmek için kullanılır. Her deney grubunu üç taraflı olarak kurun.</li>
		<li>24 saatlik inkübasyondan sonra, serumsuz DMEM-yüksek glikozlu hücreleri aç bırakın ve 6 saat sonra, hücrelere araç kontrolü olarak TGF-β (5 ng/mL) veya ligand tampon (4 mM HCl, % 0.1 BSA) ekleyin.</li>
		<li>24 saatlik bir inkübasyondan sonra, hücreleri önceden ısıtılan PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>120 μL/kuyu 1× lizis tamponu ekleyin ve plakayı 4 °C'de 20 dakika hafifçe sallayın.</li>
		<li>Bir luminometre kullanarak luciferaz aktivitesini ölçmek için 96 kuyulu beyaz test mikro plakasının her kuyusuna 30 μL lysate aktarın.</li>
		<li>β-galaktosidaz aktivitesini ölçmek için 96 kuyulu şeffaf bir plakanın her kuyusuna 50 μL lysate aktarın.</li>
		<li>Luciferaz aktivitesini β-galaktosidaz aktivitesine normalleştirin ve biyolojik triplikatlar elde etmek için deneyleri en az üç kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TGF-β hedef genlerinin ekspresyonunun nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanılarak analiz edilmektedir.<ol>
<li>Adım 1'de açıklandığı gibi kültür ve trypsinize MCF10A-Ras hücreleri. Tohum hücreleri 5×10 5 hücre / kuyuda6 kuyu plakalarına koyun ve hücrelerin bir gecede yapışmasını sağlar.</li>
		<li>Hücreleri TGF-β (5 ng/mL) veya ligand tampon (4 mM HCl, %0,1 BSA) ile 6 saat boyunca tedavi edin ve ardından hücreleri 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Bir RNA yalıtım kiti kullanarak toplam RNA'yı izole edin.</li>
		<li>Bir NanoDrop ile RNA konsantrasyonu belirleyin ve ilk iplikçik cDNA sentez Kiti kullanarak 1 μg RNA ile cDNA sentezi gerçekleştirin.</li>
		<li>GAPDH (normalleştirme için), SERPINE1 (PAI-1 proteinini kodlamak için) için belirli insan ileri ve ters astarları içeren 10 μL reaksiyon karışımında on kat seyreltilmiş cDNA ile nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirmek için gerçek zamanlı bir PCR algılama sistemi kullanın, TGF-β/SMAD hedef geni), SMAD7 (TGF-β/SMAD hedef geni) ve qPCR Master Mix. Her deney grubunu üç taraflı olarak kurun. NOT: qRT-PCR'de hedef insan genlerini tespit etmek için kullanılan astar dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.</li>
		<li>Aşağıdaki qPCR reaksiyon koşullarını kullanın: başlatma, 3 dakika boyunca 95 °C; denatürasyon, 10 saniye için 95 °C; tavlama, 30 saniye için 60 °C; ve uzatma, 10 saniye boyunca 80 °C; denatürasyon, tavlama ve uzatma 40 kez tekrarlanır.</li>
		<li>Biyolojik triplikat elde etmek için deneyleri en az üç kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. TGF-β kaynaklı EMT analizi
<ol><li>Batı şişkinliğini kullanarak protein seviyesinde EMT belirteçlerinin ekspresyonunu analiz edin. NOT: TGF-β kaynaklı EMT analizi, örnek olarak fare NMuMG epitel hücreleri kullanılarak gösterilmiştir36,37.<ol>
<li>Kültür NMuMG hücreleri 37 °C DMEM-yüksek glikoz ortamında% 10 fetal sığır serumu ve 1:100 Pen-Strep ile desteklenmiştir. Protein izolasyonu ve tespiti için Adım 1'de açıklanan yöntemleri kullanın. NOT: Bu deneyde aşağıdaki antikorlar kullanılmaktadır: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Salyangoz, 1:1000; Sümüklüböcek, 1:1000; Tübulin, 1:1000 (Şekil 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adım 2.2'de açıklandığı gibi nicel gerçek zamanlı-PCR kullanarak mRNA düzeyinde EMT işaretleyicilerinin ifadesini analiz edin. NOT: CDH1 (E-cadherin proteinini kodlama), SALYANGOZve ZEB2 (Şekil 3) dahil olmak üzere qRT-PCR için kullanılan tüm fare astarları Tablo 1'delistelenmiştir.</li>
	<li>Dolaylı immünofluoresans ve doğrudan floresan boyama kullanarak EMT sürecini analiz edin.<ol>
<li>E-cadherin dolaylı immünofluoresans boyama<ol>
<li>Steril 18 mm'lik kare cam kapakları 6 kuyulu plakalara yerleştirin (kuyu başına bir kapak kılıfı).</li>
			<li>Tohum 1×105 NMuMG hücreleri, 6 kuyu plakası başına 2 mL tam DMEM ile ve hücrelerin bir gecede yapışmasını sağlar.</li>
			<li>Yapışan hücrelere sahip kapakları hafifçe yeni bir 6 kuyu plakasına hareket ettirin ve kuyulara 2 mL kültür ortamı ekleyin.</li>
			<li>Hücreleri 2 gün boyunca TGF-β (5 ng/mL) veya ligand tampon (4 mM HCl, %0,1 BSA) ile tedavi edin.</li>
			<li>Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1 mL önceden uyarılmış PBS ile iki kez hafifçe yıkayın.</li>
			<li>%4 paraformaldehitin 1 mL'sini ekleyerek ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırarak hücreleri sabitleyin. Ardından, hücreleri 1 mL PBS ile iki kez hafifçe yıkayın.</li>
			<li>Sabit hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca % 0,1 Triton X-100 ile permeabilize edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.</li>
			<li>PBS'de %5 BSA olan hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca tıkayın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.</li>
			<li>E-cadherin'e karşı birincil antikoru (PBS'de 1:1000 seyreltilmiş) her kapak kapağının üstüne ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Birincil antikoru çıkarın ve kapak kapağını PBS ile üç kez yıkayın.</li>
			<li>Alexa Fluor 555 ikincil antikorun (PBS'de 1:500 seyreltilmiş) her kapak kapağının üstüne ekleyin ve ışıktan korunmak için alüminyum folyo ile kaplarken oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatın.</li>
			<li>İkincil antikorun çıkarılması ve kapak kapağının PBS ile üç kez yıkanması.</li>
			<li>Kapak sapını (aşağı bakan hücreler) 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) ile montaj ortamını kullanarak cam slaytlara monte edin ve monte edilen slaytları ışıktan korunan 4 °C'de bir kutuda saklayın.</li>
			<li>SP8 konfokal mikroskopi ile boyamayı gözlemleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Filamentli (F)-aktinin doğrudan floresan boyanma.<ol>
<li>3.3.1.1 adımlarını izleyerek örnekleri hazırlayın. 3.3.1.9'a kadar.</li>
			<li>Filamentli aksini (F-actin) görselleştirmek için karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) ekleyerek hücreleri lekelayın.</li>
			<li>PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.</li>
			<li>DAPI ile montaj ortamını kullanarak kapak sapını cam slaytlara monte edin ve SP8 konfokal mikroskopi ile görüntü alın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

TGF-β/SMAD sinyalizasyonu meme kanserinin ilerlemesinde önemli bir rol oynar, çünkü EMT7'yiindükleerek meme kanseri hücre invazivliğini ve metastazını teşvik edebilir. Burada, reseptör kaynaklı SMAD aktivasyonundan SMAD aracılı transkripsiyonal ve biyolojik yanıtlara kadar TGF-β başlatılan sinyali araştırmak için mantıklı bir iş akışı tanımladık. SMAD2 fosforilasyon analizini tanımlayarak başladık, TGF-β/SMAD sinyal yanıtını analiz etmek için hem gen hem de protein seviyelerinde TGF-β kaynaklı SMAD3 bağımlı transkripsiyonal yanıtlar ve EMT işaretleyici ekspresyonu ile devam ettik ve son olarak TGF-β kaynaklı EMT'yi inceledik. TGF-β/SMAD sinyal yolu35'inaktivitesini izlemek için PAI-1 promotöründen türetilen CAGA kutularını içeren CAGA 12 -luciferase transkripsiyon muhabirini kullandık. Bu muhabir yapısı etkinleştirme için SMAD3 ve SMAD4 gerektirir. Önceki çalışmalar, SMAD4'ün devrilmesinin TGF-β kaynaklı CAGA12-luciferaz aktivitesini zayıfladığını göstermiştir37. Muhabir testine ek olarak, SMAD2 ve SMAD3 de dahil olmak üzere endojen SMAD'lerin fosforilasyon durumunu belirlemek, TGF-β sinyal yanıtını araştırmanın bir başka yoludur. Gerçekten de, büyüme ve farklılaşma faktörü (GDF)-8/myostatin ve GDF-9 gibi TGF-β ailesinin diğer üyeleri de TβRI 42,43,44'ü devreye alarak SMAD2/3 proteinleri aracılığıyla sinyalleriaktarır. CAGA12-luciferase muhabirine ek olarak, TGF-β sinyalinin aktivasyonunu tespit etmek için benzer birkaç muhabir kullanılmıştır. Örneğin, JunB promotöründen türetilen yanıt öğelerine sahip transkripsiyonal (SBE)4-Lux muhabiri, TGF-β, aktivatörler ve BMP'ler45tarafından verimli bir şekilde indüklenebilir.
Epitel belirteçlerinin (yani E-cadherin) ve mezenkimal belirteçlerin (örneğin, N-cadherin, Salyangoz, Sümüklüböcek ve Zeb2) ekspresyonunu araştırmak için klasik yöntemler olan TGF-β kaynaklı EMT'yi analiz etmek için Batı şişkinliği ve qPCR kullanılmıştır. Ayrıca E-cadherin dolaylı immünofluoresans boyama ve F-actin doğrudan floresan boyama gerçekleştirdik. Bu tahliller TGF-β tedavisinden sonra hücrelerin mezenkimal fenotipini daha da doğrulamıştır. İmmünofluoresans lekelemenin sınırlaması, hücrelerin antikorlar ve görüntüleme ile inkübasyondan önce düzeltilmesi gerektiğidir ve canlı hücrelerde EMT belirteç ifadesindeki değişiklikleri araştırmak zordur. Son zamanlarda, A549 akciğer adenokarsinom-vimentin-RFP gibi EMT muhabir hücre hatlarının tasarımı, kırmızı floresan protein (RFP) etiketli vimentin ifadesiyle epitel hücrelerinin mezenkimal hücrelere dönüşümünü gerçek zamanlı olarak izlemeyi mümkün klas hale getirmiştir. Bu platform ilaç taraması ve yeni ilaç geliştirme için kullanılabilir46. Canlı hücrelerde F-actin yapılarını lekeleyebilen 17 amino asitli bir peptit olan LifeAct boyası, hücresel işlemlere müdahale etmeden aktin sitoskeleton'u gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için değerli bir araç haline geliyor47. Bu çalışmada, TGF-β sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı EMT üzerindeki inhibitör etkilerini doğrulamak için SB431542 ve GW788388 olmak üzere iki küçük molekül inhibitörü kullandık. Özellikle GW788388, TβRI ve TβRII aktivitesini güçlü bir şekilde inhibe ederken, SB431542 sadece TβRI (ve ALK4 ve ALK7) üzerinde inhibitör bir etkiye sahiptir. Önceki çalışmalar GW788388'in SB43154240'tandaha güçlü olduğunu ortaya koydu. EMT inhibisyona ek olarak, GW788388 böbrekte fibrozis belirteçlerinin ekspresyonunu azalttı ve diyabetik farelerde GW788388'in oral olarak verilmesi glomerülopatiyi belirgin şekilde azalttı25,48.
EMT, kanser hücre plastisitesini teşvik etmede önemli bir rol oynar ve ilaç direnci ve metastaz ile sonuçlanır 49. Bu nedenle, EMT türevi hücrelerin spesifik sitotoksik ilaçlar50 ile hedeflenmesi veya mezenkimal-epitel geçişi (MET)51 yoluyla redifferentiation indüklenmesi kanser hücre metastazı ve tedavi direncinin üstesinden gelmek için bir yaklaşım olarak önerilmiştir. Bununla birlikte, MET uzak organlarda yayılan kanser hücrelerinin çoğalmasına katkıda bulunur52EMT'nin terapötik geri dönüşümlerini kullanırken ters tepebilir. Son zamanlarda, yeni bir çalışma emt türevli meme kanseri hücrelerini doğrudan adipositlere farklılaşmak için hedef alarak terapötik bir transdifferentiation yaklaşımı bildirdi30. Ishay-Ronen et tarafından yapılan çalışma. al.30, TGF-β ile uzun süreli tedaviye yanıt olarak mezenkimal hücrelere geçiş geçiren Py2T murine epitel kanser hücrelerini kullandı. Rosiglitazone'un MEK inhibitörleri ile birlikte epitel farklılaşması ve adipogenezini geliştirdiğini gösterdiler. Bununla birlikte, rosiglitazone'un tek başına mezenkimal Py2T murine hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonunu teşvik etmek için yeterli olduğunu bulduk.
Özetle, bu çalışmada kullanılan yöntemler TGF-β sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı EMT'yi araştırmak için mantıklı bir iş akışı sağlamıştır. İki inhibitör, SB431542 ve GW788388, TGF-β kaynaklı yanıtları ve EMT'yi engelleyebilir. Ek olarak, rosiglitazone'un tek başına bazı TGF-β kaynaklı mezenkimal meme kanseri hücrelerinde adipogenez indüklese neden olduğunu da gösterdik. TGF-β yanıtlarını araştırmak için sadece birkaç meme kanseri hücre hattı kullanmamıza rağmen, burada açıklanan yöntemler diğer (kanser) hücrelere tahmin edilebilir. Burada, hücresel yanıtları teşvik etmek için çeşitli TGF-β konsantrasyonları kullandık. Çoğu hücre tipinde, TGF-β biyolojik aktivitesini 0.01-10 ng/mL53 konsantrasyon aralığında uygular ve bir doz-yanıt deseninde sinyalizasyona neden olur. Sığır aort endotel hücreleri de dahil olmak üzere birincil endotel hücrelerinde, TGF-β fosforillenmiş SMAD2'nin önemli ekspresyonunun 0.025 ng/mL'de indüklendiğini, maksimum 0.25 ng/mL'ye ulaştığını ve daha yüksek konsantrasyonlara yanıt olarak bu seviyede kaldığını53. Çalışmamızda, güçlü yanıtlar elde etmek için transkripsiyonal muhabir tahlili için MCF10A-Ras hücrelerinde yüksek konsantrasyonda TGF-β (5 ng/mL) kullandık. SMAD2 fosforilasyon ve hedef gen ekspresyasyonu TGF-β tarafından düşük dozda indüklenebilir; böylece hücreleri tedavi etmek için 2,5 ng/mL TGF-β kullandık. Bununla birlikte, en uygun çalışma konsantrasyonu hücre tipine ve tahmini etkilere bağlıdır. TGF-β en iyi konsantrasyonunu belirlemek için, hücrelerin farklı dozlarda (düşükten yükseğe) tedavi etmesi önerilir.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Sitokin dönüşüm büyüme faktörü-β (TGF-β), TGF-βs (örneğin, TGF-β1, -β2 ve -β3), kemik morfojenik proteinler (BMP'ler) ve aktivinler1,2dahil olmak üzere yapısal ve işlevsel olarak ilgili düzenleyici polipeptidlerden oluşan geniş bir grubun prototipidir. Bu sitokinlerin hepsi embriyonik gelişimde ve doku ve organ homeostazlarının korunmasında önemli roller oynar3. TGF-β yanlış yönlendirilebilirliği, kanser4,5dahil olmak üzere çok çeşitlihastalıklarayol açabilir. TGF-β kanserin ilerlemesinde karmaşık, ikili bir rol oynar: normal ve premalign epitel hücrelerinde, TGF-β çoğalma inhibe ederek ve apoptoz6,7'yiindükleerek tümör baskılayıcı olarak davranır; bununla birlikte, tümör ilerlemesinin geç evresinde, onkogenlerin aktivasyonu veya tümör baskılayıcı genlerin kaybı ile sitostatik yanıtlar engellendiğinde, TGF-β kanser hücrelerinde epitelden mezenkimal geçişi (EMT) teşvik ederek tümör arttırıcı görevi görür, böylece kanser hücre invazyonunu ve metastazını mümkün kılar, tümör mikroçevreslerindeki hücrelere etki eder ve anjiogenez ve immün kaçamak8,9,10'uuyarır.
TGF-β olgun karboksi terminal TGF-β ve gecikme ile ilişkili peptit (LAP)11içeren inaktif bir öncü molekül olarak salgılanır. Bu küçük kompleks, gizli TGF-β bağlayıcı protein (LTBP)12ile birlikte bağlanabilir. Olgun TGF-β salınımı, LAP'yi ikiye ayıran spesifik proteazların etkisi veya LAP'nin integrin bağımlı bir işlemde mekanik olarak çekilmesi ile aracılık edilebilir13,14. LTBP'ye ek olarak, Glikoprotein A tekrarları baskın (GARP), düzenleyici T hücrelerinin (Tregs) yüzeyinde yüksek oranda ifade edilir ve TGF-β15,16aktivasyonunun düzenlenmesinde LTBP ile benzer bir rol oynar. GARP, disülfid bağlantı ve uyumsuz ilişki yoluyla doğrudan gizli TGF-β bağlanır. GARP/TGF-β kompleksinden TGF-β aktivasyonu17entegre gerektirir. Olgun TGF-β, sinyalizasyon başlatmak için TGF-β serine/threonine kinaz reseptörlerine, yani TGF-β tip I (TβRI) ve TGF-β tip II (TβRII) reseptörlerinebağlanır. TGF-β TβRII'ye bağlanması, TβRI'nin işe alınmasını ve heteromerik bir kompleksin oluşumunu teşvik eder. Daha sonra, TβRI kısa bir glisine ve serine bakımından zengin (GS) motifinde serine ve threonine kalıntıları üzerinde TβRII kinaz tarafından fosforillenir ve aktivasyonu19,20. Aktivasyondan sonra, aktif TβRI alt tabakalarını işe toplar ve fosforilasyonlar: SMAD2 ve SMAD3(Şekil 1)içeren iki reseptöre özgü SMAD (R-SMAD). R-SMAD'ler, proline bakımından zengin bir bağlayıcı bölgeyle ayrılan mad homology etki alanları MH1 ve MH2 ile benzer bir genel yapıyı paylaşırlar (Şekil 2). SMAD3'ün MH1 etki alanındaki DNA bağlama motifi SMAD2 ve SMAD3 arasında korunmuyor ve SMAD2, MH1 etki alanındaki iki ekleme nedeniyle (ekson 3 ve L1) DNA'yı doğrudan bağlayamıyor. SMAD2 ve SMAD3, C-terminilerinde SSXS motifinin fosforilasyonu ile aktive edilebilir (Şekil 2). Fosforilasyonlu SMAD2/3, hedef genlerin transkripsiyonunu modüle etmek için çekirdeğe geçen ortak bir SMAD aracı olan SMAD4 ile heteromerik kompleksler oluşturur (Şekil 1)7,21. Bu kurallı SMAD sinyal yolu hassas bir şekilde düzenlenir ve hücre kaderinin düzenlenmesi ve tümör hücre metastazı ve istilası22gibi spesifik hücresel ve doku yanıtları üretir. TGF-β-SMAD sinyaline ek olarak, SMAD olmayan sinyal yolları da aşağı akış hücresel yanıtlarını düzenlemek için reseptörler tarafından doğrudan etkinleştirilebilir23.
Tümör ilerlemesi sırasında EMT'nin indüksiyonu için TGF-β kaynaklı SMAD'ye bağımlı ve SMAD'den bağımsız yolların aktivasyonuna ihtiyaç vardır. EMT, tümör hücrelerinin hücre-hücre kontaktlarının kaybı ve apik-bazal polaritenin azalmasıyla ilişkili bir epitel fenotipten, gelişmiş hareketlilik ve istila yeteneğine sahip mezenkimal fenotipe adanmış geri dönüşümlü bir süreçtir24. EMT, N-cadherin, vimentin, Zeb2 ve Salyangoz1/2 dahil olmak üzere mezenkimal belirteç proteinlerinin artan ekspresyasyonu ve E-cadherin ve β-catenin (Şekil 3)25gibi epitel belirteçlerinin eşlik eden downregülasyonu ile karakterizedir. Bununla birlikte, bir epitelden mezenkimal duruma geçiş genellikle eksiktir ve hücreler karışık epitel ve mezenkimal (E/M) özellikler kazanır. Uluslararası EMT derneğinin yakın tarihli bir makalesi, ara E/M fenotipik durumlara maruz kalan hücrelerin sürecini epitel-mezenkimal plastisite (EMP)26olarak tanımlamayı önermektedir. Bu plastisite kısmi EMT, hibrit E/ M durumu, metastable EMT durumu, EMT sürekliliği ve EMT spektrumu26anlamına gelir. EMT sırasında tümör hücreleri kanser kök hücre (CSC) özellikleri kazanır ve dekupsiyon kaynaklı apoptoz27'yekarşı daha dirençli hale gelir. EMT primer tümör hücrelerinde invaziv bir fenotipin kazanılmasından sorumlu olmakla birlikte ve kanserin ilerlemesini sağlarken, buna karşılık mezenkimal-epitel geçişinin (MET) uzak metastatik bölgelerde yayılan tümör hücrelerinin büyümesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir28,29. Yeni bir çalışma, EMT türevi meme kanseri hücrelerinin adipozitlere dönüştürülebileceğini göstermiştir, bu da metastazı inhibe etme ve tümör hücrelerinde tedavi direncinin üstesinden gelme fırsatı sunabilir ve kanserin nüksetme30. Meme karsinogenezinde EMT'nin aktivasyonunda TGF-β sinyalinin önemli rolü nedeniyle, Batı şişkinliği için ayrıntılı protokoller sunuyoruz, luciferaz transkripsiyonel muhabir tahlili, nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve TGF-β sinyalizasyonunun araştırılması için immünofluoresans, TGF-β kaynaklı EMT ve EMT türevi murin meme epitel tümör hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonu. Bu teknikler hücre biyolojisi alanında en sık kullanılan analitik araçlardır. qRT-PCR, mRNA ifade düzeylerini nicel bir şekilde tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için kullanılır. Alternatif bir teknik olan nicel PCR (qPCR) ile karşılaştırıldığında, mRNA ekspresyonunu yarı nicel bir şekilde belirlemek için ters transkripsiyon (RT)-PCR kullanılabilir31,32. Batı şişkinliği, belirli bir hücre lisat örneğindeki belirli protein seviyelerini duyarlılık ve özgüllük avantajlarıyla yarı nicel bir şekilde incelemek için kullanılır. Bu nedenle, diğer sinyal yollarına da uygulanabilecek TGF-β sinyallerini araştırmaya yardımcı olmak için gen ekspresyonundan protein ekspresyona kadar değişiklikleri analiz etmek için sistematik bir iş akışı sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm-side square glass coverslips</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td></td></tr><tr><td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610920</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Slug antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9585</td><td></td></tr><tr><td>anti-SMAD2/3 antibody</td><td>Becton Dickinson</td><td>610842</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Snail antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubulin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2148</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Cholera enterotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039047</td><td></td></tr><tr><td>epidermal growth factor (EGF)</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>BioWest</td><td>S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>PROMEGA</td><td>A600X</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II kit</td><td>BIOKE&amp;acute;</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>557366-M</td><td></td></tr><tr><td>Skimmed milk</td><td>Campina: Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td>17001402</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr></tbody></table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

Büyüme faktörü β (TGF-β) dönüştürmek, hücreler arası iletişimde kilit rol oynayan gizli çok işlevli bir faktördür. TGF-β sinyallerinin pertürbasyonları meme kanserine yol açabilir. TGF-β, spesifik hücre yüzeyi TGF-β tip I ve tip II reseptörleri (tβRI ve TβRII) ile içsel serine/threonine kinaz etki alanı içeren çoğalma ve farklılaşma üzerindeki etkilerini ortaya çıkarır. TGF-β kaynaklı heteromerik kompleks oluşumu üzerine, aktif TβRI fosforilasyon SMAD2 ve SMAD3 ile hücre içi sinyal ortaya çıkarır. Bu aktif SMAD'ler, plazminojen aktivasyon inhibitörü 1 (SERPINE1 geni tarafından kodlanan PAI-1) dahil olmak üzere belirli hedef genleri düzenlemek için SMAD4 ile heteromerik kompleksler oluşturur. Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) indüksiyon, epitel kanseri hücrelerinin birincil bölgede veya uzak bölgelerde kolonizasyon sırasında invaziv bir fenotip kazanmasını ve tümörün ilerlemesini sağlamasını sağlar. TGF-β EMT kullanarak meme kanseri invazyonunun güçlü bir indükleyicisi olarak hareket eder. Burada, TGF-β sinyallerini ve EMT yanıtlarını premalign insan MCF10A-RAS (M2) hücrelerini ve fare NMuMG epitel hücrelerini kullanarak araştırmak için sistematik yöntemleri örnek olarak açıklıyoruz. Batı şişkinliği ile TGF-β kaynaklı SMAD2 fosforilasyonunu, luciferaz muhabir aktivitesini kullanarak SMAD3/SMAD4 bağımlı transkripsiyon aktivitesini ve serpine1 hedef gen ekspresyonunu nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile belirleme yöntemlerini açıklıyoruz. Ayrıca morfoloji, epitel ve mezenkimal belirteç ekspresyişi, filamentli aksin lekelenmesi ve E-cadherin immünoresans lekelenmesindeki değişiklikler ölçülerek TGF-β kaynaklı EMT'nin incelenmesi için yöntemler açıklanmaktadır. TGF-β kaynaklı SMAD2 fosforilasyon, hedef genler ve EMT belirteç ifadesindeki değişiklikleri engellemek için GW788388 ve SB431542 olmak üzere iki seçici küçük molekül TGF-β reseptör kinaz inhibitörü kullanıldı. Ayrıca mezenkimal meme Py2T murine epitel tümör hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonunu tarif ediyoruz. Meme kanserinde TGF-β kaynaklı sinyalizasyon ve EMT'yi inceleme yöntemleri meme kanseri için yeni terapötik yaklaşımlara katkıda bulunabilir.

TGF-β sinyalinin analizi TGF-β sinyalizasyonunun en önemli adımı, SSXS motifinde (Şekil 2) en karboksi terminal serin kalıntılarının fosforilasyonudur TβRI kinaz38,39. TGF-β sinyal yanıtlarını araştırmak için, Fosforilasyonlu SMAD2'nin Batı şişkinliğini gerçekleştirdik. Premalign insan meme MCF10A-Ras hücrelerinde, SMAD2 fosforilasyonu 1 saat boyunca TGF-β stimülasyonuna yanıt olarak önemli ölçüde artarken, total SMAD2/3 ifadesi TGF-β tedavisinden etkilenmemiştir (Şekil 4A). TGF-β kaynaklı SMAD3/4 odaklı CAGA-luc transkripsiyonal muhabir testini kullanarak, TGF-β MCF10A-Ras hücreleri hattındaki luciferaz muhabirini tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla belirgin bir şekilde indüklediğini tespit ettik (Şekil 4B). Ayrıca, SMAD7 ve SERPINE1 (PAI-1 proteinini kodlayan) dahil olmak üzere TGF-β iyi karakterize doğrudan transkripsiyonal gen hedeflerinin TGF-β tedavi edilen MCF10A-Ras hücrelerinde yüksek oranda ifade edildiğini gözlemledik (Şekil 4C).
TGF-β kaynaklı EMT analizi TGF-β kaynaklı EMT'yi morfolojik değişiklikler, mRNA ve protein seviyelerinde EMT belirteçlerinin ekspresyolü ve EMT belirteçlerinin immünofluoresans boyanma36gibi çeşitli yöntemlerle değerlendirdik. 1 ve 2 gün boyunca TGF-β ile tedavi edilen NMuMG epitel hücreleri, faz kontrastı mikroskopisinde gösterildiği gibi klasik bir epitel morfolojisinden iğ şeklindeki mezenkimal benzeri morfolojiye dönüşmüştir (Şekil 5A). Morfolojik değişikliklerle uyumlu olarak, TGF-β tedavisinin N-cadherin, Salyangoz ve Sümüklüböcek37 (Şekil 5B)dahil olmak üzere mezenkimal belirteçlerin protein ekspresyonunda artışa yol açtığını gözlemledik. Buna karşılık, bir epitel belirteci olan E-cadherin, 2 günlük TGF-β tedavisinden sonra NMuMG hücrelerinde küçültüldü(Şekil 5B). Ek olarak, EMT belirteçlerinin gen ekspresyonını araştırmak için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) gerçekleştirdik. CDH1 (E-cadherin proteinini kodlama) önemli ölçüde azalırken, SALYANGOZ ve Çinko parmak E-kutu bağlayıcı homeobox 2 (ZEB2) gibi mezenkimal belirteçler, NMuMG hücrelerinde TGF-β stimülasyonundan sonra tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla belirgin bir şekilde artmıştır (Şekil 5C). NMuMG hücrelerinde TGF-β kaynaklı EMT, E-cadherin immünoresans lekesi ile daha da doğrulandı. 2 gün boyunca TGF-β stimülasyonu üzerine, NMuMG hücreleri konfokal mikroskopi ile analiz edildiği gibi, yerleşik olmayan kontrol grubundaki hücrelere göre daha az E-cadherin ifade etti (Şekil 5D). Ayrıca, TGF-β varlığındaki NMuMG hücreleri, konfokal mikroskopide gösterildiği gibi daha fazla aktivin stres lifi oluşturmuştur (Şekil 5E).
SB431542 ve GW788388, TGF-β sinyalini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi inhibe eder SB431542, TβRI'nin kinaz alanının ATP rekabetçi inhibitörüdür, aynı zamanda akivin reseptör benzeri kinaz 5 (ALK5) olarak da ad altındadır, GW788388 ise TβRI ve TβRII kinaz aktivitesini inhibe eder. Her iki inhibitör de TGF-β reseptör sinyaliniengelleyebilir 40. Böylece farklı konsantrasyonlarda GW788388 olan NMuMG hücrelerini 1 saat boyunca TGF-β varlığında tedavi ettik. Beklendiği gibi GW788388, TGF-β kaynaklı SMAD2 fosforilasyonunu doza bağlı bir şekilde inhibe etti (Şekil 6A). Ek olarak, SMAD2'nin TGF-β aracılı fosforilasyonu SB431542 tedavisi ile engellendi (Şekil 6A). Fosforillenmiş SMAD2/3, SMAD4 ile heteromerik bir kompleks oluşturur ve hedef genlerin transkripsiyonunu modüle etmek için çekirdeğe yer değiştirir. Bu nedenle NMuMG hücrelerinde SMAD2/3'ün SMAD2/3'ün immünofluoresans lekesi ile translokasyonunun araştırılmasını yaptık. Veriler, hem SB431542 hem de GW788388'in TGF-β kaynaklı nükleer translokasyonu ve NMuMG hücrelerinde SMAD2/3 birikimini önemli ölçüde engellediğini göstermiştir (Şekil 6B). Ayrıca, SB431542 ve GW788388'in inhibitör etkileri, PAI-1, SALYANGOZ, E-cadherin ve Fibronektin dahil olmak üzere EMT'de yer alan önemli TGF-β hedef genlerinin mRNA ekspresyon düzeylerinde de gözlenmiştir (Şekil 6C). Bu veriler, SB431542 ve GW788388'in TGF-β sinyalini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi engellediğini öne sürdü.
Mezenkimal meme kanseri hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonunun analizi EMT, kanserlerde hücresel plastisitenin arttırıcılığında hayati bir rol oynar ve tedavi direncinin gelişmesine neden olur. Kanser hücresi plastisitesi, zorla adipogenez30gibi bir trans-farklılaşma yaklaşımı ile doğrudan hedeflenebilir ve inhibe edilebilir. Emt kaynaklı kanser hücresi plastisitesinin hücresel modeli olarak fare meme tümörü virüs-polioma orta tümör-antijen (MMTV-PyMT) transgenik farenin meme bezinden elde edilen Py2T murine meme kanseri hücrelerini kullandık. Yerleşik bir protokole dayanarak41,emt türevi Py2T murine meme kanseri hücrelerini anti-diyabetik ilaç rosiglitazone ile 10 gün boyunca adipogenez indükledik. Adipogenez, yağ kırmızısı O lekeleme kullanılarak lipit damlacıkları görselleştirilerek değerlendirildi. Rosiglitazone ile tedavi edilen Py2T murine meme kanseri hücrelerinde yağ hücreleri kolayca tespit edildi (Şekil 7), rosiglitazone ile tedavinin tek başına EMT türevi meme kanseri hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonunu teşvik etmek için yeterli olduğunu göstermiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> Şekil 1: TGF-β/SMAD sinyali. TGF-β sinyalizasyon, TGF-β TGF-β tip I reseptörü (TβRI) fosforilasyon gösteren, kesin olarak aktif bir kinaz olan TGF-β tip II reseptörüne (TβRII) bağlanmasıyla başlatılır. Daha sonra, aktif TβRI kinaz fosforilitleri SMAD2/3. Fosfor-SMAD2 'yi (p-SMAD2) tanıyan poliklonal antisera elde etmek için iki karboksi terminal fosforilasyonlu serin kalıntısı ile SMAD2'nin SSXS motifini içeren bir peptit kullanıldı. Bu nedenle, p-SMAD2 ekspresyonunun Batı blottingi ile analizi, TGF-β sinyal yolunun aktivasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Fosforillenmiş SMAD2/3, SMAD4 ile heteromerik kompleksler oluşturabilir ve daha sonra transkripsiyonal yanıtları modüle etmek için çekirdeğe yer değiştirebilir. SMAD7 ve SERPINE1 (PAI-1 proteinini kodlayan) gibi TGF-β hedef genlerinin mRNA ekspresyonu için CAGA12-luciferase muhabir tahlili ve nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR), TGF-β kaynaklı SMAD3 bağımlı transkripsiyonal yanıtları analiz etmek için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> Şekil 2: R-SMAD'lerin şematik yapısı (SMAD2 ve SMAD3). MH1 (mavi) ve MH2 (sarı) etki alanları R-SMAD'ler arasında korunur, ancak bağlayıcı bölge (gri) korunmuyor. SMAD3'ün MH1 etki alanı DNA bağlayıcı bir motif barındırırken, SMAD2, MH1 etki alanına bir ekleme (exon 3) nedeniyle DNA'yı doğrudan bağlayamaz. MH2 alan adı SMAD oligomerizasyonuna, TGF-β reseptörleriyle etkileşime ve protein bağlanmasına aracılık eder ve transkripsiyonal düzenlemede yer almaktadır. SMAD2 ve SMAD3, C terminilerinde SSXS motifinin (kırmızı) fosforilasyonu ile aktive edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> Şekil 3: TGF-β kaynaklı EMT. TGF-β kaynaklı epitel-mezenkimal geçiş (EMT) sırasında hücreler epitel kaybına uğrar ve gelişmiş hücre hareketliliği ve invazyon yeteneği ile mezenkimal özelliklerin kazanılmasına maruz kaldı. EMT indüksiyonu, N-cadherin, Zeb2 ve Salyangoz1/2 gibi mezenkimal belirteçlerin ekspresyonunun yanı sıra E-cadherin, β-catenin ve claudin-1 gibi epitel belirteçlerinin küçültülmesine yol açar. Epitel/mezenkimal (E/M) özelliklerinin birikmiş kaybı veya kazancı, bir hücrenin geri dönüşümlü olarak ara durumlara girmesine neden olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> Şekil 4: MCF10A-Ras hücrelerinde TGF-β sinyal yanıtları. (A) MCF10A-Ras hücreleri 1 saat boyunca TGF-β (2.5 ng/mL) ile veya olmadan tedavi edildi ve fosforillenmiş SMAD2 (p-SMAD2), total SMAD2/3 ve GAPDH (yükleme kontrolü olarak) için hücre lysatları immünblott edildi. Boyut işaretçisi sağda gösterilir. Con: TGF-β tedavisi olmayan kontrol grubu. (B) MCF10A-Ras hücrelerinde SMAD3-SMAD4 bağımlı CAGA 12 -luciferaz (LUC) transkripsiyonal muhabiri kullanılarak TGF-β(5ng/mL) aktivitesinin analizi. Değerler β-galaktosidaz (βGal) aktivitesine normalleştirilir. Veriler ortalama ± s.d, n = 3 olarak ifade edilir. Öğrencinin t testi, ***P ≤ 0.001 (C) QRT-PCR analizi TGF-β hedef genleri SMAD7 ve SERPINE1 (PAI-1 proteinini kodlayarak) MCF10A-Ras hücrelerinde TGF-β (2.5 ng/mL) ile 6 saat boyunca tedavi edilir. GAPDH bir iç kontrol olarak kullanıldı. Veriler ortalama ± s.d, n = 3 olarak ifade edilir. Öğrenci sınavı, ***P ≤ 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> Şekil 5: NMuMG hücrelerinde TGF-β kaynaklı EMT. (A) 1 veya 2 gün boyunca TGF-β (2.5 ng/mL) ile tedavi edilen NMuMG hücrelerinin morfolojisi. TGF-β varlığında, NMuMG hücreleri mezenkimal fenotipe dönüştü. Ölçek çubuğu = 150 μm (B) NMuMG hücreleri 2 gün boyunca TGF-β (5 ng/mL) ile veya olmadan tedavi edildi ve EMT belirteçleri Batı şişkinliği ile analiz edildi. Boyut işaretçisi sağda belirtildiği gibidir. Con: TGF-β tedavisi olmayan kontrol grubu. (C) TGF-β (5 ng/mL) ile 2 gün boyunca tedavi edilen NMuMG hücrelerinde EMT belirteçlerinin(CDH1 (E-cadherin proteinini kodlayan), SALYANGOZ ve ZEB2) gen ekspresyon analizi. GAPDH bir iç kontrol olarak kullanıldı. Sonuçlar ortalama ± s.d., n = 3 olarak ifade edilir. Öğrenci t-testi, *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. (D) NMuMG hücreleri 2 gün boyunca TGF-β (2.5 ng/mL) tedavisinden sonra epitel belirteci E-cadherin (kırmızı) ekspresyonunun saptanmasını sağlamak için immünoresans ile lekelendi. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşı konuldu. Görüntüler konfokal mikroskopi ile çekildi. Ölçek çubuğu = 50 μm (E) NMuMG hücreleri F-aksini görselleştirmek için floresan-phalloidin (yeşil) ile boyandı. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşı konuldu. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> Şekil 6: TGF-βsignaling ve TGF-β kaynaklı EMT, SB431542 ve GW788388 tarafından inhibe edildi. (A) NMuMG hücreleri, 1 saat boyunca TGF-β (5 ng/mL) varlığında veya yokluğunda 10 μM SB431542 (SB) veya belirtilen GW788388 (GW) konsantrasyonları ile tedavi edildi. Hücre lysatları p-SMAD2, SMAD2/3 ve GAPDH için immünblott edildi. (B) NMuMG hücreleri, 1 saat boyunca 5 ng/mL TGF-β varlığında veya yokluğunda 5 μM SB431542 (SB) veya 10 μM GW788388 (GW) ile tedavi edildi ve SMAD2/3'ün (yeşil) nükleer translokasyonunun tespiti için immünoresans ile lekelendi. Görüntüler konfokal mikroskopi ile çekildi. (C) PAI-1 ve SALYANGOZ, E-Cadherin ve Fibronektin dahil olmak üzere EMT belirteçlerini kodlayan genler de dahil olmak üzere TGF-β hedef genlerinin ekspresyasyonu, SB veya GW tedavisinden sonra NMuMG hücrelerinde ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve TGF-β stimülasyonu ile 48 saat boyunca analiz edildi. GAPDH bir yükleme kontrolü olarak hizmet etti. Denetim, tedavi edilmeyen hücreleri gösterir. Bu rakam Petersen M. ve ark. Yayıncıdan izin aylak 34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> Şekil 7: EMT türevi Py2T murine meme kanseri hücreleri adipositlere farklılaşmak için indüklenebilir. Py2T murine meme kanseri hücreleri 2 ng/mL TGF-β ile 20 gün boyunca komple EMT'ye indüklendi. Daha sonra, hücreler mezenkimal kanser hücrelerinin farklılaşmasına izin vermek ve adipogenez indük etmek için 10 gün boyunca bir araç kontrolü veya rosiglitazone (2 μM) olarak DMSO ile tedavi edildi. Ortam her 2 günde bir değiştirildi. 10 günlük tedaviden sonra, hücreler yağ kırmızısı O ile <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">boyandı.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tür</td>
			<td>Gen adı</td>
			<td colspan="2">İleri (5' ila 3')</td>
			<td colspan="2">Ters Çevir (5' ila 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Insan</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAACTGCTTAGC</td>
			<td colspan="2">GGCATGGACTGTGGTCATGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAGATGCTGTGCCTTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCGAATTGAGCTGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SERPINE1</td>
			<td colspan="2">CACAAATCAGACGGCAGCACT</td>
			<td colspan="2">CATCGGGCGTGGTGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Fare</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC</td>
			<td colspan="2">AAGATGGTGATGGGCTTCCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTGACGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">GAGGATGTACTTGGCAATGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Salyangoz</td>
			<td colspan="2">CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCTCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCATTGCATCATCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: qRT-PCR için kullanılan astarlar.

Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-Î² Signaling and TGF-Î²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Bu sinyalleme yolunda yer alan protein ve gen ekspresyonlarını inceleyerek TGF-β sinyallerini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi araştırmak için sistematik bir iş akışı tanımlıyoruz. Yöntemler arasında Batı şişkinliği, luciferaz muhabiri tahlili, qPCR ve immünoresans lekeleme saydır.

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.6K Görüntüleme.  Leiden University Medical Center. Bu sinyalleme yolunda yer alan protein ve gen ekspresyonlarını inceleyerek TGF-β sinyallerini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi araştırmak için sistematik bir iş akışı tanımlıyoruz. Yöntemler arasında Batı şişkinliği, luciferaz muhabiri tahlili, qPCR ve immünoresans lekeleme saydır.

Video: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Tıp

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Gelişim Biyolojisi

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

Sarkoma Hücreler Mezenkimal-Epitel Geçişler endüklenmesi

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

Fare Meme Epitel HC11 ve EpH4 Hücrelerinin Farklılaşması

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Kanser Araştırmaları

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Bir Modifiye<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Biyomühendislik

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Biyoloji

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β aracılı Endotelden Mezenkimal Geçişe (EndMT) ve CRISPR/Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak EndMT Efektörlerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler