Yazarlar heterolog biyosentezi adanmış projeleri desteklemek için fon NIH (AI074224 ve GM085323) ve NSF (0712019 ve 0924699) teşekkür ederim.

Aşağıdaki metin eritromisin A antibiyotik için spesifik olan, ancak adımları heterolog biyosentezi için aday olan diğer doğal ürünler için genel olarak uygulanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır. 1. Eritromisin A Genetik Küme Transferi <ol><li> Tasarım PCR primerleri S. içindeki eritromisin A kümesi ile ilişkili genlerin tüm yükseltmek için Eritre kromozom. Bu adım olan genetik dizileri tespit edilmiş olan doğal ürün adaylar özgüdür. Alternatif olarak, gerekli genlerin yeni sentezlenen genlerin yeni E. içinde optimum kodon kullanım için tasarlanmış olacağını avantajı ile (birkaç ticari satıcı seçenekleri arasında) sentez edilebilir coli konak. DNA sentezi takip edilirse, güncel bir meydan uzunluğu 10 kb aşabilir megasynthase genler oluşturuyor. Teknik olarak, sentez gerçekleştirilebilir, ancak zor ve pahalı olabilir. Bu tahmin edilmektedir ki sürekli improvemgen sentezi teknolojisi hastaların mevcut sakıncaları gidermek ve daha heterolog genetik materyali sağlamak için bu yaklaşımı doğrular. </li><li> Taze hazırlanmış S. kullanılarak PCR gerçekleştirin Şablon olarak genomik DNA Eritre. Kromozomal DNA S. kültürlerinden hazırlanabilir Eritre veya bakterinin dondurulmuş stoklarından (Şekil 3) 25. PCR reaksiyonları, hedef olarak yüksek G+ C içeriğine için hesap DMSO ilave (50 ul reaksiyon içinde 4 ul) yararlanabilir S. Eritre genler. Her amplifiye gen tam gen geri alındığını ve hiçbir mutasyon PCR işlemi sırasında tanıtıldı onaylamak için sıralı olmalıdır. </li><li> Kısıtlama sindirimi ve ligasyon ile, E. için tasarlanmış ekspresyon vektörleri içine izole edilmiş genlerin her biri eklemek coli (Şekil 3). Bu, eski haline uygun sindirim ve ligasyon izin vermek için PCR primerleri, içinde kısıtlama siteleri tasarlanması ile başlatılırdepresyon vektörleri (örneğin Şekil 3 &#39;de dahil edilmiştir). Biz pET21 ve pET28 vektörü kullanılmıştır. PET28 vektörü eritromisin A durumda, gen ekspresyonu destekli bir 5 &#39;lider sekansı dahil edilmesine olanak vermektedir. RT-PCR, SDS-PAGE analizi (çözünür protein fraksiyonları kullanılarak), ya da uygun fenotipik analizi (Şekil 4) vasıtasıyla ayrı gen ekspresyonunu kontrol edin. </li><li> Başarıyla bireysel ifade plazmid (Şekil 3) genlerin dayalı operonlar Construct. Biz geleneksel sırayla operonlar genlerin dönüştürmek için uyumlu yapışkan restriksiyon enzimleri (örneğin xba I ve SPE I gibi) 24 bileşimi kullanılmaktadır, ancak operon inşaat için seçilen kısıtlama siteleri içinde ikamet etmemelidir (veya çıkarılması gerekir) izole gen dizileri (gen sentezi kullanılması durumunda önlenebilir bir sorun). Bu adım, E. önce 20 eritromisin A genleri birleştirir coli transfoMüşavirliğimizin. Şu anda, biz bir standart pET vektör (~ 10 kb iki genin her biri) yabancı DNA&#39;nın 20 kb eklemek için bu yöntemi kullandık. Ayrıca, dokuz genleri içeren operonlar oluşturmak için bu yaklaşımı kullanmış. Ancak, yukarıda belirtilen ölçütleri eritromisin biyosentetik gibi karmaşık sistemler için bir referans sağlayacaktır; Bu tam olarak ne kadar DNA veya kaç genlerin pET tip plazmidler entegre olabilir bilinmemektedir. Son olarak, standart in vitro ligasyonu adımları ve sonraki başarılı dönüşüm adımları operon ve plazmid büyüklüğü arttıkça giderek zorlaşmıştır. Ligasyon sıcaklığına (12-22 ° C) ve zaman (3-24 saat) çeşitlidir ve elektro-dönüşüm son plazmid yapıları üretme sürecine yardımcı olmak için kullanılır. </li><li> E. içine yeni tasarlanmış biyosentetik plazmidler Dönüşümü coli elektro-dönüşüm (Şekil 5) kullanarak BAP1 süzün. Prosedürü plazmid ile denenebilir ya sırayla ya da eş tanıtıldımbination. Boyutu-mümkün ve çok sayıda plazmidler dönüştürürken, biz geleneksel elektro-dönüşüm (gibi kimyasal dönüşüme karşı) kullandık. Bir kez dönüştürülmüş levha tetrasiklin (5 mg / l), karbenisilin (100 mg / l), kanamisin (50 mg / L), streptomisin (50 mg / l) ve Apramycin (ihtiva eden katı LB ortamı üzerine, hücreler 50 mg / l ) plazmid bakım için seçin. Bir E. altı farklı seçim antibiyotikler dönüşüm sonrası kullanımı oldukça sıradışı coli hücre, ancak bu sadece son eritromisin A biyosentezi sağlamak için gerekli plazmid toplam sayısını gösterir. Mümkün olsa da kültürleme (aşağıya bakınız) başladıktan sonra, yaklaşımı bileşiğin üretim kapasitesini sınırlar. </li></ol> 2. E. coli Biyosentetik Sulandırma <ol><li> Gerilme BAP1 biyosentezi için gerekli olan substratlar sağlamak ve post-Çevrimsel deoxyerythronolide B megasynthase değiştirmek üzere dizayn edilmiştir. Eryt Bireysel genlerhromycin bir yolu gen ekspresyonu için test ve ifade plazmid içine operonlar olarak konsolide edilmiştir. Bu bölüm, tam eritromisin A yolun ortak etkinlik için test etmek için kültür koşulları ayrılmıştır. </li><li> Taze dönüştürülmüş BAP1 3 ayrı koloniler al ve istenilen plazmid seçim antibiyotikler (aynı konsantrasyonlarda katı ortam üzerinde transformantlar için seçmek için yukarıda belirtildiği gibi) ihtiva eden 1.5 ml LB kültür, izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG aşılamak, 100 uM gen ifadesi ve bio-sentetik hücre içi haberci oluşumunu desteklemek için propiyonat, 20 mM sodyum indüklemek için) ve arabinoz (2 mg / ml). Üretim teyit edildikten sonra, daha büyük kültürler ürün büyütmek titreleri ve en üst düzeye çıkarmak için bir girişim olarak yapılabilir. </li><li> 22, Kültür hücrelerinin ° C&#39;de, 24-48 saat boyunca 250 rpm. Bu durumda, antibiyotik seçimi istenilen plazmid hücre kültürünün erken aşamalarında muhafaza edilmesini sağlar. Bununla birlikte, plazmidSeçimi antibiyotik seviyeleri kültür dönemi boyunca değiştirmek gibi s kolayca kaybolabilir. Bu da üretim kapasitesi de sınırlar plasmidi kararsızlık (yani, kültür sırasında bir ya da daha fazla plazmid kaybı), yol açabilir. Uyumsuz plazmidler tam heterolog gen küme tanıtmak için kullanıldığında sorun artar. Bu tür eritromisin A bileşiği (Şekil 5) için durum böyle değildir ve gerçekten E. bileşik fazla üretmek için telafi edilmesi gerekir coli. Bununla birlikte, ilk üretim gösterilmesi amacıyla, bu tür tasarım kusurları süratle heterolog bir yaklaşım olabilirliğini oluşturulması uğruna tolere edilir. </li><li> Bir Eppendorf mikrofuge&#39;de 10.000 rpm&#39;de santrifüj yoluyla kültürler netleştirin. Analizi için 4 de süpernatant ve mağaza ° C çıkartın. </li><li> Eritromisin A, bileşim üretimi eksikliği durumunda pGro7 kullanılarak Groes / EL chaperonin (maddesinin ilavesi ile ele alındıözel enzimler sonrası ifade aktivite eksikliği) ve ek gen kopyalarının (zayıf ekspresyon / aktivite şüphesi bulunan genler için) dahil ele. Benzer stratejiler Diğer heterolog doğal ürün üretim çabaları ile gerekli olabilir. </li></ol> 3. Ürün Analizi <ol><li> Bir oluşum onaylamak ve eritromisin ölçmek için, LC-MS sistemi (Şekil 6) üzerine kültür süpernatant enjekte. Ticari olarak temin edilebilen eritromisin A üretim onaylamak ve nicelendirilmek esnasında bir standart olarak kullanılmıştır. Ticari olarak mevcut standartlar olmadan durumlarda, LC-MS ve NMR analizi, yüksek çözünürlükte kütle spektrometrisi ile ek kimyasal nitelemeyi gerektirecektir. </li><li> BAP1 dönüşümü 3 koloni / kültürler arasındaki üretim karşılaştırın. Yüksek yapımcı seçin ve koloni kaynağından bir gliserol stoku hazırlamak. Bu adım, Protokol Bölüm üretim kültürleri ile paralel olarak yapılabilirGliserol stokları hazırlamak kültürlerin küçük bir bölümünü kullanarak 2. Bir -80 ° C derin dondurucuda gliserol stok saklayın. </li><li> Teyit, yüksek üreten hücre stoku kullanarak, ayrı bir üretim kültürünün başlaması ve etil asetat 2x hacmi ile son süpernatant ayıklayın. Özü kuru ve 100 ul metanol içinde tekrar süspansiyon için bir vakum buharlaştırıcı sistemi kullanın. Steril bir filtre disk (~ 1/4 inç çapında) özü aktarın ve disk kurumasını bekleyin. Ayrı, kültür B. gecede LB sıvı subtillis. B. 20 ul ekle 45 sıvı LB agar 20 ml subtilis kültür ° C. Plaka agar ve katılaşmaya izin. 37 ° C (Şekil 7) ve levha üzerinde inkübe filtre diski yerleştirin. Alternatif olarak, ekstrakt bir plaka okuyucu (Şekil 7) kullanılarak etkinlik miktarını belirlemek için bir 96-gözlü tabak içindeki sıvı kültüre eklenebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Adrio, J. L., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+improvement+of+processes+yielding+microbial+products.">Genetic improvement of processes yielding microbial products.</a> FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).</li><li>Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+an+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea+for+stable+expression+of+the+Vitreoscilla+haemoglobin+gene+(vhb).">Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb).</a> Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modulation+of+the+overexpression+of+tailoring+genes+eryK+and+eryG+leading+to+the+improvement+of+erythromycin+A+purity+and+production+in+Saccharopolyspora+erythraea+fermentation.">Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).</li><li>McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Ilotycin,"+a+new+antibiotic.">"Ilotycin," a new antibiotic.</a> Antibiot &amp; Chemother. 2, 281-284 (1952).</li><li>Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+erythromycin+production+in+a+genetically+engineered+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea.">Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea.</a> Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).</li><li>Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+uptake+rate+optimization+with+nitrogen+regulation+for+erythromycin+production+and+scale-up+from+50+L+to+372+m3+scale.">Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale.</a> Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).</li><li>Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+options+for+the+heterologous+production+of+complex+natural+products.">Methods and options for the heterologous production of complex natural products.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).</li><li>Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusually+large+multifunctional+polypeptide+in+the+erythromycin-producing+polyketide+synthase+of+Saccharopolyspora+erythraea.">An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.</a> Nature. 348, 176-178 (1990).</li><li>Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+genes+required+for+complex+polyketide+biosynthesis.">Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis.</a> Science. 252, 675-679 (1991).</li><li>Salah-Bey, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+for+the+elucidation+of+deoxysugar+biosynthesis+in+the+erythromycin+producer+Saccharopolyspora+erythraea.">Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea.</a> Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).</li><li>Summers, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+and+mutagenesis+of+genes+from+the+erythromycin+biosynthetic+gene+cluster+of+Saccharopolyspora+erythraea+that+are+involved+in+L-mycarose+and+D-desosamine+production.">Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production.</a> Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).</li><li>Corre, C., Challis, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+natural+product+biosynthetic+chemistry+discovered+by+genome+mining.">New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).</li><li>McAlpine, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+understanding+and+use+of+the+genomic+base+of+microbial+secondary+metabolite+biosynthesis+for+the+discovery+of+new+natural+products.">Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products.</a> J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).</li><li>Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+basis+for+natural+product+biosynthetic+diversity+in+the+actinomycetes.">Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).</li><li>Oliynyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+erythromycin-producing+bacterium+Saccharopolyspora+erythraea+NRRL23338.">Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338.</a> Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).</li><li>Wilkinson, B., Micklefield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+and+engineering+natural-product+biosynthetic+pathways.">Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).</li><li>Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+exploiting+intermodular+communication+in+polyketide+synthases.">Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases.</a> Science. 284, 482-485 (1999).</li><li>Quadri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Sfp,+a+Bacillus+subtilis+phosphopantetheinyl+transferase+for+peptidyl+carrier+protein+domains+in+peptide+synthetases.">Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases.</a> Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).</li><li>Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+complex+polyketides+in+a+metabolically+engineered+strain+of+E.+coli.">Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli.</a> Science. 291, 1790-1792 (2001).</li><li>Lee, H. Y., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay-guided+evolution+of+glycosylated+macrolide+antibiotics+in+Escherichia+coli.">Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli.</a> PLoS Biol. 5, e45 (2007).</li><li>Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+potent+antibacterial+polyketide+erythromycin+C+in+Escherichia+coli.">Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).</li><li>Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+engineered+Escherichia+coli+for+efficient+production+of+glycosylated+natural+products.">Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products.</a> Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).</li><li>Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+E.+coli+erythromycin+a+production+through+the+application+of+metabolic+and+bioprocess+engineering.">Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering.</a> Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).</li><li>Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+biosynthesis+of+erythromycin+A+and+designed+analogs+using+E.+coli+as+a+heterologous+host.">Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host.</a> Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

2) biyosentetik sulandırma, ve 3) ürün analizi 1) Genetik aktarım: heterolog biyosentezinde Kritik adımlar sürecinde üç usul noktaların her birinde rastlanır. Herhangi bir aşamada bir sorun heterolog biyosentezi kurulması nihai hedefi rayından olacak. Bu kesinlikle başarılı analizine olanak gerekli olduğundan Belki de sürecin en zor yanı, sulandırılmış biyosentezi kuruyor. Ancak, sulandırma nihai biyosentezi sorumlu genetik materyalin dikkatli bir tasarım ve transferi bağlıdır. Aynı şekilde...

Eritromisin A Gram pozitif toprak bakterisi Saccharopolyspora Eritre tarafından üretilen bir poliketid antibiyotik ve mevcut üretim aşamalı geleneksel mutagenez ve tarama protokolleri on yıllar boyunca ve daha yakın proses optimizasyonu düzenleri 1-6 yoluyla ~ 10 g / L için geliştirilmiştir. Mutagenezi ve tarama stratejileri kültür ve / zorluklar sonucu veya genetik olarak yerli üretim ana manipüle ve çünkü hazır antibiyotik etkinlik veya seçimle yardım etmek için geliştirilmiş büyüme fenotipleri antibiyotik doğal ürün geliştirme yaygındır. Eritromisin A, S. durumunda, Eritre üretim ve yeni türevleri biyosentezini engellemektedir hızlı gelişmeler, böylece, bir yavaş büyüme profil ve daha doğrudan genetik manipülasyon teknikleri eksikliği (E. coli gibi canlılar için göreli) ile sınırlıdır. Üretim sorunları tanınan ve diversificati kilidi olmasıeritromisin A gibi bileşikler ile olanakları hakkında, araştırma topluluğu heterolog biyosentezi (Şekil 1) 7 fikrini sürdürmeye başladı. Bu çabalar eritromisin A gen kümesi 8-11 kullanılabilir sırası bilgilerinin çakıştı. Bu kodlanmış tıbbi potansiyeline erişmek için heterolog biyosentezinde çabaların sürdürülmesi ivme sağlayarak, sıralı karmaşık doğal ürün gen kümelerinin sayısını büyük ölçüde 12-16 genişletti vurgulanmalıdır. Bunu yapmak için, heterolog sulandırılması yeni konak spesifik biyosentetik ihtiyaçlarını karşılamak gerekir. E. coli teknik kolaylık, moleküler biyoloji teknikleri geniş kapsayan seti, ve ürün geliştirme için metabolik ve proses mühendisliği stratejileri sağlar. Ancak, yerli üretim ana, E. karşılaştırıldığında koli kompleks doğal ürün üretiminin aynı seviyede sergilemez. Bu nedenle bilinmeyen E olsun. coli karmaşık doğal ürün sentezi için uygun bir heterolog seçenek olarak hizmet verebilir. Bununla birlikte, bu kabul edildiği E. heterolog biyosentezi başarılı olabilir eğer coli ideal bir konak organizma olacaktır. Akılda Bu amaçla, ilk çabaları 6-deoxyerythronolide B (6dEB) E. aracılığıyla poliketid aglikon üretmeye başladı coli. Ancak, yerli E. coli metabolizmasının propiyonil-KoA kayda değer düzeylerde sağlamak olamazdı ve (2S)-metilmalonil-CoA prekürsörlerinin 6dEB biyosentezi desteklemek için de yeni bir konak sonrası Çevrimsel deoxyerythronolide B sentaz (DEBS) enzimler değiştirmek olabilir gerekli. Bu sorunları çözmek için, yerli ve heterolog enzimleri oluşan bir metabolik yolun E. içine inşa edilmiştir Eksojen beslenen propionat (2S)-metilmalonil-CoA sonra propionil-CoA ve dönüştürülmüş hücre içinde olduğu bu coli, bu yolun tamamlamak için mühendislik sırasında, bir sfp gen inci içine yerleştirildiE. e kromozom yeni bir gerginlik üretmek için coli BL21 (DE3) BAP1 adlandırılır. Sfp enzim DEBS enzimler 17,18 için 4&#39;-phosphopantetheine kofaktör bağlamak bir phosphopantetheinyl transferaz yeteneğine sahiptir. Üç DEBS genleri (her biri yaklaşık 10 kb) sonra indüklenebilir T7 arttırıcılar ihtiva eden iki ayrı ayrı ifade vektörleri seçilebilir yerleştirildi. Postindüksiyon sıcaklığı (22 ° C) önemli bir ayardan sonra, DEBS genler koordineli 6dEB 19 üretme yeteneğine sahip bir aktif devlet BAP1 içinde ifade edildi. Tam eritromisin peşinde bir biyosentezi ardından Micromonospora megalomicea gelen benzer bir gen küme veya S. gelen genlerin oluşan melez bir yolu kullanmaya başladı Eritre, S. fradiae, ve S. sırasıyla ara eritromisin C ve 6-deoxyerythromycin D, 20-22 üretilmiş venezuelae. Son zamanlarda, bizim grup erythrom üreterek bu çabaları genişlettiE. aracılığıyla ycin A (eritromisin klinik olarak en-ilgili formu) coli. Önceki çalışmaları aksine, bizim strateji koordineli 20 orijinal S. ifade Eritre genler poliketid biyosentezi, deoxysugar biyosentezi ve eki, ek terzilik, ve öz-direnci (Şekil 2) için gerekli. Toplamda, 26 (yerli ve heterolog) genleri E. izin geliştirilmişti A 4 mg / L 23,24 Eritromisin de üretmek için coli. Bu sonuç, E. kullanılarak kompleks bir poliketid doğal ürün komple üretim kurulmuş coli ve kaldıraç bu yeni üretim seçeneği veya yenilerini takip için bir temel olarak hizmet vermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> PCR makinesi </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler kişisel </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td> Balıkçı </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroporatör </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Balıkçı </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum propiyonat </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinoz </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Soğutmalı Çalkalayıcı </td><td> Thermo Scientific </td><td> Maxq 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrofuge&#39;de </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D Santrifüj </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Chaperone Plazmid Set (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, pCDF-Duet-1 </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 69742-3, 69.864, 71.340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Etil asetat </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Vakum santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> Yoğunlaştırıcı 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Rotary Evaporatör </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

Karmaşık doğal ürünlerin heterolog üretimi mevcut sınırlamalar ve gelecekteki olanakları yönelik olarak tasarlanmış bir yaklaşımdır. Bu, tedavi edici değere sahiptir fakat yeterince üretilmiş ya da üretim geliştirilmiş bir şeklinde yararlanacak edilemeyen bileşikler için özellikle yararlıdır. ; 2) heterolog sulandırma ve 3) ürün analizi 1) gen transferi: dahil deneysel prosedürleri üç bileşenden ayrılabilir. Her deneysel bileşen zorlukları karşılamak ve yeni ortaya çıkan bu yaklaşım ile ilişkili fırsatları öngörmeye sürekli iyileştirme altında. Heterolog biyosentez değerli bir doğal ürün sorumlu genetik dizisinin kimliği ile başlar. Heterolog bir host bu sıra aktarma ürünün oluşumundan sorumlu biyosentetik karmaşıklığı nedeniyle karmaşıklaşır. Bir antibiyotik eritromisin iyi bir örnektir. Yirmi gen ()&gt; 50 kb toplam nihai biyosentezi için gereklidir. Buna ek olarak, bu genlerin üç boyutlu olarak megasynthases, çoklu alan enzimlerin her biri ~ 300 kDa kodlamaktadır. Bu genetik materyal olarak tasarlanmış ve E. transfer edilmelidir Sulandırılan biyosentezi için coli. PCR izolasyon, operon yapı, çok-cystronic plazmidler, ve elektro-transformasyon kullanımına E. eritromisin A genetik küme aktarılması olarak tarif edilecektir coli. Sonra transfer, E. coli hücre nihai biyosentezi desteklemesi gerekir. Bu süreç aynı zamanda E. arasındaki önemli farklılıklar verilir meydan okuduğunu coli ve karmaşık doğal ürün oluşumundan sorumlu en özgün ana. Hücre biyosentezi desteklemek için gerekli ortamlar sağlarlar ve koordineli aktif enzimleri üretmek için aktarılan genetik kümede ifade etmelidir. Eritromisin A, E. halinde coli hücre iki öncüleri (pr sağlamak üzere tasarlanmış olması gerekiyorduopionyl-CoA ve (2S)-metilmalonil-CoA) biyosentezi için gereklidir. Buna ek olarak, gen sekans değişiklikleri, plazmit kopya sayısı, chaperonin birlikte ekspresyonu, post-translasyonel enzimatik modifikasyon ve işlem sıcaklığının aynı zamanda nihai eritromisin A oluşumuna izin vermek için gerekli idi. Son olarak, başarılı üretim değerlendirilmelidir. Eritromisin bir olgu için, iki yöntem sunacak. İlk sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) üretim onaylamak ve ölçümüdür. Eritromisin A biyoaktivitesi de antibiyotik aktivite Bacillus subtilis karşı test edildiği bir biyo-analizi kullanımı yoluyla teyit edilecektir. E. eritromisin kurmak değerlendirme deneyleri A biyosentezi üretimi artırmak veya çeşitlendirmek için gelecek mühendislik çalışmaları için ve bu yaklaşımı kullanarak yeni kompleks doğal bileşiklerin üretimi için sahne coli ve ayarlayın.

Bu yaklaşımın istenilen sonucu E. tamamen biyoaktif doğal ürünün üretim konak heterolog coli. Bu, en iyi üretim (Şekil 6) ve (Şekil 7) nihai aktivitesini teyit etmek için kullanılan antibakteriyel biyoassay onaylamak ve ölçmek için kullanılan LC-MS sonuçlar ile temsil edilir. Heterolog biyosentezinin genel düzenlemesinde, bu sonuç, başarı tanımlar. Bir kez başarılı, araştırma çabalarının ardından optimizasyonu (hem hücresel hem de süre...

Watch this Scientific Journal Video about The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. 

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Yoluyla eritromisin A heterolog biyosentezi<em&gt; E. coli</em; 2) heterolog sulandırma ve 3) ürün analizi 1) Genetik aktarım:&gt; aşağıdaki deneysel adımları içerir. Her adımı kullanarak tedavi doğal ürünlerin üretiminde motivasyon, potansiyeli ve zorluklar bağlamında ele alınacak<em&gt; E. coli</em&gt; Bir vekil sunucu olarak.

A ile Üretilen Kompleksi Antibiyotik Eritromisin Featuring Mantık, Deneysel Merdivenleri ve Heterolog Doğal Ürün biyosentezi Potansiyeli<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K Görüntüleme.  State University of New York at Buffalo. Yoluyla eritromisin A heterolog biyosentezi E. coli aşağıdaki deneysel adımları içerir. Her adımı kullanarak tedavi doğal ürünlerin üretiminde motivasyon, potansiyeli ve zorluklar bağlamında ele alınacak E. coli Bir vekil sunucu olarak.

Video: The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Biyoloji

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Brüt Diseksiyon Lobster Mide, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Dalga boyundaki ve Oksidatif Stres Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık Terapisi şiddetler bir Range Etkilerinin Değerlendirilmesi için Yöntemi<em&gt; İn Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication machinery. The stalling of a replisome can lead to its dissociation from the chromosome, either in part or its entirety, leading to the collapse of the replication fork. The recovery from this collapse is a necessity for the cell to accurately complete chromosomal duplication and subsequently divide. Therefore, when the collapse occurs, the cell has evolved diverse mechanisms that take place to restore the DNA fork and allow replication to be completed with high fidelity. Previously, these replication repair pathways in bacteria have been studied using UV damage, which has the disadvantage of not being localized to a known site. This manuscript describes a system utilizing a Fluorescence Repressor Operator System (FROS) to create a site-specific protein block that can induce the stalling and collapse of replication forks in Escherichia coli. Protocols detail how the status of replication can be visualized in single living cells using fluorescence microscopy and DNA replication intermediates can be analyzed by 2-dimensional agarose gel electrophoresis. Temperature sensitive mutants of replisome components (e.g. DnaBts) can be incorporated into the system to induce a synchronous collapse of the replication forks. Furthermore, the roles of the recombination proteins and helicases that are involved in these processes can be studied using genetic knockouts within this system.

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.