Biz POLAR :: POLAR-eGFP oluşturmak için zaman atlamalı protokolü ve Lynn Pillitteri geliştirmede yardım için Amanda Rychel ederim. Biz de am-rb inşa sağlamak için ABRC minnettarız. Bu protokol, Japonya Bilim Teknoloji ve Kurumu&#39;ndan PRESTO ödülü bir destek ile geliştirilmiştir. POLAR Araştırma ayrıca, Washington Royalty Araştırma Fonu (RRF-4098) ve Ulusal Bilim Vakfı (MCB-0855659) Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. KMP bir NSF Lisansüstü Araştırma Görevlisi (DGE-0718124) ve KUT bir HHMI-GBMF dedektif.

1. Tohum Sterilizasyon <ol><li> % 33 ev tipi çamaşır suyu,% 0.1 Triton X-100: Tohum sterilizasyon çözeltisi hazırlayın. </li><li> İstenen flüoresan raportör yapı (lar) ve genotip (ler) 1.7 ml tüp içinde ve sterilizasyon çözeltinin 1 mL&#39;si uygulamak taşıma il tohumlar. 15 dakika nutator inkübe edin. </li><li> Steril bir başlık olarak, geride tohum bırakarak, tüpten sterilizasyon çözüm kaldırmak için bir pipet kullanın. 1 ml steril su ile durulayın. Dört kez tekrarlayın. </li><li> İki veya daha fazla gün boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 2. Oda Slide Ortam hazırlanması <ol><li> Çözünene kadar Bacto bir 200 ml şişeye, su içinde Agar (saf olmayan agaroz), ve mikrodalga% 0.5 çözelti 20 ml karıştırılır. Çözüm kaynar dikkatli olun. </li><li> Yaklaşık 60 ° C ile çözelti soğutulur </li><li> Bir pipet ile agar solüsyonu 1 ml toplayın ve yavaşça odasına slayt (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Almanca coverglass Sistemi) iç cam kapak için geçerlidir. Çözüm which çok sıcak ya da yapıştırıcı veya çatlak cam eritmek olabilir çok hızlı uygulanır. </li><li> Hemen agar çözeltisi bir ikinci ml eklenir. Agar ortamı artık tamamen slayt bölmesinin alt kapsamalıdır. Bu minimal ortam nem korumak ve gaz difüzyon vererek dört ila beş gün için saklanan besin içeren bir bitki kotiledon, in gelişimini desteklemek için yeterlidir. </li><li> Odası ile benchtop Cool slayt kaplıdır. Şişeyi sıkıca kapalı ise, çözümü kaydedilir ve gelecekteki kullanım için ısıtılmış olabilir. </li></ol> 3. Tohum Diseksiyon <ol><li> 4 ° C depolama steril tohum borusunu sökün. </li><li> Diseksiyon mikroskop sahnede bir kağıt mendil koyun ve su ile nemlendirin. Pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için doku ayarlayın. Doku diseksiyon için tohum stabilize etmek için kullanılır. </li><li> Tüpten dokuya Pipet 20-30 tohum, görüş diseksiyon kapsamı tarlasında yerleştirmek için dikkatli olmak. </li><li> Keskin forseps (Roboz, # 5 biyoloji ucu) kullanma, Dikkatle fide içeriden çiğit çıkarın. Dış ve iç iki integuments kaldırılması gerekir. </li><li> Zaman görüntüleme kotiledon, bu hipokotil ve radikula kaldırmak için faydalıdır. Kotiledonlar Bu protokol kapsamında birkaç gün geliştirmek için yeterli besinleri içerir. Sağlam olursa, hipokotil görünümünün zaman atlamalı alan kotiledon dışarı taşıyarak, dramatik düzeltin ve uzatacaktır. Hipokotil ücretsiz kotiledon dilim için bir neşter kullanın. </li><li> Bir mikrotüp veya benzeri, suya disseke kotiledon tutun. </li><li> Kotiledon istenen sayıda ulaşılana kadar 3.4-3.6 tekrarlayın. 15-20 başarılı diseksiyonlar montaj yapılması tavsiye edilir. </li></ol> 4. Odası Slayt Montaj Kotiledonlar <ol><li> Bir küçük (18 mm 2) kapak kayma, agar besiyerinde kesti ve odasına slayt cam tabanından tüm katmanın yukarı kaldırın kullanma. </li><li> Pipet tutarak suyun minimum kotiledon dissekekaldırdı agar tabakasının altında odasına slayt içine tüp. </li><li> Yavaşça kotiledon üzerine agar indirin. Fazla su varsa, kotiledon rahatsız etmemek için dikkatli olmak, bir doku ile uzak ıslatın. Montaj tamamlandığında numuneler artık kolayca hareket etmelidir. </li><li> Odasına slayt ve mikroskop sahne için hareket slayt kapağı yerleştirin. </li></ol> 5. Time Lapse Görüntüleme <ol><li> Görüntü istenen fluorofor (ler) için ters konfokal mikroskop ayarlayın. Kullanılan LSM700 parametreleri: GFP, 440-530 nm&#39;de filtre band pass ile 488 nm ve toplama uyarma; RFP, 570-610 nm&#39;de filtre band pass ile 555 nm ve toplama uyarma için. </li><li> Hasar monte örnekleri inceleyin. Sağlam bir yerleri programlayın, düzgün mikroskop yazılım içine kotiledon monte. Zen 2009 yılında: 20x objektif ile kotiledon odaklanın ve oda slayt merkezine amacı taşımak. Toplama Modu altında, 0.5 Zoom değiştirebilir ve Çerçeve Boyutu &lt;48x48 piksel / em&gt;. Pozisyonlar altında Pozisyonlar onay ve Tarama genel görüntü ... düğmesini seçin, sonra 30-35 Yatay ve Dikey kiremit sayısını artırmak. Tarama tamamlandığında, gözlemlemek için her kotiledon az Boyutlar sekmesinde yer ve crosshair&#39;i altında Pozisyonlar düğmesini tıklatın. </li><li> Tüm samples.In Zen 2009 kotiledon epidermisin kapsayan z serisi ayarlayın: Z-Stack onay kutusunu tıklatın. Görev Listesi altında her bir pozisyon seçin ve düğmesini Taşı tıklayın. Kotiledon epidermisin üst düzlemi odaklanın ve Z-Stack altında Set İlk düğmesini tıklatın. Epidermis yararlı görünür olduğu en düşük konuma Odak ve Set Son düğmesini tıklatın. Ayarlamak için en iyi z-kesit kalınlığı gösteren, Optimal yanındaki düğmesini tıklatın. Bu ayarları tüm örnekleri kapsayacak onaylamak için her kotiledon kontrol edin; z parametreleri indiv için ayarlanamazZen, 2009 yılında idual pozisyonları. </li><li> İstediğiniz çözünürlüğü ve uzunluk zaman serileri ayarlayın. Üç gün için 15-30 dakika aralıklarla epidermal hücre bölünme protein dinamik için etkilidir. Bu aralık gerektiğinde değiştirilebilir. Zen 2009 yılında: Zaman Serisi onay kutusunu tıklatın. Zaman Serisi altında, metin alanına kaymak veya yazarak kullanarak istenen görüntü sayısı için döngüleri ayarlayın. 30 Aralık ayarlayın ve min seçmek için açılan menüyü kullanın. </li><li> Xyzt çok pozisyonlu tarama başlayın. Konumların sayısını tarama özellikleri ile sınırlı olması gerektiğine dikkat ediniz; toplam tarama süresi, istenen aralığından daha büyük olduğu takdirde, zaman noktası doğru olmayacaktır. Görüntüleme GFP ve TTT 59 bir 30 dakikalık aralıklarla z-dilim sistemimiz kullanırken aynı anda altıya pozisyonların maksimum mümkündür. Zen 2009 yılında: Değişim Çerçeve Boyutu istenen çözünürlük ve Başlat Deney tıklatın. </li></ol> 6. Video Düzenleme <ol><li> Konfokal veri dosyası itibaren, maksimum yoğunluğu TIFF gibi kayıpsız bir format içinde görüntü dosyaları gibi her zaman / konum birleşimi ve ihracat z-projeksiyon yapmak. Dosya adları, bir film onları birleştirmek için yazılım için pozisyon başına bir dizi (örneğin, POLAR-GFP_0001_pos1, vb, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002 değil) olmalıdır. Zen 2009 yılında: Kullanımı: Kopyala ardından ayrı dosyalar Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu içine pozisyonları bölmek İşleme sekmesi altında Altküme. (: - Serisi İhracat, Tam çözünürlüklü görüntü penceresinde Dosya) Nihayet, TIFF gibi ihracat. </li><li> BUnwarpJ makro 9 (: Kayıt: bUnwarpJ Plugins) çalıştırarak ardışık görüntüleri hizalamak için FIJI 7,8 kullanın. Mono Kayıt Modu değiştirin. Tüm Gelişmiş Seçenekler varsayılan değerleri kullanabilirsiniz. Uzun zaman atlamalı dizileri için, indirmek ve kurmak makro &quot;Afin + Tutarlı Elastik 2D Görüntü Kaydı,&quot; görüntülerin otomatik olarak bir dizi bUnwarpJ geçerli olacak ve açık yDosya kullanarak bizim veriler: İthalat: kullanmak için Görüntü Sırası. MOPS görülecek ekstraksiyon ve çalışma işaretini kaldırın. </li><li> Hizalanmış görüntüler dizisini açın ve istediğiniz video formatı (AVI iyi bir seçimdir) kaydetmek FIJI / ImageJ veya Quicktime Pro kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64 (1983).</li><li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Mitosis+and+Morphogenesis:+Point+and+Counterpoint.">Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint.</a> Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development.">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449 (1995).</li><li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inz&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).</li><li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division,+Cell+Growth,+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis.">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis.">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).</li><li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+Elastic+Registration+of+Histological+Sections+Using+Vector-Spline+Regularization.">Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization.</a> Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).</li><li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+of+the+Mouths+of+Plants:+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development.">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).</li><li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum.">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).</li><li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem.">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu hızlandırılmış konfokal teknik fluoresan etiketli protein ekspresyonu Kutup ve başka dinamik olarak değişen bir protein halinde kendi işlevini uygun bir anlaşılması için önemli olan Arabidopsis kotiledon epidermis, bireysel hücrelerin içinde lokalizasyon uzunlamasına çalışmalar izin verir. Önceden, sürekli zaman atlamalı görüntüleme Arabidopsis kök mantar enfeksiyonu 11 ve meristem büyüme 5,12 incelemek için kullanılan, ancak kotiledon epidermisin...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Tek odacıklı slayt </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> Ya da iki odacıklı (155.379) </td></tr><tr><td> Lazer tarama konfokal mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> Zen 2009 yazılımı </td></tr><tr><td> 20x objektif lens </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0.8, Plan-APOCHROMAT </td></tr><tr><td> Mikroskop Diseksiyon </td><td> Benz (Ulusal) </td><td> 431TBL </td><td> Alttan yanar </td></tr><tr><td> # 5 forseps, biyoloji ucu </td><td> Roboz Cerrahi Alet </td><td> SC-4978 </td><td> Çok ince ipuçlarıkritik </td></tr></tbody></table>

long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination

Gelişimsel bir sıra boyunca hücresel davranışı in vivo dinamiği Görüntüleme doku desenlendirme mekaniğini anlamak için güçlü bir teknik olabilir. Hayvan gelişimi sırasında, anahtar hücre çoğalması ve desenlendirme olaylar çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Örneğin, Caenorhabditis elegans larva vücut planı için gerekli tüm hücre bölünmeleri yedi mitotik çevrimleri 1, döllenmeden sonra altı saat içinde tamamlanır; Drosophila embriyo on altı veya daha fazla mitoz az 24 saat 2 görülür. Buna karşılık, bitkisel gelişimi sırasında hücre bölünmesi, genellikle günde bir 3,4,5 düzeni üzerinde, yavaştır. Bu eşsiz bir meydan okuma ve hücre bölünmesi ve bitki organogenez sırasında farklılaşma olayları dinamik davranışları belgelemek için uzun vadeli canlı görüntüleme için bir ihtiyaç yüklemektedir. Arabidopsis Epidermis araştıran sinyalizasyon, hücre kaderinin ve bitkilerin gelişim için mükemmel bir model sistemi. Kotiledon, bu doku oluşur hava ve eşit dağıtılmış stoma serpiştirilmiş suya dayanıklı kaplama hücreleri, vanalar açılır ve gaz değişimi ve su kaybı kontrol yakındır. Bu stoma Uygun aralık kendi işlevi için önemlidir ve onların gelişimi asimetrik bölünme ve organize epidermis (Şekil 1) üretmek için hücre farklılaşması bir dizi adımı izler. Bu protokol, gelişme birkaç gün boyunca hücreleri ve epidermis içinde proteinlerin gözlem izin verir. Bu zaman çerçevesi kök hücre bölünmeleri ve stoma ve epidermal kaldırım hücreleri de dahil olmak üzere epidermal hücrelerin farklılaşma hassas belgelere sağlar. Floresan proteinleri hücre bölünmesini ve farklılaşmasını işlemleri sırasında dinamik değerlendirmek için ilgi çekici proteinler oluşturacak şekilde eklenebilir. Bu teknik, th stomatal-soy hücrelerinin proliferasyonu aşaması sırasında, bize yeni bir protein, POLAR 6 lokalizasyonu anlamak olanak tanırasimetrik bölünme olayları ve bölünmesi meydana kısa bir süre önce hücre korteksin karakteristik bir alana hamle önceki hücrelerde ifade edilir e Arabidopsis kotiledon epidermis. Görüntüleri kayıt ve akıcı görüntü kolaylıkla zamanla değişebilir gibi dinamik protein lokalizasyonu ve hücre tipleri görselleştirmek için kamuya açık yazılımı kullanılarak üretilebilir.

<html> Bu yöntem ile elde bilgilendirici zaman noktalarında bir dizi Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Hücre zarları RFP (pm-rb) ve GFP 30 dk zaman ölçeğinde (POLAR :: POLAR-GFP) onun yerli promotör altında POLAR protein 6 birleşmesini ile etiketlenir, biz protein yerelleştirme değişiklikleri ile birlikte hücre bölünmeleri bakın kendilerinden önceki. Asimetrik hücre stoma soyu şeklinde bölünmeler kök hücre benzeri daha asimetrik bölünme geçmesi yeteneği ko...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination at JoVE.com

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

13.6K Görüntüleme.  University of Washington. Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Video: Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Biyoloji

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Sox10 içinde Kraniyofasiyal Kalkınma Görselleştirme: kaede Transgenik Zebra balığı Hattı Time-lapse konfokal mikroskopi kullanılarak

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...