Tohum ekspres RFP-TUB6 ve faydalı düzeltmeler için isimsiz bir inceleme uzmanı olan British Columbia Üniversitesi&#39;nden Prof. Geoffrey Wasteneys&#39;e teşekkür ediyoruz. Profesör Hugh Dickinson&#39;a mekanik bir destek olarak selüloz filmi ve fotoğraf için John Baker&#39;i bizi uyarması için minnettarız. Bu çalışma BBSRC araştırma hibeleri BB / G013993 / 1 ve BB / D004055 / 1 IM tarafından desteklendi ve bir BBSRC Doktora Eğitim Ödülü ve CK Clarendon Bursu

1. Oda Oluşturma <ol><li> Bir cam kesici kullanarak, 1 mm kalınlığında bir mikroskop lamasının ucundan 3 mm genişliğinde şeritleri kesin. Bir siyanoakrilat süper yapıştırıcı veya çift taraflı bant kullanarak, bu cam şeritleri yaklaşık 45 mm uzaklıkta ikinci bir mikroskop lamı boyunca geniş tutkal edin ( Şekil 1A ). Oda başına bir slayt gereklidir, ayrıca agar plakaları dökmek için ilave slaytlar gerekir (bir slaytta 2-3 agar plak oluşur). Slaytlar tekrar kullanılabilir. </li><li> Cam şeritler arasında, gaza nüfuz eden poli (dimetilsiloksan) zamktan aynı yükseklikte bir conta oluşturun. Slayt üzerine poli (dimetilsiloksan) sakız topu koyun ( Şekil 1B ), ikinci bir slaydı az miktarda% 100 mutlak etanol ile ıslatın ve ikinci slaytla poli (dimetilsiloksan) sakız topunu yüksekliğe ulaşıncaya kadar düzleştirin ( Şekil 1C ). <ol><li> Gerekirse fazla poly (dimeTilsiloksan) sakızın tıraş bıçağı ile yıkanması ve düzleşmenin tekrarlanması. </li></ol></li><li> Mutlak etanolde ıslatılmış uygun bir kesici veya jilet kullanarak, daha sonra fide ve agar levhayı tutacak boşluğu oluşturmak için poli (dimetilsiloksan) sakızının iç kısmını çıkarın ( Şekil 1D ). </li><li> Yaklaşık 2 mm&#39;lik bir son duvar kalınlığına sahip bir conta oluşturmak için jiletin dikkatli bir şekilde traş bıçağı ile düzeltilmesi ( Şekil 1E ). Gazların bir poli (dimetilsilaksan) bariyeri içerisinden geçirgenliği, 50 μm&#39;nin üzerindeki kalınlıklardan bağımsızdır 11 . </li></ol> 2. Agarla Katılaşmış Büyüme Orta Levrağını Oluşturma <ol><li> İki cam şeritli mikroskopik bir slaytta, iki cam şerit üzerine oturacak şekilde lamel yerleştirin (22 mm x 50 mm). </li><li> Elde edilen boşluğa% 1 w / v sukroz ve% 1.5 w / v agar (½ MS) içeren pipet eritilmiş yarı kuvvetli Murashige ve Skoog büyüme ortamıSonuncusu tamamen dolana kadar (yaklaşık 1 mL toplam hacim) lamelin altına yerleştirin ve agara ayarlanıncaya kadar bırakın (yaklaşık 5 dak.). Not: Farmakolojik bileşikler, döşeme dökülmeden önce sıvı ortama uygun konsantrasyonların eklenmesiyle agar plakasından uygulanabilir. Bu, deksametazon 12 , izoksaben, 2,6-diklorobenzonitril (DCB), oryzalin ve latrunculin B için başarıyla test edildi. </li></ol> 3 . Oda Kurulumunun Tamamlanması <ol><li> Hava, küçük bir hacimdeki PFD&#39;yi bir tüpte sallayarak PFD&#39;yi dengeye çıkarır 7 . Jel contanın kuyusuna hava ile dengelenmiş küçük miktar (yaklaşık 200 mcL) hava-dengelenmiş PFD ekleyin, ancak bölmeyi tamamen doldurmayın. Bu PFD, odaya yerleştirildiğinde agar plakasının altındaki hava kabarcıklarının tıkanmasını önlemeye yardımcı olacaktır. </li><li> Agar levhasındaki lamelleri çıkarın (yukarıdaki adım 2.2&#39;de) ve bir kısmını kesmek için tıraş bıçağı kullanınBoyutu ve şekli. Daha sonra jel contanın kuyusuna yerleştirin ( Şekil 1F ). Contanın her yerine 2-4 mm boşluk bırakılmalıdır. </li><li> Odayı hava ile dengelenmiş PFD ile tamamen doldurun. </li><li> PFD&#39;de ( Şekil 1G ) yüzen, kotiledonlar ve hipokotil kenar üzerinde asılı olan agar döşeme üzerine bir veya daha fazla A. thaliana fidanı (2-3 gün boyunca görüntüleme için 3 fide kadar) yerleştirin. </li><li> Fideler elde etmek için tohumları% 70 etanol, 1% sükroz ve% 0.8 agar ile takviye edilmiş ½ MS ortamında tohum sterilize edin, 4 ° C&#39;de 2-4 gün süreyle tabakalandırın ve 16 ° C&#39;de 22 ° C&#39;de dikey yönlendirilmiş plakalarda büyütün H hafif / 8 saat karanlık rejim. Yanal kökleri görüntüleme için, görüntüleme odalarına aktarılmadan önce 7-10 gün boyunca bitkiler yetiştirin. </li><li> Odası kapatmak için, objektif optik uygun bir lamel uygulayın, hafifçe lamel kadar bir cam mikroskop lamı kenarıyla aşağı bastırıyorHer iki cam şerit üzerine oturmaktadır ( Şekil İH ). </li><li> İstenirse, lamelin her iki ucunda yarım uzunlukta kesilmiş 1.25 cm genişliğinde mikrogözenek cerrahi bant şeritleri ile sabitleyin ( Şekil 1I ). Görüntülemeden önce numunenin yaklaşık 30 dakika yerleşmesine izin verin. Bu görüntüleme sırasında numune hareketini en aza indirir. </li><li> Büyüme için kontrollü bir altlığı korumak için dik bir mikroskop ile görüntüleme gerçekleştirin. 20X / 0.7NA veya 63X / 1.2NA CS2 hedeflerini kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22 (2015).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+water.">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li><li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium.">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update:+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology,+physiology,+development+and+cell+biology.">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140 (2014).</li><li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+in+liquid+perfluorocarbons.">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li><li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues.">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li><li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+thickness+dependence+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+membranes.">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li><li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis.">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li><li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set.">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li><li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis.">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430 (2011).</li><li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis.">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li><li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li><li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel.">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sunulan yöntem, iki ila üç gün boyunca gelişen yanal köklerin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme için basit bir stratejidir. 48 saate kadar periyodlar için, görüntüleme sisteminin yanal kök gelişimine olumsuz etkisi gözlemlenmemiştir. 48 saat sonra, ortalama yanal kök büyümesi yavaşlamaya başladı, ancak köklerin önemli bir alt kümesi (% 37) plakalardaki ortalama kök büyümesiyle karşılaştırılabilir oranlarda büyümeye devam etti. Bu nedenle, yeteri kadar sayıda kök görüntüleyerek, büyümesi 48 saat sonra yavaşlayan kökler hariç tutulabilir. Görüntüleme odalarının sistematik testleri 72 saatten uzun süreler için gerçekleştirilmedi, ancak uzatılmış görüntüleme periyotları aranıyorsa alternatif stratejiler önerilir. Görüntüleme odaları, eğer uygun çevresel koşullar sağlanırsa veya bir büyüme tesisine kaldırılır ve mikroskopta periyodik olarak geri gönderilirse, mikroskop sahnesinde sürekli olarak bırakılabilir. Bu, sayısız odaların paralel olarak görüntülenmesini sağlar. &lt;/ P&gt; Burada açıklanan odacıkların bir avantajı, yanal köklerin konumlarına sabitlenmesidir ve yüksek çözünürlüklü su daldırmalı lensler kullanılarak görüntülenebilir. Mekansal kararlılık kritik olarak destekleyici agar levhasında kullanılan agar konsantrasyonuna bağlıdır. Başlangıçta bu aralıktaki yüksek konsantrasyonların uzaydaki kökleri sabitlediğini, ancak kök büyümesinin daha hızlı yavaşladığını ve bazı köklerin, azalmış hücre uzaması da dahil olmak üzere mekanik stres belirtileri sergilediğini ortaya koyan başlangıçta% 0.8 agardan% 2 ağza kadar çeşitli konsantrasyonlar test edildi. Buna karşılık, düşük agar konsantrasyonları, gerekli destek sağlamadı ve görüntüleme sırasında x, y ve z&#39;de sürüklenen kökler. Optimum% 1.5 agar kütüğü, olumsuz mekanik etkiler olmadan numunenin konumunu düzeltir. Bu koşullar altında, ilk 30 dakika içerisinde yerleştikten sonra, kökler gece gündüz veri edinimine izin vererek, birçok saat boyunca kararlıdır. 4D verilerinin edinimi sırasında z-yığın aralıkları genelde bEk bir 5-10 um ile raketlenmişti, ancak bu temelde z-drift veya sallantıdan ziyade yanal köklerin düzlem dışı büyümesini barındıracaktı. Standart agar konsantrasyonu penetrasyona karşı bir miktar direnç sağlamasına karşın, gravitropik olarak büyüyen kökler agara nihayet nüfuz eder. Bununla birlikte, görüntüleme odasının ufak bir modifikasyonuyla, kök büyümesi lamel paralel olarak paralel tutulabilir, böylece daha büyük lateral kökler ve birincil kökler görüntülenebilir. Dahası, temel görüntüleme bölmesi, hipokotiller için kolayca özelleştirilebilir. Hypocotyls bu sistemde daha serbestçe yüzer, bu nedenle görüntü yakalama için z ekseni braketi genellikle yaklaşık 20 μm&#39;ye kadar yükselmiştir. Bu çalışmada, substrat özelliklerinin kontrol edilmesine izin veren dik bir mikroskop kullanılmıştır. Görüntüleme odası, ters mikroskop konfigürasyonlarına uyarlanabilir, ancak organları müdahale etmek için katı örtücülerin zamana bağlı etkisi değerlendirilmelidir. </p&gt; Littlejohn ve meslektaşları, PFD&#39;nin kendisinin biyolojik molekülleri kolayca çözmediğini ve bunun farmakolojik bileşiklerin 7 sağlanması için doğrudan kullanılamayacağı anlamına geldiğini belirtti. Bu problem, bu bileşiklerin agar levhasının üzerinde durduğu katılaşmış büyüme ortamı plakası içinden temin edilerek engellendi. Perfüzyon sistemleri yıkama deneyleri için tercih edilen yöntem olmaya devam ederken, görüntüleme bölmesi deksametazon 12 ve diğer bileşiklerin uygulanması için başarıyla kullanılmıştır. Bir makale, bu makale von Wagenheim ve meslektaşları18 hazırlanırken, ışık saçlı mikroskopi kullanılarak yanal kök gelişimini görüntüleyen bir odayı açıkladı.

Bitki gelişiminin altında yatan hücresel ve subselüler süreçleri incelemek için, yüksek çözünürlüklü uzun vadeli zaman atlamalı görüntüleme stratejileri için artan bir talep vardır. Bu tür görüntüleme deneylerinde kilit bir zorluk, yeterli gaz alışverişi artı bir su ve besin maddesi arzı 1 , 2 , 3 artı içeren fizyolojik koşulların bakımıdır. Optimum optik çözünürlük için yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip objektifleri kullanmak için, numuneler lamine camlara paralel olarak yerleştirilmelidir. Görüntüleme sırasında x, y ve z yönlerinde hareket ideal bir şekilde minimum olmalıdır. Fide genellikle kısa süreli görüntüleme için suya veya sulu çözeltiye monte edilirken, su, CO 2 ve O 2&#39;yi çözmek için düşük kapasiteye sahiptir (sırasıyla 20 ° C, 0.1 MPa&#39;da 1.54 mg / mL ve 0.04 mg / mL) Hangi yaparUzun zaman atlamalı deneyler için uygun değildir. Sürekli oksijen ve besleyici seviyelerini koruyan perfüzyon sistemleri bu sorunun bir çözümündedir ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) 1 , 2 , 3 ve ışık levha mikroskopisi (LSM) için geliştirilmiştir. RootChip 2 ve RootArray 3 gibi sistemler, gelişmekte olan köklerin zaman aşımı görüntülemesi için özel olarak tasarlanmış ve özel olarak inşa edilmiş çok örnekli bir aygıta çimlenen tohumları dahil etmiştir. Bu düzenlemeler minimal mekanik bozulmayı sağlar ve birden fazla fidenin paralel analizi için tasarlanmıştır, ancak subselüler yapıların görüntülenmesi için optimize edilmemiştir. Calder ve meslektaşları, alt hücreli yapıların görüntülenmesi için optimize edilmiş daha karmaşık bir perfüzyon tabanlı görüntüleme haznesi tasarladılar; buradaki örnek, bir ağ tarafından konumunda tutulduYüksek büyütmeli daldırma merceklerinin kullanılmasına izin vermek için 1 . Burada, perfüzyon sistemlerine dayalı olmayan, ancak yakın zamanda Arabidopsis görüntüleme 6 , 7 , 8 için bir montaj aracı olarak popülerlik kazanan bir perflorokarbon olan perflorodekalin (PFD) kullanan, bu probleme alternatif, basit bir çözüm sunulmuştur . Bu tür uygulamalarda, CO 2 ve O 2&#39;yi çözmek için PFD&#39;nin yüksek kapasitesi (PFD&#39;de O 2 için 1.9 g / mL, sudaki 0.04 mg / mL&#39;ye kıyasla) 9 dalmış doku ile gaz değişimine izin verir. Ayrıca, PFD floresan değildir ve refraktif indeksi (1.313) suyun (1.333) ile karşılaştırılabilir ve hava (1.000) 6&#39;ya göre sitosolünkine (~ 1.4) daha yakındır. Perflorokarbonların, çeşitli bitkiler ve bitki türleri üzerinde minimum fizyolojik etkisi olduğu bildirilmiştir.Çay tohumları, PFD&#39;ye batırıldığında kolayca çimlenir ve su ile beslendiğinde en az iki tam gün normal büyüme ve gelişme gösterir. Benzer gözlemler, Arabidopsis tohumlarını çimlemek için yapılmıştır 6 . Littlejohn ve meslektaşları, sedimantasyondan sonra Arabidopsis yaprak dokularında PFD dağılımını doğrudan görüntüleyecek uyarılmış Raman saçılımına dayanarak, PFD&#39;nin canlı hücreler tarafından alınmayacağına karar verir. PFD daha önce, düşük yüzey gerilimi nedeniyle hava boşluklarına kolayca nüfuz ederek görüntü derinliğini önemli derecede arttıran görüntü anten dokuları için ağırlıklı olarak kullanılmıştır. Burada, PFD, lateral köklerin gelişiminin uzun vadeli konfokal görüntülemesi için benimsenmiştir. Bu konfigürasyonda, bir veya daha fazla fide agar ile katılaşmış ve PFD&#39;ye batırılmış bir büyüme ortamı plakası üzerine yerleştirilir. PFD, gGörüntüleme odasında aseöz değişim, anoksi önleme. PFD, yüksek gaz geçirgenliği olan poli (dimetilsiloksan) zamk contası (CO 2 için 1.5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 ) 11 ile tutulduğu için oldukça uçucudur. Besinler ve su, agar ile katılaşmış ortam plakasıyla sağlanır. Aynı zamanda, bu agar plakası nazikçe lamel karşı kök presler, böylece görüntüleme odasında göreli konumu sabitleme ve yüksek çözünürlüklü su daldırma lenslerin kullanımına izin veriyor. Ayrıca, agar kütüğü dexamethasone, oryzalin ve isoksaben dahil bir dizi farmakolojik tedavinin uygulanmasında kullanılabilir. Görüntüleme odaları, asgari ekipman kullanılarak standart mikroskopik slaytlardan çok sayıda monte edilebilir. Görüntüleme odaları, yanal kök gelişimini incelemek üzere geliştirildi ve karakterize edildi, ancak birincil kök ipuçları gibi diğer fide organlarını görüntülemeye vehipokotilleri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Perfluorodecalin</td>
			<td style="width:191px;">F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td>
			<td style="width:119px;">FLUTEC PP6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Poly(dimethylsiloxane) gum&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td>
			<td style="width:119px;">Item # 132700</td>
			<td style="width:167px;">Carolina Observation Gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cavity Microscope Slides</td>
			<td>VWR International Ltd, Lutterworth,&#160;UK</td>
			<td style="width:119px;">10118-600</td>
			<td>Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td style="width:119px;">604753</td>
			<td>Any &#39;super-glue&#39; suitable for glass will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cellulosic cellophane membrane</td>
			<td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td>
			<td colspan="2">325P cellulose film; 80mm disc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

Yanal kök morfogenezisi gibi bitki gelişiminin birkaç yönü, birkaç günün zaman aralıklarında meydana gelir. Altta yatan hücresel ve subselüler süreçleri incelemek için, fizyolojik koşulları koruyan yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı mikroskopi stratejileri gereklidir. Bitki dokularında, sürekli gaz değişimi ile yeterli besin ve su temini olmalıdır; ancak lamel altına batırılmış ve hareketsiz hale getirildiğinde, anoksiye karşı özellikle hassastırlar. Başarılı bir şekilde uygulanan bir strateji, oksijen ve besin maddelerinin sürekli bir şekilde tedarik edilmesi için bir perfüzyon sisteminin kullanılmasıdır. Bununla birlikte, bu gibi düzenlemeler karmaşık, hantal olabilir ve özel ekipman gerektirir. Burada, daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılan basit bir görüntüleme sistemi için alternatif bir strateji sunulmuştur. Bu sistemin kurulumu kolaydır, minimum ekipman gerektirir ve birkaç görüntüleme haznesinin kurulmasına ve eşit olarak görüntülenmesine imkân tanıyan bir mikroskop sahnesine kolayca monte edilir.allel. Bu sistemde, yanal kök büyüme oranları ilk iki gün boyunca agar plakalarında standart koşullardaki büyüme hızlarından ayırt edilemez ve yanal kök büyümesi en az bir gün daha düşük oranlarda devam eder. Bitki dokuları, aynı zamanda bir dizi farmakolojik bileşimi uygulamak için kullanılabilen bir agar plakası yoluyla besinlerle birlikte verilir. Sistem yanal kök gelişimini izlemek için kurulmuştur ancak hipokotiller ve birincil kökler gibi diğer bitki organlarına kolayca uyarlanabilir.

Yanal kökler görüntüleme odalarında fizyolojik oranlarda büyür. Görüntüleme odalarındaki bitkilerin yanal kök uzunlukları, saatlik aralıklarla ( Şekil 2A , sol, Film 1, n = 23) ölçülmüş ve büyüme oranları, aynı agar-katılaştırılmış ortamı içeren standart Petri plakalarında yetiştirilen lateral köklerinkiyle karşılaştırılmıştır ( Şekil 2 2A , sağ, Film 2, n = 23). Büyüme oranları, artan oranda büyüme ve çoğalma bölgelerinden dolayı kökün bir belirleyici faktör olduğu uzunlamasına yan kökler arasında büyük farklılıklar gösterebilir. Bu nedenle, lateral kök setleri hem görüntüleme odasında hem de agar plakasında farklı başlangıç ​​uzunluklarının (50 um ila 1150 um aralığında) köklerini temsil edecek şekilde seçilmiştir. Deneyin başlangıcında ortalama yan kök uzunluğuHer sette (sırasıyla görüntüleme bölmeleri ve plakaları için 439 ve 442 μm) benzerdi. Analiz edilen 27 saatlik zaman aralığında yanal kök büyümesi hem görüntüleme odaları hem de plakalar üzerinde yaklaşık olarak lineerdi, plakalarda ortalama 52 um / saat (R2 = 0.997) ve görüntüleme odalarında 51 um / saat&#39;lik bir büyüme oranı vardı R2 = 0.993) ( Şekil 2B ). Hem levhalar üzerinde hem de görüntüleme bölmelerinde ( Şekil 2C ) oldukça değişken olan bireysel yanal köklerin büyüme oranları, görüntüleme odacıklarında 17 μm / saat ila 82 μm / saat arasında ve plakalarda 13 μm / saat ila 87 μm / sa arasındadır. Büyüme oranları genelde kök uzunluğu ile birlikte artarken, büyüme oranları halen benzer uzunlukta olan kökler arasında değişmekle birlikte, görüntüleme odaları ve plakalarda varyans benzerdir. Yanal kökler görüntüleme odalarında çoğalır ve hiGh sayısal diyafram hedefleri. Plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP 14 ve mikroplak işaretleyici UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15&#39;u birlikte ifade eden yanal kökler, görüntüleme bölmelerinde hücre proliferasyonu sırasında mikrotübül davranışını belgelemek için CLSM 10 ile 1 saat aralıklarla görüntülendi ( Şekil 2D , Film 3). Bu odacıklarda, yanal kökler, x, y ve z eksenlerindeki konumlarında son derece kararlıydı ve birkaç saat boyunca sürekli zaman atlamalı konfokal yığınların edinilmesine izin verdi. Önceden ortaya çıkan bantların ( Şekil 2D , yeşil oklar), mitotik iğlerin ( Şekil 2D , beyaz oklar) ve fragmoplastların ( Şekil 2D , mavi oklar) oluşumundan anlaşılacağı üzere, meristematik hücreler sürekli çoğalırlar. Petri tabaklarındaki fidanlarda olduğu gibi,Görüntüleme odacıklarında tamamen uzamış kök hücreler kök tüyleri başlattı ( Şekil 2A , Şekil 2D , ok başları), bu gelişmenin görüntüleme odalarında beklendiği gibi ilerlediğini gösteriyordu. Geniş bir görüş alanı sağlamak için Şekil 2D&#39;deki görüntüler 20x / 0.7 NA hedefiyle elde edilmiştir. Yüksek rakamsal açıklık 63x / 1.2 NA suya daldırma objektif kullanarak yüksek oranda yanal kök görüntüleri elde etmek de mümkün olmuştur ( Şekil 2E ). Yanal kök büyümesi görüntüleme odalarında üç güne kadar sürdürülür. Görüntüleme odalarının fizyolojik oranlarda yanal kök gelişimini ne kadar süreyle destekleyebileceğini araştırmak için görüntüleme odalarında (n = 27) ve plakalardaki (n = 33) yanal kök uzunluğu 0 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saatte ölçülmüştür. Kökler choSen 0 saatte 200 μm&#39;den daha kısa, ortalama yan kök uzunluğu 117 μm olan görüntüleme bölmelerinde ve 121 μm kalınlığında plakalardı. Daha kısa kökler ortalama olarak daha yavaş büyümesine karşın ( Şekil 2C ), agar levhanın kenarından daha az büyüdüler ve daha kolay görüntü çekiyordu. İlk 48 saatte tüm yanal köklerin ortalama büyümesi Petri plakalarına kıyasla görüntüleme odalarında anlamlı farklılık göstermedi ( Şekil 3A ). Bununla birlikte, ortalama büyüme 48 saat ile 72 saat arasında önemli ölçüde azaldı ( Şekil 3A ). Büyüme oranları genel olarak 48 saat sonra görüntüleme odalarını yavaşlatır gibi görünse de, bireyler arasındaki büyüme oranları oldukça değişkendir ( Şekil 3B , 3C ) ve bu da plakalarda ve odalarda kıyaslanabilir oranlarda büyüyen yanal köklerin önemli bir alt kümesi olduğu anlamına gelmektedir 72 saatlik büyüme dönemi boyunca. Yetiştirilen 33 yan kökün 23&#39;ü(% 69.7) 72 saatte ortalama uzunluğun bir standart sapması (927 ila 3.116 μm, Şekil 3B , kırmızı) arasında bir uzunluğa ulaşmaktadır. Görüntüleme odacıklarının 10&#39;unda (% 37.0) yanal kökler bu aralıkta bir uzunluğa ulaşmaktadır ( Şekil 3B , kırmızı). Görüntüleme odaları daha yaşlı yanal kökler, birincil kökler ve hipokotiller için kolayca adapte edilebilir . Orijinal görüntüleme odacığının tasarımının sınırlamalardan biri, sert agar plakası bazı mekanik direnç sağlamasına rağmen gravitropik olarak büyüyen kökler sonunda agar plakasına nüfuz ederek görüntü kalitesinde kayba ( Şekil 4B ) ve yüksek NA&#39;nın çalışma mesafesinin ötesinde büyümesine neden oldu Lensler, nispeten uzun çalışma mesafesi (0.3 mm) 63X / 1.3 NA CS2 hedefi. Genç lateral kökler, statolit içerenGravitropizm için gerekli olan kolumnella hücreleri 17 olduğundan başlangıçta görüntüleme odacıklarındaki lamellerle paraleldirler ( Şekil 2E ). Daha uzun süre büyüdükçe ve kolumnella ve statolitler oluştuğunda, yan kökler artan pozitif yerçekimi etkileri gösterirken, birincil kökler çimlenmeden sonra güçlü bir yerçekimi tepkisi göstermektedir. Bu, birincil köklerin görüntüleneceği birkaç saati sınırlar ve 48 saat veya daha fazla süreyle sürekli olarak görüntülenecek olan yanal köklerin başlangıç ​​uzunluğunu ciddi ölçüde sınırlar. Bu kısıtlamanın üstesinden gelmek için, bölme, büyüme, agar levhanın yüzeyinde bir penetrasyon bariyeri olarak işlev gören bir selülozik selofan zar tarafından lamel paralel tutulacak şekilde değiştirildi ( Şekil 4A ). % 1.5 agar kütüğünü kullanan ilk denemeler, belki de mekanik strese bağlı olarak, ilk 24 saat içinde azalmış kök gelişimine neden oldu. Döşeme altındaki agar konsantrasyonları,D% 0.8 agar ve selüloz film içeren bir levhalı odacıklarda, genç yanal kök büyüme oranları, ilk 48 saat boyunca geleneksel odacıklardaki büyüme hızlarından belirgin olarak farklı olmadığı bulunmuştur. 0-24 saat boyunca, selüloz odaları ve konvansiyonel odacıklardaki ortalama kök büyümesi sırasıyla 242 μm ve 262 μm idi (p = 0.78 Student&#39;s t-Testi) ve 24-48 saat boyunca sırasıyla 330 μm ve 355 μm 1 idi (p = 0.67 Student&#39;s t-testi); Sırasıyla n = 12 ve n = 11&#39;dir. Bu düzenleme, yanal köklerin lamelden agar içine uzamasını ve ayrıca 48 saat boyunca primer köklerin görüntülenmesine izin vermesini etkili bir şekilde önledi ( Şekil 4C ). Görüntüleme odalarının kök dışında organlar için uyarlanıp ayarlanamayacağını test etmek için Arabidopsis hipokotilleri seçildi. Hipokotiller, köklerden esas olarak daha kalıntır, bu nedenle, geleneksel görüntüleme odasında en üstteki cEller lameste karşı sıkıştı ve deformasyona neden oldu. Bu nedenle merkezlerinde oval bir depresyon içeren boşluklu slaytlar kullanılarak alternatif bir tasarım geliştirildi ( Şekil 4D ). Bu konfigürasyonda, 1 mm kalınlığında bir agar plakası (yukarıdaki 2.2&#39;de olduğu gibi hazırlanmıştır) bir ucu slayt boşluğuna birkaç mm çıkıntı yapacak şekilde konumlandırılmıştır ( Şekil 4D ). Kök, yatay bölümün üstünde konumlandırılırken, hipokotiller slayttaki oyuğun üzerine yerleştirildi. Bu, fidenin uzayda kök tarafından sabitlenmesini sağlamıştır, ancak hipokotil sıkıştırılmamıştır. Odalardaki büyüme oranları plakalara kıyasla sistematik olarak ölçülmemiş iken, görüntüleme odalardaki hipokotiller, hipokotil ( Şekil 4E , 4F ) 16&#39;ya göçen iyi tanımlanmış uzunlamasına büyüme dalgası sergilemiştir. <img alt="Şekil 1"Class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ dosyalar / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1 : Görüntüleme haznesi montajı. Tüm ayrıntılar metinde açıklanmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> Şekil 2 : Yanal kökler görüntüleme odalarında fizyolojik koşullar altında büyür. ( A ) Görüntüleme odasında (solda) ve plakada (sağda) Arabidopsis lateral kök gelişimi (sabit ışık, yatay inkübasyon, eşzamanlı görüntüleme) 25 saat boyunca. Ölçek çubukları = 200 μm. ( B ) ( A ) &#39;da gösterildiği gibi lateral kök uzunluklarını 27 saat boyunca (1 saat aralıklarla ölçülmüştür) gösteren yanal kökler. ! TekErgin kökler gri renkte (plakalar ve görüntüleme odaları için n = 23), ortalama uzunluk kırmızı dairesel olarak çizilmiştir. Hata çubukları = 1 SD. Kırmızı çizgi, ortalama uzunluklar boyunca doğrusal olarak uymaktadır. ( C ) ( B ) &#39;de gösterilen tüm yanal köklerin başlangıç ​​uzunluğuna göre ortalama büyüme oranını gösteren çizim. ( D ) Ardışık zaman noktalarında NPSN12-YFP ve RFP-TUB6&#39;yı ifade eden yanal köklerden elde edilen 3D konfokal yığınların maksimum yoğunluk projeksiyonları. Başlangıç: Kutulu bölgenin büyütülmesi. Yeşil oklar: ön-faz bantları; Beyaz oklar: mitotik iğler; Mavi oklar: phragmoplastlar; Ok uçları: kök tüyleri. ( E ) ( D ) &#39;de gösterilen transjenik çizginin genç bir yanal kökünden, yüksek çözünürlüklü görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyonları, 63X / 1.2 NA hedefi ve 0 saat ve 16&#39;da Nyquist örneklemesi (77 nm x 77 nm piksel boyutu) kullanılarak elde edildi. h; Yıldız işaretleri her zaman noktasında aynı hücreleri bulur; Ok, 0 saat ila 16 saat arasında bölünen bir hücreyi gösterir.Ölçek çubukları = 50 μm (AC); 20 um (E). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> Şekil 3 : Görüntüleme odalarında uzunlamasına yanal kök gelişimi. ( A ) Plaklara kıyasla, görüntüleme odalarındaki ardışık 24 saatlik aralıklarla ortalama mutlak kök büyümesini gösteren çizelge. Ns, p&gt; 0.05&#39;i; ***, p &lt;0.001 (öğrenci t testi) olduğunu gösterir. N = 33 (plakalar) ve n = 27 (görüntüleme odaları). ( B ) (A) &#39;da kullanılan tüm köklerde ardışık zaman noktalarında yanal kök uzunluklarını gösteren çizim. Kırmızı: Tabakta yetiştirilen tüm yanal köklerin ortalamasının 1 SD&#39;sinde (927 ve 3163 μm arasında) son uzunluğu olan tüm yanal kökler. ( C ) Maksimum72 saatin üzerindeki ardışık zaman noktalarında elde edilen, yanal köklerde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP&#39;yi temsilen 3D konfokal yığınlarının parlaklık projeksiyonları. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> Şekil 4 : Görüntüleme bölmeleri, diğer bitki organları için uyarlanabilir. ( A - C ) Birincil kökler için görüntüleme odacığı uyarlaması. ( A ) Görüntüleme odası tasarımı şeması. Bu, iki değişikliğin yanı sıra standart tasarımla aynıdır ( Şekil 1 ): MS orta tabaka,% 1.5 agar yerine% 0.8 agar ve agar ile bitki arasında bir selüloz film (kırmızı) içerilmesini önlemek için yerleştirirAğ içine. ( B ) 7 günlük fidenin birincil kökünde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP&#39;nin temsili 3D konfokal yığınlarının ( B ) XY (üst) ve XZ (alt) maksimum yoğunluk projeksiyonları, konvansiyonel bir görüntülemede 0 saat ve 48 saatte görüntülendi bölme. Kök, gravitropik tepki nedeniyle agara büyür. 0 saat ve 48 saatte görüntüleme yapılan yedi günlük fidenin birincil kökünde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP&#39;nin temsilci 3D konfokal yığınlarının ( C ) XY (üst) ve XZ (alt) maksimum yoğunluk projeksiyonları Selüloz filmli oda. Uygulamadan önce, selüloz filmi% 80 etanol içinde sterilize edildi ve sıvı ½ MS ortamında ıslatıldı. Kökün ağara gravitropik büyümesinin önlendiğini unutmayın. ( D - F ) Hipokotiller için görüntüleme odası uyarlaması. ( D ) Hipokotil görüntüleme odası tasarımını gösteren şematik. Bir poli (dimetilsiloksan) sakız contası (gri) üreticidirİki cam şerit arasındaki boşluk slaytında kırmızı (sarı). Eşit kalınlığa (bej) sahip% 1.5 agarlık bir kütük, kısmen boşluğa ulaşan slayt üzerine yerleştirilir. Oda PFD (mavi) ile doludur. Fideler ağar kütüğün üzerine yerleştirilir, böylece hipokotil agar kütüğünün ağzın aşağı doğru eğimli bölgesini kaplar ve kök agarın yatay bölümüne yerleştirilir. Oda lamel ile kapatılmıştır. ( E ) İki gün süren bir fidenin bir hipokotilinde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP&#39;yi temsilen 3D konfokal yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonları, ardışık zaman noktalarında 48 saat boyunca imgelemiştir. ( F ) ( E ) &#39;de gösterilen hipokotilin bazal-apikal ekseni boyunca (E&#39;de gösterilen eksende 0 saatlik göreceli pozisyonlar) bireysel hücrelerin iki ardışık zaman aralığında boyuna büyüme. Daha önce açıklanan hipokotil 16&#39;ya göç eden büyüme dalgasına dikkat edin. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> Film 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayın.</a> <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> Film 2: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> Film 3: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">Lütfen c</a>Bu filmi indirmek için yalamak.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Görüntüleme.  University of Oxford.  Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur. 

Video: A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em&gt; Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar&gt; Time-lapse Görüntüleme

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use products. Based on their chemical structure and estradiol-like biological properties, they have been classified as endocrine disrupting compounds (EDC). Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked to various health defects including cancer, behavioral disorders and infertility, with greater vulnerability indicated during early developmental periods. Cellular and molecular studies with the genetically tractable nematode model Caenorhabditis elegans have demonstrated that exposure to BPA causes apoptosis, embryonic lethality and disruption in the DNA repair mechanisms. We have previously reported that exposure of C. elegans embryos to low doses of different bisphenols decreases fecundity. In addition, we have shown that the effects of exposure during the very early stages of development persist into adulthood as assayed by quantifying habituation behavior, a form of non-associative learning. Here, we provide detailed protocols for embryonic exposure to low-dose EDCs as well as the associated fecundity and anterior touch habituation assays, along with representative results.

Exposure to environmental toxicants can acutely impact development with long-term effects. Detailed protocols are provided to illustrate a strategy using an effective lab model to study the effect of early embryonic exposure to bisphenol A. We provide fecundity and behavioral assays to monitor the effectiveness of our toxicant exposure bio-assays.

Embriyonik maruz kalma düşük doz Toxicants uzun vadeli davranış ve üreme sonuçları

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...