Biz mükemmel teknik yardım için Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi ve Kristina Wullimann teşekkür etmek istiyorum. Biz Plp-GFP fareler sağlamak için W. Macklin ederim. Alexander-von-Humboldt Vakfı tarafından ve ulusal fon ajansı (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; tarafından; TM Deutsche Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG) tarafından İleri Araştırmalar Enstitüsü (Technische Universität München), tarafından desteklenmektedir ) ERA-Net neuron &quot;iPSoALS&quot; ve &quot;2-foton görüntü&quot; çerçevesinde. TM ve MB Entegre Protein Bilim (Münih) Merkezi tarafından desteklenmektedir. PM Technische Universität München (TUM-GS) Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1. Triangularis sternumun Eksplantasyon (Şekil 1) Zamanlama: 15 dk. <ol><li> Forseps 2 çift, 1 adet makas, makas 1 adet makas, 1 doku kültür kaplarına (10-cm): cerrahi aletler hazırlayın. (15 dakika için asgari) önceden soğutulmuş kabarcıklandırılmış (4 ° C),% 5 CO2 /% 95 O ile 2 arasında Ringer çözeltisi. Buz ile 15-cm doku kültürü çanak doldurun ve metal plaka ile örtün. Diseksiyon mikroskobu hazırlayın ve diseksiyon sırasında eksplant soğutmak için diseksiyon kapsamında buz ile 15 cm çanak yerleştirin. </li><li> Öldürücü izofluran aşırı dozu (ya da kurban herhangi bir başka uygun yöntem) ile fare anestetize. Eksplant kürk kontaminasyonu önlemek için% 70 etanol ile fare püskürtün. SC beyazlatma için, akson eş zamanlı görselleştirme için Thy1-OFP3 veya Thy1-Membow13 için geçilebilen Plp-GFP fareler kullanılmıştır. </li><li> Büyük makas çifti kullanarak, bir orta hat kesi yapmaksternum ve kaburga kafesinin alt kenarına paralel iki kesinin üzerinde cilt. </li><li> Büyük makas çifti kullanarak, cilt kaldırmak karın duvarı açın ve Vertebral kolon tüm yolu geri göğüs kafesine kesiler paralel hale. Sonra sternum de kas ekleme yakın kesiler yaparak göğüs kasları kapalı teşrih. </li><li> Sadece ksifoid kıkırdak altındaki açık diyafram Kes ve kostal eklemeleri birlikte diyafram kapalı teşrih. </li><li> Forseps bir set ile kılıç şeklinde sürecinin kaburga kafesinin Holding, yakın kendi eklemeleri mümkün olduğunca, omurga kapalı kaburga kesim başlar. Sağ ve sol kesim ağız sapı sternumun doğru kalp Yukarıdaki yakınsama gerekir. Büyük kan damarlarının (özellikle subklavian damarlar) kesme önlemek için deneyin. Daha iyi görünürlük forseps ile ksifoid süreci üzerine tutarak yavaşça hazırlık kaldırarak elde edilir. </li><li> Sadece ağız sapı sternumun altında bir enine kesim yapmakve soğutulmuş% 5 CO 2 /% 95 O 2-kabarmış Ringer solüsyonu ile 10 cm&#39;lik çanak içine eksplant aktarın. Buz dolu 15 cm doku kültürü çanak kapsayan metal plaka üzerinde 10 cm&#39;lik çanak yerleştirin. Tüm diğer adımları diseksiyon mikroskop altında yapılmalıdır. </li><li> Küçük bahar makas kullanarak timus, plevra, diyafram (iç) ve pektoral kasların kalıntıları çıkarmak (dışında; Şekil 1B-D). </li><li> 3,5 cm&#39;lik çanak eksplant sığdırmak için, sternum takmayın tüm kaburga kapalı teşrih. Bu en küçük bahar makas kullanarak ve kaburga (Şekil 1E) arasında doku kesme yapılır. </li><li> Minutien işaretçilerine (; Şekil 1G &lt;4 mm olarak kısaltılmıştır) kullanarak Sylgard kaplı 3,5 cm doku kültürü çanak içine triangularis sternumun sinir-kas eksplant Pin. İki işaretçilerine sternumun kıkırdak (beyaz) parça geçmesi gerekir. Hem th sağ ve sol tarafında kaburga ile en az iki pimleriniE eksplant yumuşak kıkırdak parçaları amaçlayan ve altında kaburga kaçınarak veya triangularis kas yakındır. Daha işaretçilerine kullanılan, daha iyi (biz genellikle 8-10 kullanabilirsiniz). Eğer hazırlık aşağı pin gibi, biraz gergin pozisyona kas sabitleme, kaburga biraz yayılmış olduğundan emin olun. </li><li> İsteğe: Alexa renklendiriciler (% 5 CO2 /% 95 hava kabarcığı O 2-Ringer çözeltisi içinde 0.8 ug / ml &#39;lik konsantrasyonda) akuple bungarotoxin eklenmesi ile asetilkolin reseptörleri içeren sinaptik görselleştirme. Oda sıcaklığında 15-20 dakika için Sylgard kaplanmış çanak içinde tutturulmuş eksplant inkübe sonra% 5 CO2 /% 95 hava kabarcığı O 2-Ringer solüsyonu ile birkaç kez yıkayın. </li></ol> 2. Bleaching SC&#39;ler ve İsteğe Time-lapse Mikroskopi (Şekil 2) Zamanlama: 30 - 45 dk + isteğe bağlı 1 - time lapse için 5 saat. <ol><li> Bir konfokal mikroskop donanımlı zekâ Transfer 3,5 cm Sylgard kaplı çanakh bir argon lazer (488 nm dalgaboyu) ve suya batırma amaçları (4x, 0.13 NA; 20x, 0.5 NA ve 100x, 1.0 NA veya 60x, 0.9 NA). </li><li> Zaman atlamalı mikroskopi için İsteğe Bağlı: Insert ısıtma halka içine çanak 3,5 cm Sylgard kaplı, superfusion sistemi ve sıcaklık probu (Şekil 2A) yükleyin. Bunların hiçbiri eksplant, çanak veya Sylgard kaplama jant temas ettiğinden emin olun. 33-35 için örnek ısıtılır ° C. Hücreler beyazlatma adımlar arasındaki az dinamikleri göstermek gibi SC time-lapse olmadan beyazlatma için, oda sıcaklığında, daha iyidir. </li><li> 4x hava hedefi triangularis sternumun kas innervasyonu desen gözlemlemek ve triangularis sternumun plak grup bulmak ile. 20x daldırma koni objektif geçin ve plak bant (alanlar örten kaburga iyi adaylardır) içindeki yüzeysel bölgeler için aramaya başlamak. Bireysel NMJs kontrol etmek 100x veya 60x daldırma koni objektif objektif değiştirin. İdeal birkaç SC&#39;ler ile kaplıdır ve çok superfic bulunan bir NMJ olduğunuially (Şekil 2B). Eğer beyazlatma sonrası time-lapse görüntüleme yapıyorsanız, nispeten verimi artırmak için birbirine yakın 3 NMJs kadar seçin. </li><li> Foto-ağartma bireysel SC&#39;ler (Şekil 2B) önce NMJ bir konfokal görüntü edinin. (Olympus FV1000 mikroskop örneğin tam çözünürlüklü görüntüleme için, piksel başına ~ 0.1 mikron Nyquist-sınırlı örnekleme neden bir 100x, 1.0 NA objektif ve 2.5 zoom kullanın.) </li><li> &quot;Park&quot; merkezi (5 saniye alternatif böyle bir Olympus mikroskop &quot;kasırga tarama&quot; işlevi olarak kullanılabilir ilgi küçük bir bölgede etkin bir tarama deseni, maksimal güç kullanarak SC çekirdeğinde 488 nm lazer ışını; biz bir konfokal mikroskop kullanımı gibi, lazer 1.0 NA objektif bir 488 nm, dolayısıyla görüntü eşlenik uçakları içine odaklanmış ve bu nedenle, çapı &lt;0.5 mikron). Sonuç beyazlatma hücre ve yargıç üzerinde yeniden odaklanır. GFP seviyelerine kadar tekrar adım ağartma gerekli tekrarlama azaltmak isenizyakın plan seviyeleri d. (Şekil 2C) beyazlatma sonrası bir görüntü elde edin. Bu ağartılmış bölgede iki hücre arasında herhangi bir çakışma dışında olduğundan emin olmak için önemlidir - örtüşme varsa, ikinci bir hücreye beyazlatma belirgin olacaktır. </li><li> Biri hariç tüm SC (Şekil 2D-E) ağartılmış kadar yukarıdaki adımı tekrarlayın. Son &quot;ağartılmamış&quot; SC konfokal time-lapse mikroskopi için uygundur. Görüntülerin çıkarılması ile tek hücre yeniden, örneğin tek SC morfolojisi ve bölge (Şekil 2F) belirginleştiren, Photoshop yazılımı kullanarak. İki mages çıkarılarak gürültü (Photoshop ardışık &quot;katmanlar&quot; bunları ithal ve ardından kanalları sekmesinin üst kısmındaki açılır menüden de &quot;fark&quot; için üst kanala ayarlayarak gibi) ekler unutmayın. Bu çıkarmadan önce kanallarında &quot;Benek&quot; fonksiyonunu kullanarak ve tabii kaynaklı değil herhangi bir arka plan uzak kırpma tarafından atlatılabilirağartılmış hücre. Kontrastı optimize etmek için, bu &quot;düzeyleri&quot; penceresinde iki kanalın parlaklığını ayarlamak için gerekli olabilir. Ağartılmış hücre çıkan görüntü ise benzersiz bir renk tonu sözde renkli bir sinaps orijinal görüntü üzerine bindirilmiş ve (tüm ağartılmış için bunu yapmalarını orijinal görüntüdeki ağartılmış hücrenin topraklarında renklendirmek için şeffaf yapılmış ve son , ağartılmamış hücreler Şekil 2F neticelerinde gösterildiği resim). </li><li> İsteğe bağlı: Biri hariç tüm SC&#39;ler beyazlatma sonrası Başlangıç ​​konfokal time-lapse mikroskopi. Sabit aralıklarla (örneğin, her 5-10 dk), bir görüntü al. Mümkün olduğunca az lazer güç olarak kullanın. Kadar 3 NMJs aynı seansta görüntülenebilir. </li><li> Sonra, yakınlaştırma olmadan 100x az 20x ve ​​4x hedefleri (Şekil 2G-I) kullanılarak bölgenin görüntüleri bir görüntü alarak zaman lapsed NMJs bir harita olun. Bu &quot;harita&quot;, sabit bir kas immünohistokimya ardından NMJs bulmak için gereklidir. </li><li> Görüntü içinişleme, maksimum yoğunluğu projeksiyonları içine bireysel görüntüleri dönüştürmek ve tiff formatında kaydedin. Bir yığın içine tüm z yansıtılan zaman noktaları birleştirin ve xy hizalamak, örneğin (açık kaynak yazılım ImageJ dayanan bir paket; Ulusal Sağlık Enstitüleri) Fiji &quot;stackreg&quot; eklentisi kullanarak 10. </li></ol> 3. Fiksasyon ve İmmünohistokimya (Şekil 3) Zamanlama: geceleme. <ol><li> Dikkatli bir şekilde pimleri kaldırarak, en az 15 ml% 4 PFA içeren 50 ml reaksiyon tüpü içine eksplant aktarın. Buz üzerinde 1 saat triangularis sternumun kas içeren anterior göğüs duvarı post-fix. En az 10 dakika boyunca PBS içerisinde 0.1 M glisin (kalıntı sabitleştirici gidermek ve böylece arka planı azaltmak için) ile sabit doku durulayın. Numuneler bu noktada saklanabilir ve daha sonra işlenebilir. </li><li> 0.01 M PBS ile dolu bir 10 cm Sylgard astarlı doku kültürü çanak sabit eksplant aktarın. Biri si olan bir yamuk şekli kesipgöğüs kemiği ve kemik-kıkırdak geçişler yoluyla diğer de paralel - bu yüzeyinde triangularis kas içerir. Yatay (yani trans-sternal) triangularis kas kaudal sonunda serbestçe erişilebilir, böylece kesilmiş olan alt kaburga çıkarın (Şekil 3A-D). </li><li> Yamuk üst kısmı (Şekil 3E) içine bir pim gibi, bir derialtı iğne yerleştirin. Nazikçe bir kas kaudal köşe tutunma ve bir mikro-neşter olarak iğne kullanarak yüzey üzerinde triangularis kas kaldırmak için 1 ml&#39;lik şırınga ve forseps ile bağlı bir hipodermik iğne kullanarak. Keser Torasik duvar düzlemine paralel yapıldığından emin olun. Kas kaudal kısmı serbest bırakıldıktan sonra, göğüs duvarı aracılığıyla kas altına bir iğne gibi başka bir derialtı iğne takın - Bu hazırlık immobilizes ve forseps (Şekil 3F) kullanarak kas üzerinde hafif bir çekme uygulayarak sağlar. Eğer bağ tiss kesim gibiue eklemeleri, &quot;soyma&quot; away göğüsten kas. Yaylı makas ile son kaudal eki kesin. Forseps kullanarak yağ ve kan damarı kalıntıları çıkarın. . Canlı ve sabit doku ile çalışmak için araçlar ve yemekleri ayrı ayrı kümeler kullanın: sinirler uzakta rip değil unutmayın dikkatli olun. </li><li> Oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat boyunca bloke etme çözeltisi içine doku örnekleri aktarılması ile immünohistokimyasal (bir standart protokolü kullanarak) başlatın. Boyanması için mümkün olan en küçük hacim 96-kuyucuklu bir plaka ile 200 ul bir. </li><li> 4 gecede engelleme çözümü, kuyu başına 200 ul, ° çalkalayıcı üzerinde C seyreltilmiş primer antikor uygulayın. </li><li> 10 dakika için 0.01 M PBS içinde üç kez yıkanır. </li><li> Bloke etme çözeltisi ile seyreltilir, oda sıcaklığında, 1-2 saat için uygun bir ikincil antikor uygulanır. </li><li> 10 dakika için 0.01 M PBS içinde üç kez yıkanır. </li><li> Anti-fading orta (örn. Vectashield) ve lamel olarak monte edin. </li><li> Manyetik metal plaka üzerine yerleştirin slayt, üstüne koyun mıknatıs4 ° C&#39;de birkaç saat veya gece boyunca düzleştirmek için örnek Oje ile mühürleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan SC beyazlatma yöntemi, basit, hızlı ve çok yönlüdür: (i) tek bir transgen esas konfokal mikroskopi ile tek SC morfolojisi ve dinamikleri açığa sağlar - Ek allelleri gerektiren hastalık modelleri ile yaklaşım örneğin birleştirerek zaman önemli bir avantaj . Diseksiyon dan tespit için yarım gün içinde gerçekleştirilebilir (ii) &#39;deki metod olup, hızlıdır. Bu tür hücre ablasyon, görüntüleme organeller, elektrofizyoloji veya immünohistokimya gibi başka yöntemler ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirketi (örnek) </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> % 70 (hacim / hacim) etanol </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> sprey şişesinde </td></tr><tr><td> izofluran </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> Başka onaylı anestetik öldürücü anestezi için kullanılabilir </td></tr><tr><td> transgenik fareler (Plp-GFP) </td><td></td><td></td><td> anılan kaynaklardan elde edilecek </td></tr><tr><td> soğuk ışık aydınlatması ile diseksiyon mikroskobu </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> Schott KL 1500 LCD ile donatılmıştır </td></tr><tr><td> forseps #2 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> forseps # 5 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> makas, büyük bir tıp </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> makas, küçük açılı bahar </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> in-line ısıtıcı </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 cm yemekleri için halka ısıtma </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> İki kanallı sıcaklık kontrol sistemi </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> superfusion pompa sistemi </td><td></td><td></td><td> sipariş üzerine yapılmış </td></tr><tr><td> 15-cm doku kültürü çanak </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> buz ile dolar ve metal plaka ile kaplı </td></tr><tr><td> 10-cm doku kültürü çanak </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> Oksijenli Ringer solüsyonu ile </td></tr><tr><td> 3,5 cm doku kültürü çanak </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> Sylgard polimer ile dolu </td></tr><tr><td> Sylgard polimer </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Silikon Elastomer Takımı </td><td></td></tr><tr><td> konfokal mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> FV1000 </td><td> argon laser </td></tr><tr><td> 50 ml reaksiyon tüpü </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PBS içinde% 4 PFA </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Kanül 0.5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml şırınga </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> sinaptofizin antikor </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> tavşan </td></tr><tr><td> sekonder antikor </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-kuyulu plakalı </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> PBS içinde 0.1 M glisin </td><td> Roth </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> lamelleri </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> slaytlar </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör laboratuvarları </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien işaretçilerine × 10 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26002-20 </td><td> &lt;4 mm kısaltılmış </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin Alexa 594 akuple </td><td> Invitrogen (Moleküler Sondalar) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözüm Engelleme </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> % 0.2 Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% Normal Keçi Serum </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> % 1 sığır serum albümini </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ringer % 95 O2 /% 5 CO2 ile kabarcıklandırılmış </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 mM KCI </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1.25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM glikoz </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Özgül reaktifleri ve ekipmanları. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Foto-ağartma Sıralı NMJ tek tek SC&#39;ler etiketlemek için bir non-invaziv bir yol sağlar. NMJ memeli sinir sisteminin büyük sinaps ve sinaptik yapısı ve fonksiyonunu araştırmaya modeli yol gösterici olarak görev yapmıştır. Fare NMJs Motor akson terminalleri olarak kas lifleri ile simit benzeri iletişim siteleri oluşturur. Motor akson ve terminali SC&#39;ler tarafından kılıflı edilir. Geçtiğimiz on yıl içinde, çok sayıda transgenik farelerin sırasıyla Thy1-XFP 1 ve Plp-GFP fareler 2 örneğin, motor nöronlar ve SC&#39;ler görselleştirmek için üretilmedi. Motor akson boyunca myelinating aksonal SCs sıçrayabilen aksiyon potansiyelinin yayılmasını sağlamak için, Ranvier düğümler yoluyla ayrılmış ve çakışma internod düzenlenmiştir. Buna karşılık, sinaps terminal SC&#39;ler izlemek ve nörotransmisyon teşvik, enkaz ve kılavuz rejenere aksonların sindirmek özelleşmiş glia hücreleri vardır. NMJs sıkıca yarım düzine olmayan myel kadar kapsamındadırTerminal SC&#39;ler inating - onlar doğrudan membran temas 3&#39;te olduğu gibi bu, ancak, ayrı ayrı, ışık mikroskobu ile çözülemez. Çeşitli yaklaşımlar bireysel terminali SC&#39;ler görselleştirmek için var. Bunların hiçbiri olsa, kusursuz vardır. Örneğin, tek hücreler bir boya ile doldurulmuş bir mikroelektrot kazığa olan boya dolgu, ikinci bir doldurma önce bir etiketli hücre tahrip gerektirir. Bu sonraki time-lapse kayıt 3 ile uyumlu değildir. SC&#39;ler Çok-spektral &quot;Brainbow&quot; etiketleme floresan proteinlerinin kombinatoryal ifadesi 4 kullanılarak elde edilmiştir. Ancak bu teknik, çeşitli transgenlerin bileşiminden oluşur ve ikinci promoterlerin salgılama modeli ile sınırlıdır. Gelecekte, SCs içinde &quot;foto-değiştirilebilir &#39;proteinlerin ekspresyonu daha başka bir alternatif 5 olabilir. Burada ardışık fotoğraf beyazlatma tek hücre ağartılmış, nerede ve çıkarılması ile elde ettikleri görüntüyü sunmak. İnanıyoruzBu yaklaşım - kolaylığı ve çok yönlülük nedeniyle - in vivo kullanılan ve diğerleri hücre tipleri, anatomik siteleri veya türlerin 6 transfer edilebilir özellikle sinirbilimci teknoloji paletine kalıcı yanı, temsil eder. Triangularis sternumun kas eksplantlar terminali SC&#39;ler için ağartma sıralı ve sonraki konfokal time-lapse mikroskopi aşağıdaki protokol, biz detaylı uygulama. Bu, ince yüzeysel ve kolayca diseke sinir-kas hazırlık 7,8 NMJ gelişimi, fizyolojisi ve patolojisi 9 çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Nihayet, biz fiksasyon yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme, immünohistokimya veya ultrastrüktürel incelemeler korelasyon gerçekleştirmek için sonra triangularis sternumun kası nasıl hazırlanır açıklamak.

Görüntüleme yemek için hazır bir triangularis sternumun eksplant bir örneği Şekil 1G &#39;de gösterilmiştir. Triangularis kas kas liflerinin birkaç katmandan oluşur ancak bu gibi eksplant NMJs ex vivo görüntüleme için özellikle uygundur. Bu, transgenik fare hatları elde edilen eksplantlarından yüksek çözünürlükte görüntü elde sağlayan vurgulamak SCs (PLP-GFP 2) ve / veya akson (Thy1 XFP-1) ya da. Yüksek kaliteli görüntülem...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Gibi nöromüsküler kavşaklar (NMJs) terminal Schwann hücreleri (SC&#39;ler) gibi sık donatılı dokularda, tek tek hücrelerin Görselleştirme zordur. &quot;Ardışık fotoğraf beyazlatma&quot; bleaching sıralı time-lapse görüntüleme ile kombine edilebilir triangularis sternumun kas eksplant, elverişli bir sinir-kas preparatı,, örneğin tek bir terminal SC&#39;ler, tasvir verir ve<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunostainings.

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

sequential-photo-bleaching-to-delineate-single-schwann-cells-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K Görüntüleme.  Technische Universität München. Gibi nöromüsküler kavşaklar (NMJs) terminal Schwann hücreleri (SC'ler) gibi sık donatılı dokularda, tek tek hücrelerin Görselleştirme zordur. "Ardışık fotoğraf beyazlatma" bleaching sıralı time-lapse görüntüleme ile kombine edilebilir triangularis sternumun kas eksplant, elverişli bir sinir-kas preparatı,, örneğin tek bir terminal SC'ler, tasvir verir ve Post-hoc Immunostainings.

Video: Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Nörobilim

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Algılama<em&gt; In Situ</emEn&gt; Protein-protein kompleksleri<em&gt; Drosophila</emProximity ligasyon Testi Kullanımı&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Tanımlanmış Bir Motor Nöron için Nöromüsküler Kavşaktaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Drosophila Yetişkin Bacağının Diseksiyonu ve İmmünhistokimyası

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

Sıçan Medial Gastroknemius Kasında Nöromüsküler Kavşağın Morfolojik Özelliklerinin Görselleştirilmesi

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...