Bu protokol, normal ve patolojik koşullar altında nöromüsküler kavşağın bütünlüğünü ve plastisitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik, Schwann hücrelerini ve laboratuvar hayvanlarını tek kas bölümlerinde aynı anda etiketlemek için kullanılır. Yetişkin erkek sıçanı ötenazi yaptıktan sonra, sıçanı kaputun içine yerleştirin ve makas ve forseps kullanarak kalbe erişmek için göğüs boşluğunu açın.
Sol kardiyak ventrikülden aort yönünde intravenöz kateter yerleştirin ve sağ kahili kesin. Daha sonra, sağ kahinin içinden çıkan kan temizlenene kadar perfüzyona 100 mililitre% 0.9 normal salin ile başlayın. Daha sonra 10 dakika boyunca 0.1 molar fosfat tamponunda veya PB pH 7.4'te 250 ila 300 mililitre% 4 paraformaldehit ile perfüzyona devam edin.
Perfüzyondan sonra, cerrahi bir bıçak kullanarak bilateral arka ekstremitenin derisini çıkarın ve bilateral siyatik sinir ve medial gastroknemius kasını açığa çıkarın. İki taraflı medial gastroknemius kasını bir bıçak kullanarak arka bacaklardan dikkatlice diseke edin ve tüm kası 10 mililitre% 4 paraformaldehit içine sabitleyin. İki saat sonra, kası çözeltiden çıkarın ve kriyodört santigrat derecede bir gün boyunca 0.1 molar PB'de 10 mililitre% 25 sakkarozda koruyun.
Kas dokusu sakkaroz çözeltisine daldırıldıktan sonra, dondurulmuş bir kesit ortamı kullanarak sürgülü bir mikrotom sisteminin donma aşamasına sabitleyin. Kasları, kasın uzun ekseni boyunca yatay olarak 80 mikron kalınlığında dilimleyin. Bir fırça kullanarak, kuyu başına yedi kriyo bölümünü, 10 mililitre 0,1 molar PB içeren altı kuyucuklu bir kültür plakasına düzenli bir şekilde yerleştirin. Floresan boyama için, 20 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda 75 mikrolitre% 10 Triton X 100 ve 45 mikrolitre normal eşek serumu içeren 1.5 mililitre 0.1 molar PB ile kuyu başına dört bölüm inkübe edin.
30 dakika sonra, bölümleri tavşan anti-nöro filament 200, keçi anti-veziküler asetilkolin taşıyıcısı,% 1 normal eşek serumunda veya% 0.5 Triton X 100 içeren karışık bir primer antikor çözeltisinin 1.5 mililitresine aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri 20 rpm'de orbital çalkalayıcıda 0.1 molar PB'de her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, bölümü, eşek anti-tavşan AF 488 ve eşek anti-keçi AF 546 içeren karışık bir ikincil antikorlar çözeltisinin yanı sıra,% 1 normal eşek serumu ve% 1 Triton x 100 içeren 0.1 M PB'de bulunan alfa bungaro toksini AF 647 ve falloidin 350'nin biyobelirteçlerini bir saat boyunca inkübe edin, Onları ışıktan korumak.
Kuluçkadan sonra, bölümleri PB'de yıkayın ve mikroskop slaytına monte edin. Damıtılmış suda% 50 gliserin kullanarak bölüme kapak camı uygulayın. Sayısal diyafram açıklığına sahip 20 x öznel lens ve 0,95 sayısal diyafram açıklığına sahip 40 x lens ile donatılmış bir con focal görüntüleme sistemi kullanarak numuneyi gözlemleyin ve görüntüleyin.
Çoklu floresan görüntüleme için, her bir biyobelirtecin uyarma ve emisyon dalga boylarını metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın. Görüntü yakalama çözünürlüğünü 640 x 640 piksel olarak ayarlayın. Ardından, başlangıç ve bitiş odak düzlemini ayarlayın.
Adım boyutunu bir veya iki mikrona ayarlayın. Ardından derinlik deseni, görüntü yakalama ve Z serisini seçin. 20 X'te daha düşük büyütmeli görüntüler için, 105 mikronluk bir iğne deliği kullanarak iki mikron adım boyutunda 40 Z yığın görüntüleri yakalayın.
Tüm görüntüleri tek bir odakta bütünleştirmek için Z ekseni üzerinden projeksiyon veya topografya modunu ve yoğunluk projeksiyonunu seçin. 40 X'te daha yüksek büyütmeli görüntüler için, yakınlaştırma iki olarak ayarlanmış ve 105 mikron iğne deliği ile bir mikron adım boyutunda 80 Z yığın görüntüleri yakalayın. Tüm görüntüleri tek bir odak noktasında bütünleştirin.
Görüntü işleme sistemi ile görüntüleri üç boyutlu desende yeniden oluşturun. Medial gastroknemius kasının nöro filament 200 pozitif sinir lifleri, veziküler asetilkolin taşıyıcı pozitif presinaptik terminal, alfa bungaro toksin pozitif post-sinaptik asetilkolin reseptörleri, S100 pozitif perisinaptik Schwann hücreleri, faloidin pozitif kas lifleri ve DAPI işaretli hücresel çekirdekler ile temsili uzaysal korelasyonu burada gösterilmiştir. Nörofilament 200 pozitif sinir lifleri demet halinde koştu.
Bu sinir lifleri, veziküler asetilkolin taşıyıcı pozitif presinaptik terminallere dallar verdi ve bu da alfa bungaro toksini pozitif post-sinaptik asetilkolin reseptörleri ile ayna ilişkisi oluşturdu. Ek olarak, S100 pozitif perisinaptik Schwann hücreleri, pre-sinaptik terminallere yakın nörofilament 200 pozitif sinir lifleri etrafında tespit edildi. Uzamsal korelasyon ayrıca nöromüsküler kavşağın ayrıntılı morfolojik özelliklerini farklı perspektiflerden gösteren üç boyutlu bir desende sergilendi.
Kas kesitlerinde daha fazla görüntüleme gözlemlemek için, kası uzun eksen boyunca yatay olarak 80 mikron kalınlığında dilimlemek çok önemlidir.
