Yetişkin farelerin iskelet kaslarından tek miyofiberleri izole etmek için birçok protokol vardır. Protokolümüz çok genç fareler ve çok kırılgan miyofiberleri olan küçük fareler için hazırdır. Bu standart prosedür, doğum sonrası gelişim sırasında miyofiber destekli kas kök hücrelerinin incelenmesinde veya miyofileri özellikle mekanik strese duyarlı hale getiren hastalıkların fare modellerinde kullanılabilir.
Prosedür, doktora öğrencisi Gloria Pegoli ve doktora sonrası bir laboratuvardan gelen Federica Lucini tarafından gösterilecek. Kas diseksiyonu ve hasat için, bir diseksiyon tahtası üzerine bir ötanazi, çok genç veya çok küçük bir fare bir arka ekstremite düzeltmek için bir pin kullanın ve ayak bileği yüksekliğitibialis anterior alt tendon kaldırmak için keskin cımbız kullanın. Tendon kesmek ve patella düzeyinde tendon için kas etrafında tüm yol kesmek için ince makas kullanın.
Sindirim çözeltisi bir tüp içine kas yerleştirin ve ekstansör digitorum longus alt tendon kaldırın, diğer kaslardan ekstansör digitorum longus ayırmak için tendon üzerinde yavaşça yukarı çekerek. Kasları kesip hasat edin. Arka kasları görüntülemek ve aşil tendonu kaldırmak için bacak döndürün.
Bir gastroknemius kas otomatik olarak diğer kaslardan ayrı olacaktır. Patellanın arka kısmındaki üst tenonu kesin ve kasları sindirim çözeltisine yerleştirin. Bacağın dış tendonu kaldırın ve tendon altında cımbız rulo yavaşça kas tendon ayırmak için.
Sonra, kas hasat ve aynı şekilde diğer bacak aynı kasları toplamak için kesti. Tüm kaslar toplandığında, 45 ila 50 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu içine toplama tüpü yerleştirin ve şiddetle tüp 10 kez her 10 dakikada bir ters. Kaslar gevşemeye başladığında ve miyolifler görünür hale geldiğinde, sindirim süspansiyonuna önceden ısıtılmış veya serum kaplı 100 milimetrelik petri kabına dikkatlice aktarmadan önce örnekleri son bir kez daha sallayın ve 10 mililitre yıkama solüsyonu içeren 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin.
Tek miyofiberleri izole etmek için, bir diseksiyon mikroskobu altında çanak yerleştirin ve tek tek kas lifleri almak için 200 mikrolitrelik pipet ucu kaplı bir at serumu kullanın. Canlı miyofiberleri, beş mililitre önceden ısıtılmış yıkama solüsyonu içeren 35 milimetrelik Petri kabına aktarın. Tüm canlı miyofiberler toplandığında, hücre kültüründeki miyofiber örneklerini beş dakika lığına dengeleyin.
Daha fazla miyofiber gerekiyorsa, ek lifler mekanik olarak serbest bırakılana kadar kalan kas dokusu örneğini triturate için büyük delikli cam pipet kullanın. Yeterli miyofiberler toplandığında, ek bir denge süresi için bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka içine çanak yerleştirin. Kuluçka sonunda, uygun kültür ortamı nı içeren yeni, önceden ısıtılmış at serumu kaplı bir tabağa bireysel miyolifler imal edin ve plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.
Miyofenlerin immünororesananalizi için, çapraz bağlanmadan sonra, tüm ama yeterli supernatant kaldırmak, herhangi bir lifleri kaldırmak ve aynı tüp bir mililitre eklemek 0.5% Triton X-100 PBS nazik ajitasyon ile beş dakikalık kuluçka için. Kuluçka sonunda, liflerps PBS 1.5 mililitre ile supernatant değiştirmeden önce beş dakika yerleşmek için izin verin. Nazik ajitasyon beş dakika sonra, bloke çözeltisi bir mililitre ile supernatant değiştirmeden önce lifler başka bir beş dakika yerleşmek için izin verin.
Nazik ajitasyon bir saat sonra, nazik ajitasyon ile dört derece santigrat bir gecede kuluçka için ilgi birincil antikorlar içeren taze engelleme solüsyonu ile engelleme solüsyonu değiştirin. Ertesi sabah, hafif ajitasyon ve yıkama için oda sıcaklığında sedimantasyon beş dakika kullanarak PBS taze 0.25% Tween 20 bir mililitre üç beş dakikalık yıkama ile lifleri yıkayın. Son yıkamadan sonra, ışıktan korunan hafif ajitasyon ile oda sıcaklığında bir saat boyunca bloklama çözeltisi seyreltilmiş uygun florokrom konjuge ikincil antikorlar ile lif etiket, PBS artı% 0.1 Tween üç yıkama takip, ışıktan korunan, gösterildiği gibi.
Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında ışıktan korunan hafif ajitasyonla beş dakikalık bir kuluçka için süpernatantı bir mililitre DAPI çözeltisi ile değiştirin. Kuluçka sonunda, lifleri yıkayın ve lifleri toplamak ve dikkatle bir cam slayt üzerinde lifleri yayıldı bir kesme ucu ile bir engelleme çözeltisi kaplı pipet kullanın. Bir diseksiyon mikroskobu altında slayt yerleştirin ve ayna tarafından yansıtılan sadece doğal ışık kullanarak, lifleri yavaşça yaymak ve aşırı çözeltikaldırmak için yeni bir 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.
Fazla çözeltiyi çıkardıktan sonra, çok küçük bir çözelti hacmi kalana kadar kaydıraktan 10 ila 15 dakika karanlıkta kurumasını bekleyin. Daha sonra, dikkatle dokuların üzerine bir kapak kayma yerleştirmeden önce lifler üzerinde montaj orta uygun bir hacim ekleyin. Büyüme faktörü zengin ortamda 96 saat hayatta kalabiliyor uzun, canlı liflerin yeterli sayıda almak için, dört farklı kaslar genellikle hasat ve sindirilir.
Sadece en sağlam lifler kültür ortamına aktarılmalıdır. Kırık lifler ve diğer enkaz atılmalıdır. 72 saatlik kültürden sonra, aktif uydu hücreleri miyofibere bağlı hücre agregaları üretirler.
Hücre kültürünün Lamin deltasından türediğini gözlemliyoruz sekiz 11 çift negatif fare daha az sayıda hücreden oluşur. 96 saat sonra, uydu hücreleri MyoG'yi ifade ediyor, hücre kümesi içinde görünür hale, yeni miyofiberlere doğru farklılaşmayı başlatıyorlar. Özellikle, homozigot mutant Lamin nakavt farelerde yabani tip benzerlerine göre uydu hücresi farklılaşmasının gecikmiş dinamiği gözlenmektedir.
Hızlı ve hassas kas hasat deneyin başarısı için gerekli olduğu gibi kas diseksiyonu adımları uygulama emin olun. Bu teknik aktivasyon ve farklılaşma sırasında tek uydu hücrelerinin izlenmesine olanak sağlayarak, farklı fizyolojik ve patolojik koşullar altında kas büyümesi ve yenilenmesinin altında yatan temel süreçlerin incelenmesini kolaylaştırır.
