Kas kök hücreleri endojen nişleri ile ilişkili kalır ve örneğin siRNA transfection yoluyla kolayca manipüle edilebilir. Bu yöntem, nişi koruyarak in-vivo durumu standart 2D kültür modellerine göre daha yakından andıran bir ortamda kültürdeki kas kök hücrelerini analiz etmeyi mümkün kılar. Steril pastör pipetleri elmas kalemle keserek başlayın.
Her fare için, yaklaşık 0,3 santimetre açıklığı ve yaklaşık 10 ila 12 santimetre uzunluğunda bir büyük delik pipet ve yaklaşık 0,1 santimetre küçük bir açıklığa ve yaklaşık 22 santimetre uzunluğa sahip ikinci bir cam pipet kullanın. Pipet uçlarını bir Bunsen brülörünün alevi içinde yumuşak hareketle beş ila 10 saniye tutarak her iki pipetin kenarlarını yumuşatma. Kullanmadan hemen önce, tüm pipeti beş dakika boyunca 2 mililitre at serumu ile doldurarak, daha sonra at serumu enjekte ederek ve pipetlerin oda sıcaklığında beş dakika kurumasını sağlayarak her iki pipeti de steril at serumu ile kaplayın.
Tüm ekipmanları ve farenin arka uzuvlarını% 70 etanol ile püskürtün. Cildi çıkarmak ve alttaki kasları ortaya çıkarmak için sertleştirilmiş ince kavisli makas ve ince tokmaklar kullanın. Alttaki kaslara zarar vermeden ince kavisli antips ile çevredeki fasyayı çıkarın.
Tibialis ön veya TA'yı çıkarmak için distal TA tendonu toparlayıp ince makasla kesin. TA'yı tendonda tutarken, dizine doğru çekin ve EDL kasını ortaya çıkarmak için kası dizine yakın kesin. Distal EDL tendonu kavisli önps ile kaldırın ve ince Vannas yay makası ile kesin.
EDL'i dizine doğru dikkatlice çekerek proksimal EDL tendonu ortaya çıkın. Daha sonra proksimal tendonu makasla kesin. Reaksiyon tüpündeki EDL kaslarını dolaşımdaki bir su banyosunda 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Kaslar gevşediğinde ve tek mil lifler göründüğünde sindirimi durdurun. Isıtma plakası ile donatılmış steril bir dürbün mikroskobu altında çalışmak, büyük delikli pipet kullanılarak kasları sıcak izolasyon ortamı ile kızartırdı. İstenilen sayıda miyofiber çözeltide serbestçe yüzene kadar kasları büyük delikli pipetle ayrıştırın.
Enkazı yıkamak için, sözleşmeye bağlı olmayan miyofiberleri izolasyon ortamıyla dolu ikinci kuyuya aktarmak için küçük delikli cam pipeti kullanın. Daha sonra 50 ila 100 sözleşme dışı miofiber'i myofiber kültür ortamıyla dolu 24 kuyu plakasının bir kuyusuna aktarın. Miyofiberleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksiti 72 ila 96 saat kuluçkaya yatırın.
Miyofiber izolasyondan dört saat sonra miyofiber ilişkili kas kök hücrelerini transfect. 25 mikrolitre Opti-MEM'i ilgili siRNA hacmi ile 1,5 mikrolitre transfeksiyon reaktifi içeren 25 mikrolitre Opti-MEM ile birleştirin. Reaksiyon karışımını beş dakika kuluçkaya bırakın ve 24 kuyu plakasındaki hücrelere ekleyin.
Sonra plakayı zamana saygı için 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Burada sadece immünofluoresan boyama protokolünün kritik adımları gösterilmiştir. Dikkatlice, kuyuda bir çözelti bırakırken myofiber kültür ortamını atın.
Miyoberleri bitişik kas kök hücreleriyle sabitlemek için 500 mikrolitre% 2 paraformaldehit ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Üstnatant dikkatlice çıkarın ve myofibers PBS ile üç kez yıkayın.
Sekonder antikorlarla inkübasyondan sonra kuluçka adımları sırasında plakayı folyo ile örtün. Mikroskobik bir cam kaydırağa daire çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Daha sonra miyofiberleri mümkün olan en küçük hacimde slayta aktarın ve dağıtın.
Kalan sıvıyı küçük delikli pastör pipet veya 200 mikroliter pipet ile çıkarın. İki damla sulu montaj ortamı kullanın ve miyofiberleri bir kapak kayması ile örtün. Daha sonra slaytların kurumasına izin verin ve karanlıkta dört santigrat derecede saklayın ve ardından mikroskobik analiz yapın.
Bu protokol, murine EDL kaslarından tek miyofiberlerin türetme ve kültürünü göstermektedir. Pax7 için immünofluoresan boyama kas kök hücrelerinin çekirdeklerini tanımlamak için kullanıldı. Büyütülmüş alan, bitişik kas kök hücresi ile miyofiberi ortaya çıkarır ve bir kas kök hücresinin çekirdeğindeki PAX7 immünofluoresans sinyalini gösterir.
Kas kök hücreleri miyojenik ilerlemesi belirteç ekspresyonu ile analiz edilebilir. Pax7 varlığı ve MyoD ekspresyonunun yokluğu, taze izole edilmiş miyoberlerin sessiz kas kök hücreleri ile ilişkilidir. Çoğalma kas kök hücrelerinde MYOD ekspresyonu gözlenebilir.
72 saat sonra, kas kök hücreleri farklı miyojenik durumlara sahip soy kümeleri oluşturur ve bu da farklı miyojenik belirteçlerin ekspresyonu ile paralellik gösterir. Pax7 sadece hücreler kendi kendini yenileyen kök hücrelerdir. Pax7 ve MyoD çift pozitif hücreler çoğalıyor.
Oysa myo D sadece hücreler hücreleri farklıleştiriyor. Kas kök hücrelerinin siRNA transfeksiyonu, verimli alımı gösteren granüler bir şekilde sitoplazmik siRNA birikimini gösterdi. Transfected Pax7 pozitif hücrelerinin myofiber başına nicelemesi, transfected hücre sayısının 30 saat sonra kas kök hücre sayıları üzerinde olumsuz bir etkisi olmadan% 74'e kadar arttığını ortaya koydu.
Bu protokolü denerken, herhangi bir hasara neden olmadan EDL'yi dikkatlice parçalamak son derece önemlidir. SiRNA transfeksiyona ek olarak, transgenik hayvanların analizi veya rekombinant proteinlerle inkübasyon, bitişik miyofiberlerindeki kas kök hücrelerinin daha işlevsel analizleri için mümkündür.
