Transgenik hayvanlar, canlı organizmalarda gen fonksiyonunun incelenmesine izin verdikleri için modern biyomedikal araştırmaların temelini atmaktadır. Hayvan çalışmalarında çeşitli genetik modifikasyon yöntemleri uygulanmıştır. Burada, lentiviral vektörleri bir sıçan embriyosunun genomuna transgen dahil etmek için bir araç olarak kullanan yaygın olarak erişilebilir ve etkili bir teknik salıyoruz.
Insan koryonik gonadotropin yönetiminden sonra, beş haftalık Wistar dişi sıçanları cinsel açıdan doğurgan üç ila 10 aylık Wistar erkekleriyle bire bir çiftleştirin. Sabah 8-10 .m. ertesi sabah, vajinal fiş varlığı için dişikontrol edin ve en geç 10 a.m tarafından bir miyeslik fişi ile dişilerden oviducts hasat.
önceden ısıtılmış M2 ortamı içeren bir toplama kabına dönüştürül. Tüm oviducts toplandığında, sığır testislerinden hyaluronidase mililitre başına 0.5 miligram ile takviye önceden ısıtılmış M2 orta içeren 35 milimetrelik bir çanak içine dokuları aktarın ve bir stereo mikroskop altında çanak yerleştirin. Oviduct duvarlarını açmak için ince forceps kullanın ve embriyolar serbest bırakılı kadar ampulla basın.
Embriyoların kümülüs hücrelerinden salınımını kolaylaştırmak için, ağızla çalışan bir aspiratör tüpüne bağlı cam transfer pipetini kullanarak embriyoları yavaşça yukarı ve aşağı pipetlendirin. Tüm embriyolar serbest bırakıldı, hyaluronidase ve hücresel enkaz kaldırmak için taze M2 orta birkaç kez hücreleri yıkayın. 60 milimetrelik bir çanak mineral yağ ile kaplı önceden dengeli M16 orta bireysel 50 mikrolitre damla içine embriyolar aktarın.
Daha sonra, enjeksiyonuna kadar %5 karbondioksit atmosferi olan nemlendirilmiş 37 derece lik bir inkübatöre çanak yerleştirin. Tek hücreli evre embriyoların zona pellucida altında lentiviral vektör mikroenjeksiyon için, bir filament ile mikroenjeksiyon borosilicate cam kılcal hazırlamak için bir pipet puller kullanın. Filament her değiştirildikten veya yeni bir cam kılcal damar kullanıldığından sonra, en uygun parametreleri ayarlamak için rampa testi çalıştırın.
Daha sonra, biyogüvenlik laminar akış başlığı altında mikroenjeksiyon pipet başına taze çözülmüş lentiviral çözelti yaklaşık iki mikrolitre yüklemek için bir mikroyükleyici ucu kullanın. 60 milimetrelik Petri kabından kapağın ortasına 100 mikrolitrelik m2 orta damlası ekleyin. Orta yı mineral yağ ile kaplayın ve tutma pipetini ve virüs yüklü mikroenjeksiyon kılcal damarını bir mikromanipülatöre monte edin.
Mikroenjeksiyon kabını ters bir mikroskop altına yerleştirin ve 15 ila 20 hücreli tek hücreli embriyoyu mikroenjeksiyon kabındaki M2 damlasına aktarın. Tutma pipet ile bir embriyo yakalamak ve virüs teslim edildikten sonra bir an için zona pellucida altında kapiller tutan perivitelline uzaya zona pellucida altında lentiviral çözelti enjekte etmek için 400 kez büyütme ve cam kapiller kullanın. Tüm embriyolar enjekte edildiğinde, enjekte edilen hücreleri kültür yemeğine geri döndürmek için ince bir pipet kullanın ve implantasyona kadar kabı hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.
Embriyo transferi için koruyucu anneler hazırlamak için, vazektomi erkekler ile cinsel olgun Sprague-Dawley kadın çiftleşmek ve vajinal fiş için ertesi sabah kadın kontrol edin. Uygun bir fiş ile anestezi kadınlarda pedal refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, hayvanın gözlerine merhem uygulamak ve her hayvanın arkasından kürk tıraş. Cerrahi bir mikroskop altında bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir yüzeye eğilimli pozisyonda ilk sıçan yerleştirin.
Alt sırt üzerinde kesilmiş küçük bir delik ile steril bir perde ile sıçan kapak ve lomber vertebral sütuna paralel yaklaşık iki santimetre lik deri kesi yapmak. Karın duvarında bir kesim yapmak ve bir yumurtalık yağ yastığı kavramak için forceps kullanmak için keskin makas kullanın. Yumurtalık ve oviduct%0.9 sodyum klorür gazlı bez batırılmış bir parça üzerine karın boşluğundan çekin.
Yük M2 orta, hava üç kabarcıklar, ve embriyolar bir transfer kılcal içine. Infundibulum ve ampulla arasında oviduct içine küçük bir kesi yapmak için mikroskarya kullanın ve kesi içine transfer pipet ucu ekleyin. Yavaşça oviduct içine embriyolar ve hava kabarcıkları dışarı, sonra karın boşluğuna geri üreme yolu yerleştirmek için künt forceps kullanın.
Poliglikolik asit emilebilir dikişler ile karın duvarı dikiş ve yara klipleri ile cilt kesi kapatın ve tam recumbency kadar izleme ile bir ısınma plaka üzerinde temiz bir kafes içinde hayvan yerleştirin. Potansiyel eşleri vazektomik etmek için, gösterildiği gibi ameliyat için erkek sıçan hazırladıktan sonra, testisler üzerinde cilt dezenfekte etmek için% 70 etanol ve cerrahi scrub kullanın. Yavaşça skrotal kese testisleri ortaya çıkarmak için karın basın ve cerrahi site üzerinde küçük bir delik ile steril bir perde ile sıçan kapağı ve kese ortasında 0,5 santimetrelik bir kesi yapmak için skrotal makas kullanın.
Dikkatle sola testis itin ve tek bir kan damarı ile beyaz bir kanal olarak testis ve orta hat arasındaki vas deferens bulmak. Vas deferens'i skrotal keseden yavaşça çıkarmak ve kabı forceps ile tutmak için saatçi nin püsyonu kullanın, kanaldan bir santimetrelik parçayı çıkarmak için ince makas kullanın. Sadece gösterildiği gibi ikinci testis için prosedürü tekrarlayın ve poliglikolik asit emilebilir dikişler ile cildi kapatın.
Sonra tam recumbency kadar izleme ile bir ısınma plaka üzerinde temiz bir kafes içine sıçan yerleştirin. Tek embriyoların birden fazla kez enjekte edildiği bu temsili deneyde, iki kez enjekte edilen embriyolardan sekiz sıçan doğdu ve bunlardan üçü transgeni taşıdığı doğrulandı. Kuruculardan biri transgeni yavrulara aktarmadı ve her deneysel kurulumiçin üç dişi kullanıldı.
Seçilen yaklaşım merkezi sinir sistemi boyunca bir organizatör nöronal sinaps kontrolü altında TDP-43-eGFP füzyon proteinifade istikrarlı transgenik sıçan hatları üretimi ne izin verdi. Lentivirus tabanlı transgenezis, kantitatif PCR'nin gösterdiği gibi transgenin tek bir kopya eklenmesiyle sonuçlandı. Bu yöntem diğer lentiviral vektörler için kullanıldığında yaklaşık %90 sağkalım oranı gözlendi.
Pronükleer enjeksiyonlardan kurtulan embriyoların yüzdesi önemli ölçüde daha düşüktü. Genel olarak, bu sonuçlar hamile kadın sıçanlar karşılaştırılabilir bir verimlilik ile koruyucu anne olarak kullanılabilir öneririz. Özellikle, mikroenjeksiyon bireysel turlar için analiz edilen sayısal veriler, implantasyonun etkinliğinin doğrudan bir embriyoya yapılan enjeksiyon sayısına ve dolaylı olarak viral yüke bağlı olduğunu göstermiştir.
Lentiviral vektörlerin kullanımı transgenin genomik entegrasyonunu ve iletimini garanti eder ve birden fazla subdermal enjeksiyon yapıldığında bile mikromanipüle edilen embriyoların yüksek sağkalım oranını kolaylaştırır. Bu prosedür diğer türlere etkili bir şekilde uygulanabilir ve konvansiyonel transgenez için bir alternatif olarak düşünülebilir.
