Ce travail est financé par R01 NS052532 (à HLH), la Fondation Moody, et le Département d&#39;anesthésiologie. Nous tenons à remercier Laurie Bolding, Christine Courteau Butler et Christy Perry pour leur aide à la rédaction, et Christy Perry pour la présentation et excellente production de toutes les figures, tableaux et objets d&#39;art.

1. Interventions chirurgicales et percussion fluide TBI <ol><li> Tous les expérimentations animales soient préalablement approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de l &#39;Université du Texas Medical Branch, Galveston, au Texas, et le National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (8e édition, Conseil national de recherches). </li><li> Des rats (mâles adultes Sprague-Dawley, 400-500 g obtenu auprès du fournisseur Charles Rivers, Portland, Maine) sont logés à deux par cage et fourni de la nourriture et de l&#39;eau ad libitum dans un vivarium avec ces conditions constantes: cycle de la lumière (600 h à 1800 h), la température (21 ° C à 23 ° C) et d&#39;humidité (40% à 50%) une semaine avant l&#39;utilisation. </li><li> Anesthésier les rats avec 4% d&#39;isoflurane, intuber et ventiler mécaniquement (NEMI scientifique; New England Medical Instruments, Medway, MA), les rats avec 1,5-2,0% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène: l&#39;air (70:30) et les préparer pour parasagittale percussion de fluide blessures, comme décrit précédemment. 8, 10 </li><li> Sacrifier les rats au point en temps opportun après la blessure selon le protocole expérimental. Enlever rapidement le cerveau, geler immédiatement sur de la glace sèche, et conserver à -80 ° C dans un tube de 50 ml ou passer immédiatement à intégrer dans l&#39;OCT pour la coupe congelée. </li></ol> 2. Coupe et coloration de cerveau de rat <ol><li> Le tissu cérébral qui n&#39;est pas utilisé immédiatement peuvent être conservés à -80 ° C pendant jusqu&#39;à un mois si elles sont conservées à une température constante. Cerveaux qui sont congelés à -80 ° C, puis décongelé à -20 ° C pour la coupe, puis recongelés ne donnent pas ARN de qualité après la décongélation seconde. Une fois que le cerveau est décongelé, monté dans un PTOM, et en coupe, les lames doivent être colorés dans les 24 heures et utilisé pour LCM dans les 30 minutes à une heure de coloration. Cela permettra d&#39;assurer l&#39;ARN de bonne qualité. Après LCM, les cellules capturées sur LCM bouchons peuvent être stockés dans un tampon de lyse à -80 ° C pendant une semaine, mais l&#39;ARN doit être isolé dans un temps opportun pour assurer la plus haute qualité. &lt;/ Li&gt; <li> Avant la coupe du cerveau, essuyez-le cryostat avec la RNase-Zap et nettoyer les pinceaux avec de l&#39;EtOH (remplacer la lame jetable entre chaque cerveau). </li><li> Récupérer le cerveau dans le tube de 50 ml à partir du congélateur à -80 ° C; placez-le dans le cryostat à une température de -22 ° C et de dégel dans le tube pendant environ 10 min. Enlever le cerveau du tube et le placer sur la scène sur de la gaze, face ventrale vers le haut. </li><li> En utilisant une lame de rasoir, coupez le cerveau pour enlever la partie postérieure du cerveau, juste rostrale du cervelet et de la partie antérieure du chiasma optique. Remplissez un cryomold par OCT milieu de montage (Tissue Tek), et placez le cerveau dans le moule avec la face antérieure vers le bas. Laissez le tissu cérébral de geler dans le support de montage jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne blanc (environ 10 min). </li><li> Geler la platine (Tissue Tek) sur le cerveau avec octobre Enlever le cerveau du moule. Insérez le cerveau dans la tête de l&#39;objet et serrez les vis. </li><li> Insérez un Disposable, lame à profil bas (Fisher Scientific) dans le porte-couteau et serrer le levier vers le bas. </li><li> Commencez à trancher le cerveau à 20 um pour enlever la couche externe de octobre Une fois que la région de l&#39;hippocampe est atteinte, réglez la molette de microns à 10. Recueillir des coupes coronales de série en plaçant une lame de verre ou de plus-lame de verre sur la coupe de tissu (Fisher Scientific). Les lames sont conservées à -20 ° C dans un support de coloration sans RNase jusqu&#39;à ce découpage est terminé. </li><li> Pour supprimer tous les RNases de la verrerie où des coupes de tissus sont traités, essuyez tous les contenants de coloration et des cylindres gradués avec ELIMINase (Fisher Scientific) et rincer à l&#39;eau Milli Q. Préparer toutes les solutions avec l&#39;eau sans RNase et filtrer le crésyl violet (Sigma-Aldrich) et de fluoro-Jade (Histo-chem) la tache avec un filtre de 0,2 um avant utilisation. </li><li> Décongeler des coupes de cerveau à température ambiante pendant 30 sec et le fixer à 75% (1 min) ETOH. </li><li> Pour PPCM de simples neurones lésés après la fixation, rincer les lames à l&#39;eau sans RNase (1 min), Contre-coloration au crésyl violet à 1% (15-20 sec), rincer à l&#39;eau sans RNase (2 x 30 sec), la tache avec Fluoro-Jade (4 min), rincer à l&#39;eau sans RNase (3 x 1 min), déshydrater avec de l&#39;EtOH 95% fabriqués à partir de l&#39;eau sans RNase (30 sec), 100% (30 sec) ETOH, et le xylène (2 x 3 min). </li><li> Pour PPCM de bandes de neurones après la fixation, rincer les lames à l&#39;eau sans RNase (1 min), de la teinture au crésyl violet à 1% (1 min), rincer à l&#39;eau sans RNase pour (3 x 1 min), déshydrater à 95% ETOH (2 x 30 sec), 100% ETOH (2 x 30 sec), et le xylène (2 x 3 min). </li><li> Sécher à l&#39;air toutes les sections sous une hotte pendant 15 min avant de LCM. Les lames peuvent être stockées côtés de section, jusqu&#39;à, dans une boîte à lames bordées de déshydratant, s&#39;ils doivent être transférés d&#39;une pièce à l&#39;. Cependant, les meilleurs résultats sont obtenus si LCM est effectué immédiatement après les sections sont secs. LCM doit être limitée de 30 min à 1 h. Dans la section suivante, nous décrivons d&#39;abord comment capturer des bandes continues de cellules, ce qui est easiest à maîtriser pour ceux qui apprennent cette technique. Ensuite, nous décrivons comment capturer précisément neurones isolés. Dans notre procédure, nous identifions les neurones meurent par leur affinité pour Fluoro-Jade-un marqueur des neurones en dégénérescence. Cellules Fluoro-Jade-négatifs sont présumés être neurones survivants. </li></ol> 3. Microdissection par capture laser (LCM) LCM des andains de populations enrichies de neurones de l&#39;hippocampe <ol><li> LCM est réalisée à l&#39;aide d&#39;un microscope PixCell IIe avec un laser diode infrarouge (Life Technologies). </li><li> Ajuster la manette de commande central pour la position verticale. Tourner et verrouiller l&#39;objectif 4X en position. </li><li> Placer une lame au centre de la platine du microscope et régler manuellement jusqu&#39;à ce que la région de l&#39;hippocampe est en vue. Utilisez des ajustements grossiers et fins de discussion pour amener l&#39;image au point. </li><li> Activez le mandrin à vide en appuyant sur le bouton vide sur le contrôleur. Tourner et verrouiller l&#39;objectif 10X plus en place. Concentrer à nouveau avec des ajustements grossiers et fins. </li><li> Chargez le CapSure Macro LCM bouchons (Life Technologies) dans le module cassette CapSure et la position d&#39;un bouchon à la position de la ligne de charge. Tournez le bras de placement Cap et la position autour du bouchon. Levez le bras de placement Cap d&#39;enlever le bouchon CapSure du module cassette. </li><li> Tournez le bras de placement Cap sur la lame et abaissez le bras vers le bas sur la lame, ce qui permettra de placer le bouchon sur la diapositive. Réglez la mise au point fine et déplacez le joystick pour vérifier si les cellules sont à l&#39;intérieur du cercle noir sur la coiffe. Toutes les captures cellulaires devraient être à l&#39;intérieur de ce cercle noir. </li><li> Définissez les paramètres du laser. Tout d&#39;abord, appuyez sur le bouton laser activer sur le contrôleur. Le spot laser cible sera visible comme un point rose dans le champ de vision sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. </li><li> Réglez la taille du spot laser pour petite (7,5 um) pour focaliser le laser et ajuster la puissance et la durée de 65 à 75 mW, pour 1.0 à 2.0 ms comme nécessaire à la capture cellulaire optimale. </li><li> Pour teer le laser, utilisez le joystick pour déplacer le point laser dans une zone où il n&#39;ya pas de cellules à ramasser. Tirer le laser à l&#39;aide du commutateur pouce. Utilisez le joystick pour déplacer le spot laser loin de l&#39;endroit polymère fondu et vérifier pour voir si un anneau visible sombre entoure un espace libre où le laser a été congédié. </li><li> Pour capturer les cellules, utilisez le joystick pour déplacer le spot laser sur la surface de cellules à capturer. Tirer le laser à l&#39;aide du commutateur pouce. Déplacer le levier de commande pendant le déclenchement du laser pour capturer une grande surface de cellules. Lorsque le laser est déclenché il fait fondre la pellicule de polymère thermoplastique sur le couvercle à la surface des cellules cibles. Le polymère absorbe le rayonnement laser, donc pas de modifier l&#39;ARN, de l&#39;ADN ou de la protéine assurant l&#39;intégrité de l&#39;échantillon pour les futures applications moléculaires. </li><li> Après avoir tiré toutes les cellules d&#39;intérêt, soulever le bras de placement Cap. Les cellules capturées va se séparer de la section de tissu et de respecter le plafond CapSure. Le tissu restant et les cellules manquantes seront visble dans le champ de vision. Les cellules de la coiffe peut être consultée en plaçant le capuchon sur une partie vide de la diapositive. </li><li> Soulevez le bras de placement Cap et le faire pivoter vers le Cap station de déchargement. Abaissez le bouchon dans la station et tourner le bras de placement Cap remettre dans sa position précédente. </li><li> Faites glisser l&#39;outil d&#39;insertion CapSure le long de la plate-forme et sur le capuchon. Soulevez l&#39;outil de la plate-forme. Le plafond restera attaché. Appuyez légèrement sur le bouchon pour le pad CapSure propre pour ôter les tissus indésirables. </li><li> Placez le bouchon dans un 0,5 ml sans RNase tube rempli de 100 ul de tampon de lyse obtenue à partir de la RNAqueous Micro-Isolation Kit. Immédiatement le bouchon vortex pendant 30 secondes pour lyser les cellules. Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 30 min et congeler à -80 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;isolement d&#39;ARN. </li></ol> PPCM de simples FJ + neurones dans l&#39;hippocampe <ol start="15"><li> Pour capturer des cellules individuelles, chargez CapSure HS LCM bouchons dans le module cassette CapSure et positisur une casquette à la position de la ligne de charge. Tournez le bras de placement Cap et le positionner autour du bouchon. Levez le bras de placement Cap d&#39;enlever le bouchon CapSure du module cassette. </li><li> Régler la taille du spot laser à petit (7,5 um) pour focaliser le laser et ajuster la puissance laser et de la durée de 65 mW -75 à 0,45 à 0,50 ms pour la capture cellulaire optimale de cellules uniques. </li><li> Faire tourner le bras de placement Cap sur le coulisseau et abaisser le bras vers le bas en direction de la lame. Cela permet de placer le bouchon sur la diapositive. Le capuchon CAPSURE HS surface est assise surélevée par rapport à l&#39;échantillon au cours de LCM. </li><li> Utilisez le joystick pour déplacer le laser sur simple FJ + cellules. Toutes les cellules sont capturés doivent être à l&#39;intérieur de la petite ceinture noir sur la coiffe. Tirer le laser à l&#39;aide du commutateur pouce. </li><li> Lorsque toutes les cellules de la zone de cercle noir ont été tirés avec le laser, soulever le bras de placement Cap. Les cellules capturées se séparer de la section de tissu et d&#39;adhérer à la coiffe CapSure HS. </li><li> Placez un autre diaporama sur les microsface scène et recueillir FJ + cellules jusqu&#39;à ce que le bouchon HS est pleine. Placez le bouchon dans un 0,5 ml sans RNase tube rempli avec 40-50 ul de tampon de lyse. Immédiatement le bouchon vortex pendant 30 secondes pour lyser les cellules. Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 30 min et congeler à -80 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;isolement d&#39;ARN. </li></ol> 4. Isolation d&#39;ARN total à partir d&#39;échantillons LCM (Cette section sera simplement décrit dans la vidéo de présentation) <ol><li> L&#39;ARN total de cellules est isolé en utilisant le kit de RNAqueous-Micro (Ambion) suivant les protocoles du fabricant. Tous les réactifs et solutions de lavage sont fournis dans ce kit. Mouillage préalable du micro filtre cartouche en ajoutant 30 pl de tampon de lyse à la solution de filtration. Après 5 min, centrifuger le filtre pendant 30 sec à 10.000 x g. </li><li> Ajouter 3 pi d&#39;additif LCM au lysat d&#39;échantillon, une pipette pour mélanger et centrifuger. </li><li> Ajouter 52 ul de 100% (1/2 volume) ETOH au lysat d&#39;échantillon; pipette pour mélanger et transférer le lysat sur le filtrecolonne. </li><li> Centrifuger la colonne de filtration à 10.000 x g pendant 1 min à lier l&#39;ARN de la colonne. Si il ya des bouchons multiples pour un seul échantillon, tourner chaque lysat à travers la même colonne séparément. </li><li> Effectuez la procédure d&#39;isolement d&#39;ARN comme décrit dans le kit RNAqueous Micro. </li><li> Effectuer un traitement DNase et l&#39;inactivation de DNase des échantillons d&#39;ARN LCM telles que décrites dans le kit, transférer les ARN dans un tube RNase-free et conserver à -80 ° C. </li></ol> 5. La quantification de l&#39;ARN et des applications en aval Évaluation de la qualité de l&#39;ARN et la quantification est réalisée avec un bioanalyseur Agilent en utilisant des réactifs du kit Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) selon le protocole du fabricant. <ol><li> L&#39;ARN total est analysé sur un bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies). Le logiciel évalue la concentration et l&#39;intégrité de l&#39;échantillon d&#39;ARN en affectant un numéro d&#39;intégrité de l&#39;ARN (RIN) de chaque échantillon allant fROM 1 à 10. 1-5 indique ARN dégradé et 7-10 indique l&#39;ARN de bonne qualité. </li><li> Non dégradés ARN intact sera utilisé pour PCR en temps réel; essais Taqman individuels ou RT2 tableaux profileur en utilisant Sybr-chimie verte. L&#39;ARN peuvent aussi être utilisés pour l&#39;analyse de puce à ADN et d&#39;ARNm analyse par microréseau microRNA. </li></ol>

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	<li>Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medial+temporal+lobe.">The medial temporal lobe.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).</li><li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function:+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior.">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li><li>Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+networks+to+brain+networks.">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li><li>Schouten, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+in+traumatic+brain+injury:+a+complex+struggle+against+the+biology+of+nature.">Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature.</a> Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).</li><li>Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+a+novel+fluorochrome+for+the+sensitive+and+reliable+histochemical+localization+of+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration.</a> Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).</li><li>Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade+and+silver+methods:+application+to+the+neuropathology+of+scrapie,+a+transmissible+spongiform+encephalopathy.">Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).</li><li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Fluid+Percussion:+Model+of+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice.">Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice.</a> J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+long-term+gene+expression+in+neurons+of+the+hippocampal+subfields+following+traumatic+brain+injury+in+rats.">Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats.</a> Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).</li><li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice.">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).</li><li>Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons.">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li><li>Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury.">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).</li><li>Elstner, M., Morris, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson's+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death.">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li><li>Chen, H., Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Profiling+of+Nucleus+Accumbens+Neurons+Projecting+to+Ventral+Pallidum+Using+both+Microarray+and+Transcriptome+Sequencing.">Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing.</a> Front. Neurosci. 5, 98 (2011).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons,+numbers+and+the+hippocampal+network.">Neurons, numbers and the hippocampal network.</a> Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).</li><li>Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+long-term+treatment+with+L-deprenyl+on+the+age-dependent+microanatomical+changes+in+the+rat+hippocampus.">Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus.</a> Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).</li><li>Schmued, L. C., Hopkins, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+novel+fluorochromes+for+detecting+toxicant-induced+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration.</a> Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).</li><li>Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+use+of+laser+capture+microdissection+to+selectively+obtain+distinct+populations+of+cells+for+proteomic+analysis--+preliminary+findings.">The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings.</a> Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).</li><li>Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunostained+frozen+sections+for+mRNA+analysis.">Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis.</a> Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).</li></ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêt.

Cette technique LCM nous a permis de réaliser des progrès importants dans la compréhension des mécanismes moléculaires de la TCC. 8,10,11,12,13 Nous étions les premiers chercheurs d&#39;utiliser cette technique pour démontrer que les sous-régions distinctes de l&#39;hippocampe du rat ont des profils d&#39;expression des gènes qui en corrélation avec leur vulnérabilité sélective des blessures. Nos études ont montré que l&#39;on pouvait quantifier l&#39;expression des gènes, par qPCR, d&#39;aussi peu que 10 cellules laser capturés et que nous pourrions effectuer une analyse de puces à ADN du génome entier d&#39;aussi peu que 600 cellules capturées. LCM serait un outil précieux dans des études similaires de d&#39;autres régions cérébrales qui sont connus pour être impliqués dans divers troubles neurologiques et neuropsychiatriques. Par exemple, des études utilisant LCM ont mis en lumière dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson dans les neurones dopaminergiques de la substance noire, 14 et aidé études de profilage du génome entier du noyau accumbens, qui est impliqué dans les circuits de récompense impliqués dans stroubles d&#39;abus ubstance. 15 Hétérogénéité des neurones se traduit au niveau du génome 16 et peut contribuer au manque de succès des traitements expérimentaux pour TBI dans les essais cliniques. Ainsi, notre but est d&#39;utiliser cette technique pour étudier les éléments critiques qui influencent la survie des neurones après un traumatisme cérébral. Notre récente étude profilage du génome entier de la mort et à proximité survivant neurones de l&#39;hippocampe après TBI suggéré qu&#39;un rhéostat cellulaire qui reflète le rapport entre les niveaux d&#39;expression de la survie des cellules aux gènes de mort cellulaire régule le destin des cellules après un traumatisme cérébral. Ces études en cours contribuera à la conception et au développement de stratégies pharmacothérapeutiques qui peuvent influencer positivement le rhéostat la survie cellulaire. En outre, nous utilisons actuellement LCM pour suivre et surveiller les effets potentiels des traitements médicamenteux thérapeutiques dans des neurones d&#39;hippocampe après un traumatisme cérébral. Ainsi, nos études démontrent que les données soigneusement les techniques de manipulation sans RNase et certainsmodifications des protocoles existants, il est possible d&#39;obtenir de haute qualité des échantillons d&#39;ARN à partir de LCM pour l&#39;analyse précise de l&#39;expression génique quantitative. Cependant, il existe quelques pièges liés aux techniques de LCM. Par exemple, collecter seulement les cellules neuronales sans aucune contamination microglie peut être presque impossible. Dans la couche des cellules pyramidales de l&#39;hippocampe, il a été estimé que 95% des cellules sont des neurones avec 90% de cette population d&#39;être des cellules pyramidales et des interneurones 10%, laissant un petit pourcentage de types de cellules gliales et les autres. 8,17, 18 Dans nos études, nous utilisons Fluoro-Jade un colorant fluorescent qui marque spécifiquement seuls neurones lésés dans le tissu cérébral. Une tache différente qui est un marqueur pour la GFAP serait nécessaire pour colorer les cellules microgliales 19. Collecte uniquement les fluoro-jade teinté simples corps neuronaux assure une population plus homogène de neurones. Un autre problème commun qui peut exiger de dépannage est que le cercle n&#39;est past définie lorsque le laser est déclenché. Si cela se produit, il est nécessaire de vérifier les paramètres du laser et ajuster la puissance et la durée si nécessaire. En outre, il est important de s&#39;assurer que le bouchon est posé à plat sur le tissu et bien placé sur le bras. Se référant au manuel LCM technique ou appeler l&#39;assistance technique sera parfois nécessaire. Après LCM et l&#39;isolement d&#39;ARN, la qualité de l&#39;ARN doit toujours être évaluée à l&#39;aide d&#39;un bioanalyseur avant toute analyse de l&#39;expression génique. Il existe plusieurs types d&#39;instruments de capture laser actuellement disponibles sur le marché, y compris la découpe laser (Life Technologies, Leica Microsystems) et laser catapultant (Zeiss) les instruments. Notre système LCM fonctionne bien pour la capture de petits nombres de cellules. D&#39;autres systèmes à haut débit et plus automatisée peut être plus appropriée pour l&#39;obtention d&#39;un plus grand nombre de cellules pour l&#39;analyse génomique et protéomique en particulier. En effet, LCM utilisation de ces systèmes automatisés a un grand potentiel pour l&#39;analyse des protein expression dans des cellules ou des populations identifiées enrichies de cellules. 20 En outre, LCM peuvent faciliter l&#39;analyse d&#39;expression génique de cellules immunomarquées, 21 ce qui nous permet d&#39;étudier l&#39;expression des gènes dans des types cellulaires définies indépendamment de la complexité dans les tissus les plus hétérogènes. Ainsi, LCM est un excellent outil pour les études de pointe moléculaires des populations isolées ou enrichie de cellules.

Analyse de l&#39;expression génique des tissus hétérogènes a toujours été problématique,. Ceci est particulièrement vrai dans le cerveau des mammifères, qui a environ 5.000 différents types de cellules 4 Avant le développement de la microdissection par capture laser (LCM) technique, les études génomiques sur les effets des TBI in vivo ont été basées sur l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes dans une population mixte de cellules cérébrales comprenait non seulement des différents types de cellules neuronales, mais aussi de soutenir les cellules gliales et immunomodulatrices. Les complexes résultant profils d&#39;expression génique obtenus à partir de ces tissus hétérogènes et souvent contradictoires les motifs de blessures provoquées par des signaux cellulaires, peut-être une explication de l&#39;échec des essais cliniques humains de stratégies thérapeutiques avérées efficaces dans des études précliniques de TBI 5. Pour obtenir une compréhension claire de l&#39;expression génique induite par des blessures chez les populations vulnérables des neurones de la hanche chez le ratcampe, nous avons adopté la technique de la LCM, la première fois par Emmert-Buck et al. 3 Par la suite, nous avons modifié et optimisé cette technique de microdissection par capture efficace des populations enrichies de neurones et les neurones simples pour le profilage de l&#39;ARNm en utilisant quantitative PCR en temps réel et l&#39;analyse des microréseaux . Pour maintenir l&#39;intégrité de l&#39;ARNm dans des coupes congelées de tissus cérébraux pour l&#39;analyse génomique, nous avons modifié les protocoles existants pour la fixation, la coloration et la capture rapide des neurones à partir de surgelés sections de cerveau de rat. Pour l&#39;identification et l&#39;isolement des blessés et des mourants neurones de l&#39;hippocampe, nous avons également optimisé la technique de coloration Fluoro-Jade pour LCM. Fluoro-Jade ne distingue pas entre la mort cellulaire par apoptose et nécrose. Ainsi, tous les types de neurones qui dégénèrent peuvent être détectés par cette tache. 6,7 Ici, nous décrivons le protocole utilisé dans notre laboratoire pour obtenir des pools de neurones qui meurent ou survivent simples ainsi que des andains de enrichie populations de types distincts de cellules neuronales (c.-à-CA1-CA3 neurones pour l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes après TBI). La procédure en cas de blessure du cerveau percussion fluide réalisée dans notre laboratoire est décrite en détail dans Shimamura et al., 8 et est très similaire au protocole blessures par percussion de fluide latérale pour souris publiées dans JoVE par Alder et al. 9 Depuis la technique LCM a été démontré qu&#39;ils ont un effet minime ou nul sur l&#39;intégrité de l&#39;ADN, de l&#39;ARN et des protéines dans les tissus, il s&#39;agit d&#39;un excellent outil pour l&#39;analyse moléculaire et de protéines de types de cellules définies.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PixCell IIe Laser Capture Microscope</td>
 <td>Life Technologies (Arcturus)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAqueous Micro- Kit</td>
 <td>Life Technologies (Ambion)</td>
 <td>AM1931 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capsure LCM caps</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>LCM0211/LCM0214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoro-Jade</td>
 <td>Histo-chem Inc.</td>
 <td>#1FJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cresyl Violet Acetate</td>
 <td>Sigma-aldrich</td>
 <td>C5042-10G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene (Histological grade)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>X3P-1GAL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
 <td>UTMB pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free barrier pipette tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> 
 <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> 
 <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica DM6000 B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury

À long terme des troubles cognitifs après TBI est associé à des lésions neurodégénérescence induite dans l&#39;hippocampe, une région du lobe temporal qui est essentiel pour l&#39;apprentissage, la mémoire et les fonctions exécutives. 1,2 D&#39;où nos études se concentrent sur ​​l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes des neurones spécifiques populations dans les sous-régions distinctes de l&#39;hippocampe. La technique de microdissection par capture laser (LCM), introduit en 1996 par Emmert-Buck et al., 3 a permis des avancées significatives dans l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes des cellules individuelles et enrichi des populations de cellules provenant de tissus hétérogènes tels que le cerveau des mammifères qui contient des milliers de types de cellules fonctionnelles. 4 Nous utilisons LCM et un modèle de rat bien établie d&#39;une lésion cérébrale traumatique (TBI) pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie de TBI. Suite à percussion de fluide TBI, les cerveaux sont prélevés à des heures prédéterminées après la lésion, immédiatement congelés sur glace sèche,et préparé pour la coupe dans un cryostat. Les cerveaux de rats peut être intégré dans un PTOM et sectionné immédiatement ou stocké pendant plusieurs mois à -80 ° C avant la coupe pour la microdissection par capture laser. En outre, nous utilisons LCM pour étudier les effets de la TCC sur les rythmes circadiens. Pour cela, nous capturons neurones du noyau suprachiasmatique qui contiennent l&#39;horloge maître du cerveau des mammifères. Ici, nous démontrons l&#39;utilisation de LCM pour obtenir simples neurones identifiés (blessés et dégénérer, Fluoro-Jade-positive, ou indemne, Fluoro-Jade-négatif) et des populations enrichies de neurones de l&#39;hippocampe pour l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes ultérieure par PCR en temps réel et / ou puces à ADN du génome entier. Ces études LCM-compatibles ont révélé que la vulnérabilité sélective des régions anatomiquement distincts de l&#39;hippocampe du rat sont reflétées dans les différents profils d&#39;expression des gènes de différentes populations de neurones obtenus par LCM à partir de ces régions distinctes. Les résultats de nos études unicellulaires, le casl&#39;on compare les profils transcriptionnels de mourir et à proximité survivant neurones de l&#39;hippocampe, suggèrent l&#39;existence d&#39;un rhéostat la survie des cellules qui régule la mort cellulaire et la survie après un traumatisme cérébral.

Dans notre étude LCM première fois, nous avons pu montrer que les sous-régions fonctionnellement distinctes (CA1 et CA3) de l&#39;hippocampe du rat ont des profils d&#39;expression des gènes qui reflètent leur vulnérabilité aux TBI. 8 Figure 1A-1C montre la capture laser de neurones pyramidaux hippocampiques (CA1- CA3), les neurones gyrus denté et les neurones du RCS avant et après LCM. Nettoyer les captures d&#39;pyramidale, granulés ou neurones du RCS, respectivement, sont présentés sur les chapeaux de macro. Figure 2A-2B illustre mourant, Fluoro-Jade positifs neurones pyramidaux et survivre, Fluoro-Jade négatifs neurones pyramidaux avant et après LCM. La capture de la propre mort ou neurones survivants est montré en visualisant les cellules capturées sur les chapeaux de LCM. Après LCM, l&#39;ARN total peut être utilisé pour un large éventail d&#39;études moléculaires, y compris quantitative en temps réel l&#39;analyse de l&#39;expression génique par PCR TaqMan ou SYBR en utilisant des chimies vertes (figure 3A), petite focused tableaux PCR avec des sondes SYBR green (figure 3B) ou l&#39;ensemble du génome (biopuces études Figure 3C). <img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figure 1. Microdissection par capture laser des andains de populations cellulaires définies à partir du cerveau de rat. Surgelées 10 sections um coronales de cerveau de rat sont fixés dans l&#39;éthanol, colorées avec un colorant de Nissl (crésyl violet) et préparé pour LCM. Montré des photos de l&#39;hippocampe du rat et de noyau suprachiasmatique avant et après les neurones A. LCM et les cellules capturées comme visualisées sur les chapeaux de macro. Pyramidales de CA1 les sous-champs-CA3 de l&#39;hippocampe du rat. Cellules granulaires du gyrus B. hippocampe denté. C. bilatérale suprachiasmatique noyaux situés de chaque côté du troisième ventriculeet située au-dessus du chiasma optique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figure 2. Microdissection par capture laser de neurones isolés de l&#39;hippocampe du rat. Montré sont en dégénérescence A., Fluoro-Jade-positifs (teinté) CA3 hippocampiques neurones et B. Surviving, Fluoro-Jade-négatif (non coloré) CA3 neurones avant et après LCM. Cellules capturées sont visualisés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3. Analyse de l&#39;expression du gène de l&#39;ARN total isolé à partir de neurones laser capturés. A. quantitatives en temps réel les données de PCR de l&#39;expression du gène horloge circadienne dans les SCN. Heatmap B. de l&#39;expression génique dans la mort et la survie des neurones d&#39;hippocampe montrant l&#39;expression de gènes liés à l&#39;apoptose en utilisant des tableaux axés PCR . C. Agilent microarray génome entier de l&#39;expression génique dans l&#39;hippocampe CA1-CA3 neurones de rats qui ont reçu des blessures imposture, ou TCC TCC, plus un virus siARN adéno-associé recombinant destiné à l&#39;expression de gènes knockdown induite par une lésion cérébrale (oxyde nitrique neuronal synthase et la glutathion peroxydase-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Nous décrivons comment utiliser la microdissection par capture laser (LCM) pour obtenir des populations enrichies de neurones de l&#39;hippocampe ou des neurones simples de coupes congelées de cerveau de rat blessé pour l&#39;analyse d&#39;expression génique ultérieure à l&#39;aide quantitative PCR en temps réel et / ou puces à ADN du génome entier.

Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l&#39;analyse d&#39;expression génique après un traumatisme crânien

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.1K vues.  University of Texas Medical Branch. Nous décrivons comment utiliser la microdissection par capture laser (LCM) pour obtenir des populations enrichies de neurones de l'hippocampe ou des neurones simples de coupes congelées de cerveau de rat blessé pour l'analyse d'expression génique ultérieure à l'aide quantitative PCR en temps réel et / ou puces à ADN du génome entier.

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Recherche

Neurosciences

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isoler les cellules souches nasal olfactif des rongeurs ou des êtres humains

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Production d’ARN pour l’analyse transcriptomique à partir de corps cellulaires de motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurones olfactifs obtenus à l&#39;aide biopsie nasale combinée avec laser-Microdissection: Une approche potentielle pour étudier la réponse au traitement dans les troubles mentaux

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Microdissection laser - une démonstration de l&#39;isolement de la dopamine neurones individuels et de l&#39;Espace ventrale tegmentale entière

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Analyse des modifications d&#39;expression génique dans l&#39;hippocampe de rat après stimulation cérébrale profonde de l&#39;antérieur thalamique Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.