Questo lavoro è finanziato da R01 NS052532 (a HLH), la Fondazione Moody, e il Dipartimento di Anestesiologia. Ringraziamo Laurie Bolding, Christine Courteau Butler e Christy Perry per la loro assistenza editoriale, e Christy Perry per il layout e la produzione eccellente di tutte le tabelle, figure e opere d&#39;arte.

1. Procedure chirurgiche e Percussioni Fluid TBI <ol><li> Tutti gli esperimenti sugli animali vengono prima approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas e il National Institutes of Health Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (8 ° Edizione, Consiglio Nazionale delle Ricerche). </li><li> I ratti (maschi adulti Sprague-Dawley, 400-500 gr ottenuto dal fornitore Rivers Charles, Portland, Maine) sono alloggiati due per gabbia e ha fornito cibo e acqua ad libitum in un vivaio con queste condizioni costanti: ciclo di luce (600 ore a 1.800 hr), temperatura (21 ° C a 23 ° C) e umidità (40% al 50%) una settimana prima dell&#39;uso. </li><li> Anestetizzare ratti con il 4% isoflurano, intubate, e meccanicamente ventilare (NEMI scientifico, New England Medical Instruments, Medway, MA) i ratti con 1,5-2,0% isoflurano in ossigeno: aria (70:30) e li prepara per parasagittale fluido percussioni lesioni, come precedentemente descritto. 8, 10 </li><li> Sacrificare ratti al punto di tempo appropriato dopo lesione seconda del disegno sperimentale. Rimuovere rapidamente il cervello, congelare immediatamente in ghiaccio secco, e conservare a -80 ° C in un tubo da 50 ml o procedere immediatamente da incorporare nel PTOM per sezionamento congelati. </li></ol> 2. Sezionamento e colorazione di cervello di ratto <ol><li> Tessuto cerebrale che non viene utilizzato immediatamente possono essere conservati a -80 ° C fino ad un mese se mantenuta ad una temperatura costante. I cervelli che vengono congelati a -80 ° C, poi scongelati a -20 ° C per il sezionamento, e poi ri-congelati non danno RNA di qualità dopo lo scongelamento secondo. Una volta che il cervello è scongelato, montato in OCT e sezionata, vetrini devono essere colorati entro 24 ore e utilizzati per LCM entro 30 minuti ad un&#39;ora di colorazione. Ciò garantirà RNA di buona qualità. A seguito di LCM, cellule catturate su tappi LCM possono essere memorizzati in un tampone di lisi a -80 ° C per un massimo di una settimana, ma l&#39;RNA devono essere isolati in modo tempestivo per garantire la massima qualità. &lt;/ Li&gt; <li> Prima di sezionare il cervello, pulire il criostato con RNasi-Zap e pulire le spazzole con EtOH (sostituire la lama usa e getta tra ogni cervello). </li><li> Recuperare il cervello nel tubo 50 ml dal congelatore a -80 ° C; posizionarlo nel criostato ad una temperatura di -22 ° C e scongelare nel tubo per circa 10 min. Rimuovere il cervello dal tubo e il luogo sul palco su garza, lato ventrale in alto. </li><li> Usando una lama di rasoio, la fetta di cervello per rimuovere la parte posteriore del cervello appena rostrale al cervelletto e la porzione anteriore al chiasma ottico. Riempire un cryomold con il mezzo di montaggio ottobre (Tissue Tek), e inserire il cervello nello stampo con la parte anteriore verso il basso. Lasciare che il tessuto cerebrale di congelare nel liquido di montaggio fino a che non diventa bianco (circa 10 min). </li><li> Congelare il disco di preparato (Tissue Tek) sul cervello con ottobre Rimuovere il cervello dallo stampo. Inserire il cervello nella testa del preparato e serrare le viti. </li><li> Inserire un Disposabile, lama a basso profilo (Fisher Scientific) nel porta-lama e serrare la leva verso il basso. </li><li> Iniziare il taglio del cervello a 20 micron per rimuovere lo strato esterno di ottobre Una volta che la regione ippocampale è raggiunta, posizionare il selettore a 10 micron. Raccogliere coronali sezioni seriali mettendo un vetrino o plus-vetrini sulla sezione di tessuto (Fisher Scientific). Vetrini vengono conservati a -20 ° C in un RNase-free cremagliera colorazione fino sezionamento è completa. </li><li> Per rimuovere tutte le RNasi dal vetro in cui sono trattati sezioni di tessuto, pulire tutti i contenitori di colorazione e cilindri graduati con ELIMINase (Fisher Scientific) e sciacquare con acqua Milli-Q. Preparare tutte le soluzioni con acqua priva di RNasi e filtrare il violetto cresolo (Sigma-Aldrich) e Fluoro-Jade (Histo-chem) macchia con un 0,2 micron filtro prima dell&#39;uso. </li><li> Scongelare sezioni di cervello a temperatura ambiente per 30 sec e fissare in% ETOH 75 (1 min). </li><li> Per LCM di singoli neuroni danneggiati dopo la fissazione, sciacquare i vetrini in acqua RNase-free (1 min), Di contrasto con 1% di violetto cresolo (15-20 sec), sciacquare in acqua priva di RNasi (2 × 30 sec), macchia con Fluoro-Jade (4 min), sciacquare in acqua priva di RNasi (3 × 1 min), Disidratare con 95% EtOH fatto da acqua priva di RNasi (30 sec), 100% EtOH (30 sec), e xilene (2 × 3 min). </li><li> Per LCM di andane di neuroni dopo la fissazione, sciacquare i vetrini in acqua RNase-free (1 min), macchia con 1% di violetto cresolo (1 min), sciacquare in acqua priva di RNasi per (3 × 1 min), disidratazione con il 95% ETOH (2 × 30 sec), 100% EtOH (2 × 30 sec), e xilene (2 × 3 min). </li><li> Asciugare tutte le sezioni in una cappa di aspirazione per 15 minuti prima di LCM. I vetrini possono essere conservati, i lati di sezione fino, in una scatola rivestita di disseccante, se hanno bisogno di essere trasferiti da una stanza all&#39;altra. Tuttavia, i migliori risultati si ottengono se LCM viene eseguito immediatamente dopo sezioni sono secche. LCM dovrebbe essere limitata da 30 minuti a 1 ora. Nella prossima sezione, si descrive prima come catturare andane continue di cellule, che è eaSiest da padroneggiare per coloro che stanno imparando questa tecnica. Poi si descrive come catturare con precisione singoli neuroni. Nella nostra procedura, identifichiamo i neuroni che muoiono per la loro affinità per Fluoro-Jade-un marcatore di neuroni in degenerazione. Cellule Fluoro-Jade-negativi si presume essere sopravvissuto neuroni. </li></ol> 3. Microdissezione Laser Capture (LCM) LCM di andane di popolazioni arricchite di neuroni ippocampali <ol><li> LCM viene eseguita utilizzando un microscopio PixCell IIe con un laser a diodo ad infrarossi (Life Technologies). </li><li> Regolare il joystick al centro in posizione verticale. Ruotare e bloccare l&#39;obiettivo 4X in posizione. </li><li> Collocare una diapositiva al centro del portaoggetti e regolare manualmente fino alla regione dell&#39;ippocampo è in vista. Utilizzare regolazione del fuoco grossolana e fine per portare l&#39;immagine a fuoco. </li><li> Attivare la morsa a vuoto premendo il pulsante vuoto sul controller. Ruotare e bloccare l&#39;obiettivo 10X in place. Messa a fuoco ancora una volta con regolazioni grossolane e fini. </li><li> Caricare il CapSure Macro LCM tappi (Life Technologies) nel modulo cassetta CapSure e posizionare un tappo nella posizione della linea di carico. Ruotare il braccio di posizionamento Cap e posizione intorno al tappo. Sollevare il braccio del Collocamento Cap per rimuovere il tappo CapSure dal modulo cassetta. </li><li> Ruotare il braccio di posizionamento Cap sul vetrino e abbassare il braccio verso il basso sul vetrino, questo mettere il tappo sulla diapositiva. Regolare la messa a fuoco micrometrica e muovere il joystick per verificare se le cellule sono all&#39;interno del cerchio nero sul tappo. Tutte le catture cellule dovrebbero essere all&#39;interno di questo cerchio nero. </li><li> Impostare i parametri laser. In primo luogo, premere il pulsante di abilitazione laser sul controller. Lo spot laser bersaglio sarà visibile come un punto rosa nel campo visivo sul monitor del computer. </li><li> Impostare la dimensione dello spot laser a piccole (7,5 micron) per mettere a fuoco il laser e regolare la potenza e la durata a 65 - 75 mW, per 1,0-2,0 msec come necessario per la cattura cellulare ottimale. </li><li> Per test il laser, utilizzare il joystick per spostare il punto laser in una zona dove non ci sono le cellule a raccogliere. Fuoco il laser con l&#39;interruttore pollice. Utilizzare il joystick per spostare il punto laser di distanza dal punto polimero fuso e controllare per vedere se un anello scuro visibile circonda uno spazio libero in cui è stato sparato il laser. </li><li> Per catturare celle, utilizzare il joystick per spostare il punto laser sulla superficie di cellule di catturare. Fuoco il laser con l&#39;interruttore pollice. Spostare il joystick mentre si aziona il laser per catturare una grande area di celle. Quando il laser viene sparato scioglie il film di polimero termoplastico sul tappo alla superficie delle cellule bersaglio. Il polimero assorbe la radiazione laser, quindi non alterando l&#39;, DNA RNA o proteina garantire l&#39;integrità del campione per future applicazioni molecolari. </li><li> Dopo la cottura tutte le cellule di interesse, sollevare il braccio di posizionamento Cap. Le cellule raccolte si separerà dal sezione di tessuto e aderire al tappo CapSure. Il tessuto residuo e le cellule mancanti saranno visbile nel campo di vista. Le cellule del tappo può anche essere visualizzato posizionando il tappo su una parte vuota della diapositiva. </li><li> Sollevare il braccio di posizionamento Cap e ruotarla per Scaricare il Cap stazione. Abbassare il coperchio nella stazione e ruotare il braccio di posizionamento Cap nella sua posizione precedente. </li><li> Far scorrere lo strumento CapSure inserimento lungo la piattaforma e sul cappuccio. Sollevare lo strumento dalla piattaforma. Il tappo resterà attaccato. Toccare leggermente il tappo al pad CapSure pulito per pulire via i tessuti indesiderati. </li><li> Mettere il tappo in un ml 0.5 RNasi-free tubo riempito con 100 ml di tampone di lisi ottenuto dalla RNAqueous Micro-Kit di isolamento. Immediatamente vortex il tappo per 30 sec per lisare le cellule. Incubare i campioni a 42 ° C per 30 min e congelare a -80 ° C fino isolamento dell&#39;RNA. </li></ol> LCM di singoli FJ + neuroni nell&#39;ippocampo <ol start="15"><li> Per catturare singole cellule, caricare CapSure HS LCM tappi nel modulo cassetto CapSure e positisu un tappo nella posizione della linea di carico. Ruotare il braccio di posizionamento Cap e posizionarla intorno al tappo. Sollevare il braccio del Collocamento Cap per rimuovere il tappo CapSure dal modulo cassetta. </li><li> Impostare la dimensione dello spot laser a piccole (7,5 micron) per mettere a fuoco il laser e regolare la potenza del laser e la durata di 65 -75 mW per 0,45-0,50 msec per la cattura cellulare ottimale di cellule singole. </li><li> Ruotare il braccio di posizionamento Cap sul vetrino e abbassare il braccio verso il vetrino. Questo metterà il cappuccio sulla diapositiva. Il CAPSURE HS superficie della calotta si siede elevato dal campione durante il LCM. </li><li> Utilizzare il joystick per spostare il laser su singoli FJ + cellule. Tutte le cellule di essere catturati devono essere all&#39;interno del piccolo anello nero sul tappo. Fuoco il laser con l&#39;interruttore pollice. </li><li> Quando tutte le celle all&#39;interno dell&#39;area cerchio nero sono stati sparati con il laser, sollevare il braccio di posizionamento Cap. Le cellule catturate separerà dalla sezione di tessuto e aderire alla HS CapSure tappo. </li><li> Posizionare un altro vetrino sul Microsfar fronte palco e raccogliere FJ + cellule fino a quando il tappo HS è pieno. Mettere il tappo in un ml 0.5 RNasi-free tubo riempito con 40-50 ml di tampone di lisi. Immediatamente vortex il tappo per 30 sec per lisare le cellule. Incubare i campioni a 42 ° C per 30 min e congelare a -80 ° C fino isolamento dell&#39;RNA. </li></ol> 4. Totale isolamento di RNA da campioni di LCM (Questa sezione sarà solo essere descritta nel video di presentazione) <ol><li> RNA totale da cellule viene isolato impiegando la RNAqueous Micro-Kit (Ambion) seguendo i protocolli del produttore. Tutti i reagenti e le soluzioni di lavaggio sono forniti in questo kit. Pre-bagnato del microfiltro cartuccia aggiungendo 30 pl di tampone di lisi soluzione al filtro. Dopo 5 min, centrifugare il filtro per 30 sec a 10.000 × g. </li><li> Aggiungere 3 ml di additivo LCM al lisato campione, pipetta per mescolare e centrifugare. </li><li> Aggiungere 52 ml di ETOH 100% (1/2 volume) al lisato campione; pipetta per mescolare, e trasferire il lisato al filtrocolonna. </li><li> Centrifugare la colonna filtro a 10.000 g per 1 min per legare l&#39;RNA alla colonna. Se ci sono tappi multiple per un campione, ruotare ciascun lisato attraverso la colonna stessa separatamente. </li><li> Completare la procedura di isolamento di RNA come descritto nel kit RNAqueous Micro. </li><li> Eseguire DNasi trattamento e inattivazione di DNasi LCM campioni di RNA, come descritto nel kit, trasferire l&#39;RNA a una RNasi-free tubo e conservare a -80 ° C. </li></ol> 5. Quantificazione RNA e applicazioni a valle Valutazione della qualità dell&#39;RNA e la quantificazione viene eseguita con un Bioanalyzer Agilent utilizzando reagenti del kit di Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) seguendo il protocollo del produttore. <ol><li> RNA totale è analizzato su un Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies). Il software valuta la concentrazione e l&#39;integrità del campione RNA assegnando un numero integrità dell&#39;RNA (RIN) di ciascun campione f vannorom 1 a 10. 1-5 indica RNA degradate e 7-10 indica RNA di buona qualità. </li><li> RNA intatto non degradati saranno utilizzati per Real-Time PCR, singoli saggi TaqMan o RT2 array profiler con Sybr-chimica verde. L&#39;RNA può essere utilizzato anche per l&#39;analisi microarray mRNA e microRNA microarray. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Questa tecnica LCM ci ha permesso di fare significativi passi avanti nella comprensione dei meccanismi molecolari di trauma cranico. 8,10,11,12,13 Siamo stati i primi a investigatori utilizzano questa tecnica per dimostrare che subregioni distinte dell&#39;ippocampo di ratto hanno profili di espressione genica che correlano con la loro vulnerabilità selettiva per infortunio. I nostri studi hanno dimostrato che possiamo quantificare l&#39;espressione genica, per qPCR, da un minimo di 10 celle laser catturati e che potrebbe svolgere il genoma analisi microarray da un minimo di 600 celle catturati. LCM potrebbe essere un valido strumento in studi analoghi di altre regioni del cervello che sono noti per essere implicati in diversi disturbi neurologici e neuropsichiatrici. Per esempio, gli studi che utilizzano LCM hanno fatto luce sulla patogenesi della malattia di Parkinson nei neuroni dopaminergici della substantia nigra, 14 e aiutato genoma studi di profilazione del nucleus accumbens, che è coinvolto in circuiti di ricompensa implicati in substance disturbi da abuso di 15. Eterogeneità neuronale si riflette a livello del genoma 16 e possono contribuire alla mancanza di successo di trattamenti sperimentali per TBI in studi clinici. Così, il nostro obiettivo è quello di utilizzare questa tecnica per studiare gli elementi critici che influenzano la sopravvivenza neuronale dopo trauma cranico. Nostro recente studio genoma profiling di morire e adiacente superstite neuroni ippocampali dopo TBI suggerito che un reostato cellulare che riflette il rapporto tra i livelli di espressione dei geni per la sopravvivenza delle cellule morte cellulare regola destino cellulare dopo TBI. Questi studi in corso contribuiranno alla progettazione e sviluppo di strategie farmacologici in grado di influenzare positivamente il reostato sopravvivenza cellulare. Inoltre, attualmente in uso LCM per seguire e controllare gli effetti di potenziali trattamenti farmacologici terapeutici in neuroni ippocampali dopo trauma cranico. Così, i nostri studi dimostrano che i dati accurati RNase-free e alcune tecniche di manipolazionemodifiche di protocolli esistenti, è possibile ottenere elevate qualità campioni di RNA da LCM per accurate analisi quantitativa dell&#39;espressione genica. Tuttavia ci sono alcuni trabocchetti associati a tecniche di LCM. Per esempio, raccogliendo solo le cellule neuronali senza contaminazioni microglia può essere quasi impossibile. Nello strato di cellule piramidali dell&#39;ippocampo è stato stimato che il 95% delle cellule sono neuroni con il 90% di questa popolazione da cellule piramidali e interneuroni 10%, lasciando una piccola percentuale di tipi di cellule gliali e altri. 8,17, 18 Nei nostri studi utilizziamo Fluoro-giada un colorante fluorescente che etichetta specificamente solo i neuroni danneggiati nel tessuto cerebrale. Una macchia differente che è un marcatore per GFAP sarebbe necessario per colorare microglia. 19 Raccolta solo le Fluoro-Jade macchiati singoli corpi neuronali garantisce una popolazione omogenea di neuroni. Un altro problema comune che può richiedere la risoluzione dei problemi è che un cerchio non èt definito quando il laser viene sparato. Se ciò si verifica, è necessario controllare le impostazioni laser e regolare la potenza e la durata necessarie. Inoltre è importante accertarsi che il cappuccio sia appiattito sul tessuto e posizionati correttamente nel braccio. Facendo riferimento al manuale LCM tecnico o chiamando il supporto tecnico a volte sarà necessario. Seguendo LCM e isolamento dell&#39;RNA, la qualità del RNA deve sempre essere valutato utilizzando un bioanalizzatore prima di qualsiasi analisi di espressione genica. Ci sono diversi tipi di strumenti di cattura laser attualmente presenti sul mercato, tra cui taglio laser (Life Technologies, Leica Microsystems) e laser catapultando (Zeiss) strumenti. Il nostro sistema di LCM funziona bene per l&#39;acquisizione di un piccolo numero di cellule. Altri sistemi ad alto rendimento e più automatizzato può essere più adatto per ottenere un maggior numero di cellule per analisi genomica e proteomica particolare. Infatti, LCM utilizzando questi sistemi automatici ha un grande potenziale per l&#39;analisi dei protein espressione in cellule identificate o popolazioni arricchite di cellule. 20 Inoltre, LCM può facilitare l&#39;analisi di espressione genica di cellule immunolabeled, 21 consentono di investigare l&#39;espressione genica in cellule tipi definiti indipendentemente dalla complessità nei tessuti più eterogenei. Così, LCM è un ottimo strumento per gli studi molecolari all&#39;avanguardia di popolazioni singole o arricchito di cellule.

Analisi di espressione genica dei tessuti eterogenei è sempre stato problematico,. Ciò è particolarmente vero nel cervello dei mammiferi, che ha circa 5.000 diversi tipi di cellule 4 Prima dello sviluppo della cattura microdissezione laser (LCM) tecnica, studi genomici degli effetti di TBI in vivo erano basate su analisi di espressione genica in una popolazione mista di cellule cerebrali compresi, non solo di differenti tipi di cellule neuronali, ma anche di supportare cellule gliali e immunomodulatori. I relativi complessi profili di espressione genica ottenuti da questi tessuti eterogenei, e gli schemi spesso conflittuali di segnali cellulari lesioni indotte, può essere una spiegazione del fallimento nel corso degli studi clinici di strategie terapeutiche dimostrato efficace in studi pre-clinici di trauma cranico. 5 Per ottenere una chiara comprensione di lesione indotta l&#39;espressione del gene in popolazioni vulnerabili di neuroni dal fianco rattopocampus, abbiamo adottato la tecnica della LCM, la prima volta da Emmert-Buck et al. 3 Successivamente, abbiamo modificato e ottimizzato questa tecnica per la cattura microdissezione efficiente delle popolazioni arricchite di neuroni e neuroni singoli per il profiling mRNA utilizzando quantitativa PCR in tempo reale e l&#39;analisi microarray . Per mantenere l&#39;integrità del mRNA in sezioni congelate di tessuto cerebrale per analisi genomica, abbiamo modificato protocolli esistenti per il fissaggio, colorazione e acquisizione rapida dei neuroni da sezioni congelate di cervello di ratto. Per l&#39;identificazione e l&#39;isolamento dei neuroni ippocampali feriti e moribondi, abbiamo anche ottimizzato il Fluoro-Jade tecnica di pittura per LCM. Fluoro-Jade non distingue tra la morte cellulare per apoptosi e necrosi. Così, tutti i tipi di neuroni in degenerazione può essere rilevato da questa macchia. 6,7 Qui, descriviamo il protocollo utilizzato nel nostro laboratorio per ottenere pool di singoli neuroni morenti o di reversibilità, nonché di andane arricchito populaticomponenti di diversi tipi di cellule neuronali (cioè CA1-CA3 neuroni per l&#39;analisi di espressione genica dopo TBI). La procedura per lesioni fluido cerebrale percussioni eseguite nel nostro laboratorio è descritto in dettaglio in Shimamura et al., 8 ed è molto simile al fluido laterale-percussioni protocollo pregiudizio per topi pubblicati JoVE da Alder et al. 9 Poiché la tecnica LCM ha dimostrato di avere un effetto minimo o nullo sulla integrità del DNA, RNA e proteine ​​nei tessuti, questo è un ottimo strumento per l&#39;analisi molecolare e proteine ​​di tipi cellulari definiti.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PixCell IIe Laser Capture Microscope</td>
 <td>Life Technologies (Arcturus)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAqueous Micro- Kit</td>
 <td>Life Technologies (Ambion)</td>
 <td>AM1931 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capsure LCM caps</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>LCM0211/LCM0214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoro-Jade</td>
 <td>Histo-chem Inc.</td>
 <td>#1FJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cresyl Violet Acetate</td>
 <td>Sigma-aldrich</td>
 <td>C5042-10G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene (Histological grade)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>X3P-1GAL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
 <td>UTMB pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free barrier pipette tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> 
 <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> 
 <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica DM6000 B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury

A lungo termine disabilità cognitiva dopo TBI è associato a lesioni neurodegenerazione indotta nell&#39;ippocampo, una regione del lobo temporale mediale, che è fondamentale per l&#39;apprendimento, la memoria e la funzione esecutiva. 1,2 Da qui i nostri studi si concentrano su analisi di espressione genica di neuronale specifica popolazioni in subregioni distinte dell&#39;ippocampo. La tecnica di cattura microdissezione laser (LCM), introdotta nel 1996 da Emmert-Buck, et al., 3 ha permesso significativi progressi nella analisi di espressione genica di cellule singole e arricchito popolazioni di cellule di tessuti eterogenei quali il cervello dei mammiferi che contiene migliaia di tipi di cellule funzionali. 4 Usiamo LCM e un modello di ratto ben consolidata delle lesioni cerebrali traumatiche (TBI) per studiare i meccanismi molecolari che sono alla base della patogenesi della TBI. A seguito di fluido-percussioni TBI, cervelli vengono rimossi a orari prestabiliti post-infortunio, immediatamente congelati in ghiaccio secco,e preparati per il sezionamento in un criostato. I cervelli di ratto può essere incorporato in OCT e sezionato immediatamente, o memorizzati diversi mesi a -80 ° C prima del taglio per microdissezione laser. Inoltre, noi adottiamo LCM per studiare gli effetti del trauma cranico sui ritmi circadiani. Per questo, si colgono i neuroni del nucleo soprachiasmatico che contengono il master clock del cervello dei mammiferi. Qui, viene illustrato l&#39;utilizzo di LCM per ottenere singoli neuroni identificati (infortunato e degenerando, Fluoro-Jade-positivo, o illeso, Fluoro-Jade-negativi) e le popolazioni arricchite di neuroni ippocampali per la successiva analisi di espressione genica mediante real time PCR e / o intero genoma microarrays. Questi LCM abilitati studi hanno rivelato che la vulnerabilità selettiva di regioni anatomicamente distinte del ippocampo di ratto si riflettono nei diversi profili di espressione genica di diverse popolazioni di neuroni ottenuta con LCM da queste regioni distinte. I risultati dei nostri studi a cella singola, dovemettiamo a confronto i profili trascrizionali di morire e adiacente superstite neuroni dell&#39;ippocampo, suggeriscono l&#39;esistenza di un reostato sopravvivenza cellulare che regola la morte cellulare e la sopravvivenza dopo TBI.

Nel nostro studio LCM in primo luogo, siamo stati in grado di dimostrare che le sub-regioni funzionalmente distinte (CA1 e CA3) dell&#39;ippocampo di ratto hanno profili di espressione genica che riflettono la loro vulnerabilità al trauma cranico. 8 Figura 1A-1C mostra cattura laser di neuroni piramidali dell&#39;ippocampo (CA1- CA3), i neuroni giro dentato e neuroni SCN prima, e dopo il LCM. Cattura Pulire piramidale, granulo o neuroni SCN, rispettivamente, sono mostrati i tappi macro. Figura 2A-2B illustra morire, i neuroni positivi Fluoro-Jade piramidali e sopravvivere, i neuroni negativi Fluoro-Jade piramidali prima e dopo la LCM. La cattura pulita del morire o sopravvivere neuroni è indicata visualizzando le cellule catturate sui cappelli LCM. Dopo LCM, l&#39;RNA totale può essere utilizzato per una gamma diversificata di studi molecolari compresi quantitativa real-time PCR dell&#39;espressione genica utilizzando TaqMan o SYBR chimiche verdi (Figura 3A), piccolo focused array PCR con sonde SYBR Green (Figura 3B) o interi genoma studi microarray (Figura 3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figura 1. Cattura microdissezione laser di andane di popolazioni di cellule definite dal cervello di ratto. Congelati 10 sezioni micron coronali del cervello di ratto sono fissati in etanolo, tinto con un Nissl macchia (cresile viola) e preparati per LCM. Vengono mostrati foto dell&#39;ippocampo di ratto e nucleo soprachiasmatico prima e dopo LCM e le cellule catturate come visualizzato sul tappo macro. Neuroni piramidali A. dai CA1-CA3 sottocampi dell&#39;ippocampo di ratto. Cellule granulari B. nel giro dentato dell&#39;ippocampo. C. bilaterale nucleo soprachiasmatico posta a cavallo del terzo ventricoloe si trova al di sopra del chiasma ottico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figura 2. Cattura microdissezione laser di singoli neuroni di ippocampo di ratto. Vengono mostrati A. Degenerare, Fluoro-Jade-positivi (tinto) ippocampali CA3 neuroni e B. Surviving, Fluoro-Jade-negativi (non colorati) CA3 neuroni prima e dopo LCM. Cellule catturate vengono visualizzate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. L&#39;analisi dell&#39;espressione genica di RNA totale isolato da neuroni laser catturati. A. quantitativi in tempo reale PCR dati di espressione genica orologio circadiano in SCN. Heatmap B. di espressione genica nel morire e sopravvivere neuroni dell&#39;ippocampo che mostrano espressione di apoptosi geni correlati con focalizzati array PCR . C. Agilent dell&#39;intero genoma analisi microarray di espressione genica in ippocampali CA1-CA3 neuroni di ratti che hanno ricevuto lesioni finzione, trauma cranico o trauma cranico più un ricombinante adeno-associato virus siRNA progettata per atterramento espressione di geni indotti da lesioni cerebrali (ossido nitrico neuronale sintasi e glutatione perossidasi-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Ci viene descritto come utilizzare la cattura microdissezione laser (LCM) per ottenere popolazioni arricchite di neuroni ippocampali o neuroni singoli da sezioni congelate di cervello di ratto feriti per la successiva analisi di espressione genica mediante real time PCR quantitativa e / o dell&#39;intero genoma microarray.

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

laser-capture-microdissection-enriched-populations-neurons-or-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.1K Views.  University of Texas Medical Branch. Ci viene descritto come utilizzare la cattura microdissezione laser (LCM) per ottenere popolazioni arricchite di neuroni ippocampali o neuroni singoli da sezioni congelate di cervello di ratto feriti per la successiva analisi di espressione genica mediante real time PCR quantitativa e / o dell'intero genoma microarray.

Video: Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Ricerca

Neuroscienze

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Produzione di RNA per l'analisi trascritomica dai corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell&#39;isolamento individuale dopamina neuroni e l&#39;intera area ventrale tegmentale

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescence Activated di separazione delle cellule (FACS) e Gene Expression Analisi di Fos-esprimono neuroni da freschi e congelati Rat tessuto cerebrale

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.