עבודה זו ממומנת על ידי R01 NS052532 (לHLH), מודי הקרן, ומחלקת ההרדמה. אנו מודים לורי ולדינג, כריסטין Courteau אטלר וכריסטי פרי לסיוע העריכה שלהם, וכריסטי פרי לפריסה והפקה מצוינת של כל דמויות, השולחנות ועבודות האמנות.

1. ניתוחים וכלי קשה נוזל TBI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניסויים בבעלי החיים הם ראשון שאושרו על ידי בעלי החיים והטיפול המוסדי הוועדה השתמש באוניברסיטת טקסס רפואי סניף, גלווסטון, טקסס והמכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (8 Edition, המועצה הלאומית למחקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות (ספראג-Dawley גבר בוגרים שחולדות, 400-500 גרמו מתקבלות מנהרות ספק צ&#39;ארלס, פורטלנד, מיין) הם שוכנו שניים לכלוב, וספקו מזון ומים כרצונך בביבר עם תנאים קבועים הבאים: מחזור האור (600 שעות ל1800 שעות), טמפרטורה (21 ° C עד 23 ° C), ושבוע אחד לחות (40% עד 50%) לפני שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכברים עם 4% isoflurane, לצנרר, ולאוורר מכאניים (נמים מדעיים; אנגליה מכשירים רפואיים חדשים, דוואי, MA) בחולדות עם 1.5-2.0% isoflurane בחמצן: האוויר (70:30) ותכין אותם לנוזל כלי קשה parasagittal פגיעה כפי שתוארה לעיל. 8, 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החולדות בנקודת הזמן המתאימה לאחר פציעה תלויה בעיצוב ניסיוני. מהירות להסיר מוחות, להקפיא באופן מיידי על קרח יבש, ולאחסן ב -80 ° C בצינור מ&quot;ל 50 או להמשיך מייד להטבעה באוקטובר לחתך קפוא. </li></ol> 2. תבתר והכתמה של מוח חולדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת המוח שאינו נמצאים בשימוש באופן מיידי יכולה להיות כל זמן ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אם נשמר בטמפרטורה קבועה. המוחין שהם קפואים ב-80 ° C, אז מופשר ל -20 מעלות צלזיוס במשך חתך, ולאחר מכן מחדש קפוא לא יניבו RNA איכות לאחר ההפשרה שנייה. ברגע שהמוח מופשר, רכוב באוקטובר ונותח, שקופיות צריכות להיות מוכתמות בתוך 24 שעות ומשמשות לLCM בתוך 30 דקות לשעה אחת של הכתמה. זה יבטיח RNA באיכות טובה. בעקבות LCM, תאים שנתפסו על כובעי LCM ניתן לאחסן במאגר תמוגה ב-80 ° C עד שבוע אחד, אבל צריך להיות מבודד RNA באופן מסודר על מנת להבטיח את האיכות הגבוהה ביותר. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני חתך המוח, נגב cryostat עם RNase-Zap ומנקה את המכחולים עם ETOH (להחליף את הלהב חד הפעמי בין כל מוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזר את המוח בצינור המ&quot;ל 50 מ° C מקפיא -80; למקם אותו לתוך cryostat בטמפרטורה של -22 מעלות צלזיוס, והפשרה בצינור לכ 10 דקות. הסר את המוח מהצינור והמקום על הבמה בגזה, צד גחון למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסכין גילוח, פורס את המוח כדי להסיר את החלק האחורי של המוח פשוט המקורי למוח הקטן והחלק הקדמי בתצלובת האופטית. מלא cryomold עם מדיום הרכבת אוקטובר (הרקמות Tek), ולמקם את המוח לתוך התבנית עם הצד הקדמי כלפי מטה. אפשר להקפיא רקמת המוח בהרכבה הבינונית עד שהוא הופך לבן (כ 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפא את דיסק הדגימה (הרקמות Tek) על המוח באוקטובר הסר את המוח מהעובש. הכנס את המוח לראש הדגימה ולהדק את הברגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס disposa, להב ble פרופיל הנמוך (הפישר סיינטיפיק) לתוך מחזיק הסכין ולהדק את הידית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין חיתוך המוח ב20 מיקרומטר להסיר את השכבה החיצונית של אוקטובר ברגע שאזור ההיפוקמפוס הוא הגיע, להגדיר חיוג מיקרון עד 10. איסוף חלקים סדרתיים עטרה ידי הצבת שקופית זכוכית או שקופיות בתוספת זכוכית על קטע הרקמה (הפישר סיינטיפיק). שקופיות נשמרות ב -20 ° C במתלה מכתימה RNase-חופשיה עד החתך הוא מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את כל RNases מזכוכית שבו חלקי רקמת מעובד, לנגב את כל המכולות המכתימות וסיים עם גלילי Eliminase (הפישר סיינטיפיק) ולשטוף במים ש מילי. הכן את כל הפתרונים במי RNase חינם ולסנן הסגולים cresyl (סיגמא אולדריץ) וFluoro-ג&#39;ייד (Histo-כימי) כתם עם 0.2 מיקרומטר לסנן לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר חלקי המוח בRT למשך 30 שניות ולתקן ב75% ETOH דקות (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לLCM של תאי עצב פגוע בודד לאחר קיבוע, לשטוף שקופיות במי RNase חינם (דקות 1), Counterstain עם סגול cresyl 1% (15-20 שניות), לשטוף במי RNase חינם (2 × 30 שניות), עם כתם Fluoro-ג&#39;ייד (4 דקות), לשטוף במי RNase חינם (3 × דקות 1), לייבש עם ETOH 95% עשויים ממים RNase חינם (30 שניות),% ETOH 100 (30 שניות), וקסילן (2 × 3 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לLCM של אגודות של נוירונים לאחר קיבוע, לשטוף שקופיות במי RNase חינם (דקות 1), עם כתם סגול cresyl% 1 (דקות 1), לשטוף במי RNase חינם ל( 3 × דקות 1), לייבש עם 95% ETOH (2 × 30 שניות), 100% ETOH (2 × 30 שניות), וקסילן (2 × 3 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש בכל החלקים מנדף למשך 15 דקות לפני LCM. שקופיות ניתן לאחסן, צדדים בסעיף למעלה, בשקופית תיבה מרופדת בdessicant, אם הם צריכים להיות מועברים מחדר לחדר. עם זאת, תוצאות אופטימליות מתקבלות אם LCM מתבצע מייד לאחר החלקים יבשים. LCM צריך להיות מוגבל מ30 דקות לשעה 1. בפרק הבא, יתארו תחילה כיצד לתפוס נתחים רציפים של תאים, אשר הם easiest לשלוט למי שלומדים את הטכניקה הזו. אז מתארים כיצד בדיוק כדי ללכוד תאי עצב בודדים. בנוהל שלנו, אנחנו מזהים נוירונים גוססים ידי זיקתם לFluoro-Jade-סמן של תאי עצב מנוון. תאים-Jade שליליים-Fluoro הונחו כלשרוד הנוירונים. </li></ol> 3. Microdissection לכידת הליזר (LCM) LCM של אגודות של אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LCM מתבצע באמצעות מיקרוסקופ IIE PixCell עם דיודת ליזר אינפרא אדום (חי טכנולוגיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ג&#39;ויסטיק המרכז למצב האנכי. לסובב ולנעול את מטרת 4X למקומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופית במרכז במת מיקרוסקופ ולשנות באופן ידני עד לאזור של ההיפוקמפוס הוא בתצוגה. השתמש בהתאמות להתמקד גסות ועדינות כדי להביא את התמונה אל מוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את צ&#39;אק הוואקום על ידי לחיצה על כפתור הוואקום בבקר. לסובב ולנעול את מטרת 10X לתוך plאס. אתמקד שוב בהתאמות גסות ועדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען CapSure מאקרו LCM הכיפות (חי טכנולוגיות) למודול CapSure הקלטת ועמדת כובע במיקום קו הטעינה. סובב את זרוע קאפ מיקום והמיקום סביב הכובע. הרם את זרוע השמת יתר כדי להסיר את כובע CapSure ממודול הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את זרוע השמת יתר על השקופית ולהנמיך את הזרוע מעל השקופית; זה ימקם את הכובע לשקופית. התאם להתמקד בסדר ולהזיז את הג&#39;ויסטיק כדי לבדוק אם תאים נמצאים בתוך העיגול השחור על הכובע. כל הלוכדת הסלולרית צריכה להיות בתוך העיגול השחור הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פרמטרי הליזר. ראשית, לחץ על כפתור ליזר מאפשר בבקר. נקודת יעד הליזר תהיה גלויה כנקודה ורודה בשדה ראייה על צג המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל כתם ליזר לקטן (7.5 מיקרומטר) להתמקד הליזר ולהתאים את העצמה ומשך הזמן עד 65-75 mW, ל1.0-2.0 msec כצורך ללכוד תא אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהרח הליזר, השתמש בג&#39;ויסטיק כדי להזיז את נקודת הליזר לאזור שבו אין תאים להרים. אש הליזר באמצעות מתג האגודל. השתמש בג&#39;ויסטיק כדי להזיז את נקודת הליזר בלבד מנקודת הפולימר המומסת ולבדוק אם טבעת כהה גלויה מקיפה אזור שבו ברור הליזר פוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללכוד תאים, השתמש בג&#39;ויסטיק כדי להעביר את כתם הליזר על פני השטח של תאים ללכוד. אש הליזר באמצעות מתג האגודל. הזז את מוט ההיגוי בעת ירי הליזר כדי לתפוס שטח גדול של תאים. כאשר הליזר ירה הוא נמס סרט פולימר תרמופלסטי על כובע על פני השטח של תאי המטרה. הפולימר סופג את קרינת הליזר, ובכך שלא לשנות את רנ&quot;א, דנ&quot;א או החלבונים להבטיח את תקינותו של המדגם עבור יישומים מולקולריים עתידיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שפטר את כל התאים של עניין, הרם את זרוע מיקום קאפ. התאים שנתפסו יפרידו מסעיף הרקמות ולדבוק בכובע CapSure. הרקמות והתאים שנותרו חסרים תהיינה מולניכר בו כלל בשדה הראייה. התאים בכובע גם ניתן לראות על ידי הצבת הכובע על חלק ריק של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את זרוע השמת יתר ולסובב אותו לקאפ Unload תחנה. מנמיך את הכובע לתחנה ולסובב את זרוע מיקום קאפ חזרה למקומו הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק את כלי החדרת CapSure לאורך הרציף ועל הכובע. הרם את הכלי מהפלטפורמה. הכובע יישאר מחובר. לגעת קל כובע למשטח הנקי CapSure לנקות את הרקמות לא רצויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכובע לתוך צינור 0.5 מ&quot;ל RNase-חופשי מלאים עם 100 μl של חיץ תמוגה מתקבל מקיט RNAqueous מייקר הבידוד. מייד מערבולת הכובע למשך 30 שניות לlyse התאים. דגירת הדגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות והקפאה ב-80 ° C עד בידוד RNA. </li></ol> LCM של יחיד FJ + נוירונים ביפוקמפוס <ol start="15" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללכוד תאים בודדים, טען CapSure HS LCM כובעים למודול הקלטת CapSure וpositiבכובע במיקום קו הטעינה. סובב את זרוע השמת יתר ולמקם אותו סביב הכובע. הרם את זרוע השמת יתר כדי להסיר את כובע CapSure ממודול הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל כתם הליזר לקטן (7.5 מיקרומטר) להתמקד הליזר ולהתאים את כוח הליזר והמשך עד 65 mW -75 ל0.45-0.50 אלפית עבור לכידת תא אופטימלית של תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את זרוע השמת יתר על השקופית ולהנמיך את הזרוע כלפי מטה לכיוון השקופית. זה יהיה מקום הכובע על השקופית. משטח כובע CapSure HS יושב גבוה מהמדגם במהלך LCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בג&#39;ויסטיק כדי להזיז את הליזר על FJ + תאים בודדים. כל התאים שנתפסו חייבים להיות בתוך הטבעת השחורה הקטנה על המכסה. אש הליזר באמצעות מתג האגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל התאים בתוך שטח העיגול השחור כבר ירו בליזר, הרם את זרוע מיקום קאפ. התאים שנתפסו יפרידו מסעיף הרקמות ולדבוק CapSure HS הכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופית אחרת במייקרולהתמודד במה ולאסוף FJ + תאים עד כובע HS מלא. הנח את הכובע לתוך צינור 0.5 מ&quot;ל RNase-חופשי מלא ב40-50 μl של חיץ תמוגה. מייד מערבולת הכובע למשך 30 שניות לlyse התאים. דגירת הדגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות והקפאה ב-80 ° C עד בידוד RNA. </li></ol> 4. בידוד RNA סה&quot;כ מדוגמאות LCM (סעיף זה יהיה רק ​​להיות מתואר במצגת וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רנ&quot;א סך מתאים מבודד באמצעות ערכת RNAqueous-Micro (Ambion) בעקבות הפרוטוקולים של היצרן. כל ריאגנטים ופתרוני שטיפה מסופקים בערכה זו. ההרכבה טרום רטובת מייקר מסנן המחסנית על ידי הוספת 30 μl של חיץ פתרון תמוגה למסנן. לאחר 5 דקות, סרכזת המסנן למשך 30 שניות ב -10,000 × גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של תוסף LCM לlysate המדגם, פיפטה לערבב, וצנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 52% μl של ETOH 100 (1/2 נפח) לlysate המדגם; פיפטה לערבב, ולהעביר lysate למסנןעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עמודת המסנן ב -10,000 × גרם לדקה 1 כדי לאגד את הרנ&quot;א לעמודה. אם יש פקקים מרובים עבור מדגם אחד, כל הספין lysate דרך אותה העמודה בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את הליך בידוד RNA כמתואר בערכת מייקר RNAqueous. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע DNase טיפול ואיון DNase של דגימות LCM RNA כמתואר בערכה, להעביר את הרנ&quot;א לצינור RNase-חופשי ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol> 5. כימות רנ&quot;א ויישומי מורד הערכה של איכות וכימות RNA מתבצעת עם Agilent Bioanalyzer באמצעות ריאגנטים מקיט הפיק (Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה) בעקבות הפרוטוקול של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סה&quot;כ RNA הוא נתח בAgilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). התוכנה מעריכה את הריכוז ואת תקינותו של מדגם RNA ידי הקצאת מספר Integrity RNA (רין) לכל מדגם f נעrom 1 עד 10. 1-5 מציינים RNA המושפל ו7-10 מציינים RNA באיכות טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רנ&quot;א השלם ללא מושפל ישמש בזמן האמת PCR; מבחנים בודדים TaqMan או RT2 מערכי Profiler באמצעות כימיה Sybr ירוקה. RNA יכול לשמש גם לניתוח microarray-mRNA וניתוח microarray microRNA. </li></ol>

<ol>
	<li>Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medial+temporal+lobe.">The medial temporal lobe.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).</li><li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function:+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior.">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li><li>Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+networks+to+brain+networks.">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li><li>Schouten, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+in+traumatic+brain+injury:+a+complex+struggle+against+the+biology+of+nature.">Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature.</a> Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).</li><li>Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+a+novel+fluorochrome+for+the+sensitive+and+reliable+histochemical+localization+of+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration.</a> Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).</li><li>Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade+and+silver+methods:+application+to+the+neuropathology+of+scrapie,+a+transmissible+spongiform+encephalopathy.">Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).</li><li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Fluid+Percussion:+Model+of+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice.">Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice.</a> J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+long-term+gene+expression+in+neurons+of+the+hippocampal+subfields+following+traumatic+brain+injury+in+rats.">Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats.</a> Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).</li><li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice.">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).</li><li>Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons.">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li><li>Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury.">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).</li><li>Elstner, M., Morris, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson's+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death.">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li><li>Chen, H., Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Profiling+of+Nucleus+Accumbens+Neurons+Projecting+to+Ventral+Pallidum+Using+both+Microarray+and+Transcriptome+Sequencing.">Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing.</a> Front. Neurosci. 5, 98 (2011).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons,+numbers+and+the+hippocampal+network.">Neurons, numbers and the hippocampal network.</a> Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).</li><li>Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+long-term+treatment+with+L-deprenyl+on+the+age-dependent+microanatomical+changes+in+the+rat+hippocampus.">Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus.</a> Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).</li><li>Schmued, L. C., Hopkins, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+novel+fluorochromes+for+detecting+toxicant-induced+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration.</a> Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).</li><li>Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+use+of+laser+capture+microdissection+to+selectively+obtain+distinct+populations+of+cells+for+proteomic+analysis--+preliminary+findings.">The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings.</a> Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).</li><li>Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunostained+frozen+sections+for+mRNA+analysis.">Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis.</a> Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

טכניקת LCM זו אפשרה לנו לבצע התקדמות משמעותית בהבנת המנגנונים המולקולריים של TBI. 8,10,11,12,13 היינו החוקרים הראשונים לנצל טכניקה זו כדי להוכיח כי אזורי משנה שונים של היפוקמפוס העכברוש יש פרופילי ביטוי גנים ה לתאם עם הפגיעות סלקטיבית שלהם לפציעה. המחקרים שלנו הראו שאנחנו יכולים לכמת ביטוי גנים, בqPCR, מכמה כמו 10 תאי ליזר שנתפסו ושאנחנו יכולים לבצע ניתוח microarray הגנום מכמה כמו 600 תאים שנתפסו. LCM יהיה כלי חשוב במחקרים דומים באזורים אחרים במוח שידוע כי הם יהיו מעורבים בהפרעות נוירולוגיות ונוירופסיכיאטריות מגוונות. לדוגמה, מחקרים באמצעות LCM שפכו אור בפתוגנזה של מחלת פרקינסון בנוירונים של דופאמין substantia nigra, 14 ונעזרו מחקרי הגנום כל אפיון של הגרעין הנסמך, העוסקים במעגלי תגמול מעורבים בזההפרעות ubstance 15 התעללות. ההטרוגניות עצבית מתבטאת ברמת הגנום 16 ועשויות לתרום לחוסר הצלחה של טיפולים ניסיוניים לTBI בניסויים קליניים. לכן, המטרה שלנו היא לנצל את הטכניקה הזאת כדי לחקור את האלמנטים קריטיים המשפיעים על הישרדות תאי עצב לאחר TBI. המחקר האחרון שלנו הגנום הפרופיל של גסיסה וצמודה לשרוד נוירונים ביפוקמפוס לאחר TBI הציע שריאוסטט סלולרי המשקף את היחס בין רמות הביטוי של גנים להישרדות תא מוות של תאים מווסת גורל תא לאחר TBI. מחקרים מתמשכים אלו יתרמו לעיצוב והפיתוח של אסטרטגיות pharmacotherapeutic שיכול להשפיע באופן חיובי ריאוסטט הישרדות התא. יתר על כן, אנו משתמשים כיום LCM לעקוב ולנטר את ההשפעות של טיפולים תרופתיים טיפוליים פוטנציאליים בנוירונים ביפוקמפוס לאחר TBI. לכן, המחקרים שלנו מראים כי טכניקות שניתנו זהירות RNase ללא טיפול וכמהשינויים של פרוטוקולים קיימים, ניתן להשיג דגימות RNA איכות גבוהות מLCM לניתוח ביטוי מדויק כמו גן. עם זאת יש כמה חסרונות הקשורים בטכניקות LCM. לדוגמה, איסוף רק תאים עצביים ללא כל זיהום המיקרוגליאה יכול להיות כמעט בלתי אפשרי. בשכבת תאי הפירמידה של ההיפוקמפוס זה כבר העריך כי 95% מתאי נוירונים עם 90% מאוכלוסייה זו כתאי פירמידה וinterneurons 10%, מותיר אחוז קטן של סוגי התאים גלייה ואחרים. 8,17, 18 במחקרים שלנו אנו משתמשים Fluoro-ירקן צבע פלואורסצנטי כי תוויות נוירונים נפגע רק ברקמת המוח באופן ספציפי. כתם שונה שמהווה סמן לGFAP יהיה צורך להכתים המיקרוגליאה. איסוף רק 19 הגופות העצביות הבודדות המוכתמות Fluoro-הירקן מבטיח אוכלוסייה הומוגנית יותר של תאי עצב. בעיה נפוצה נוספת שעשויה לדרוש פתרון בעיות היא שהמעגל הוא לאלא מוגדר כאשר הליזר הוא ירה. במקרה זה, יש צורך לבדוק את גדרות הליזר ולהתאים את העצמה והמשך במידת צורך. כמו כן חשוב לוודא שהכובע מונח שטוח על הרקמות וישובה בצורה נכונה בזרוע. בהתייחסו למדריך הטכני LCM או מתקשר לתמיכה טכנית יהיה לפעמים יהיה צורך. בעקבות LCM ובידוד RNA, את האיכות של RNA צריכה להיות תמיד הוערכה באמצעות bioanalyzer לפני כל ניתוח ביטוי גנים. ישנם מספר סוגים של מכשירי ליזר ללכוד כיום בשוק, כולל חיתוך בליזר (חי טכנולוגיות, סאן יקה) וליזר catapulting מכשירים (Zeiss). מערכת LCM שלנו עובדת היטב עבור לכידת מספר קטן של תאים. מערכות תפוקה גבוהה יותר ואוטומטיות אחרות עשויות להיות מתאימות יותר להשגת מספר גדול יותר של תאים לניתוח גנומי ובמיוחד proteomic. אכן, LCM באמצעות המערכות האוטומטיות הללו יש פוטנציאל גדול לניתוח של יחסי הציבורביטוי otein בחוליות מזוהות או אוכלוסיות מועשרות של תאים. 20 יתר על כן, LCM יכול להקל על ניתוח ביטוי גנים של תאי immunolabeled, 21 מאפשרים לנו לחקור את ביטוי גנים בתאים מסוגים מוגדרים ללא תלות במורכבות ברקמות הטרוגניות ביותר. לפיכך, LCM הוא כלי מצוין למחקרים מולקולריים חדשניים של אוכלוסיות בודדות או מועשרות של תאים.

ניתוח ביטוי גנים ברקמות הטרוגניות תמיד היה בעייתי;. זה נכון במיוחד במוח של היונקים, שבה יש כ -5,000 סוגי תאים שונים 4 לפני התפתחות microdissection ליזר הלכידה (LCM) טכניקה, המחקרים גנטיים של ההשפעות של TBI in vivo התבססו על ניתוח של ביטוי גנים באוכלוסייה מעורבת של תאי מוח המורכבים, לא רק של סוגי תאים עצביים שונים, אלא גם בתמיכה במערכת חיסונית ותאי גליה. את פרופילי ביטוי הגנים המורכבים הנובעים מתקבלים מרקמות הטרוגניות אלה, ואת הדפוסים המתנגשים התדירים של אותות סלולריים פציעה מושרה, עשויים להיות הסבר אחד לכישלון בניסויים קליניים בבני אדם של אסטרטגיות טיפוליות הוכח כיעיל במחקרים טרום קליניים של TBI. 5 כדי להשיג הבנה ברורה של ביטוי גני פגיעה הנגרם באוכלוסיות חלשות של נוירונים ממותן העכברושpocampus, אמץ את הטכניקה של LCM, שפורסם לראשונה על ידי Emmert-אק et al. 3 לאחר מכן, אנחנו שונים ומותאמים טכניקת microdissection זה ללכידה יעילה של אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ונוירונים בודדים ליצירת פרופילי mRNA באמצעות PCR זמן אמיתי כמוני וניתוח microarray . כדי לשמור על היושרה של mRNA בסעיפים קפוא של רקמת מוח לניתוח גנומי, אנחנו שונים פרוטוקולים קיימים לתיקון, צביעה ולכידה מהירה של תאי עצב מחלקי מוח חולדה קפואות. לזיהוי ולבידוד של תאי עצב ביפוקמפוס פצועים וגוססים, אנחנו גם אופטימיזציה טכניקת צביעת Fluoro-Jade לLCM. Fluoro-Jade אינו מבחין בין מוות של תאים אפופטוטיים ונימקים. לפיכך, בכל סוגי תאי עצב מנוון יכולים להיות מזוהים על ידי כתם. 6,7 זה כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול המשמש במעבדה שלנו כדי לקבל ברכות של נוירונים גוססים או ששרדו בודדים, כמו גם תלמים המועשר populatiתוספות של סוגי תאים עצביים ברורים (כלומר CA1-CA3 נוירונים לניתוח ביטוי גנים לאחר TBI). ההליך לפגיעה מוחית כלי קשה נוזל שבוצעה במעבדתנו מתואר בפירוט בShimamura et al., 8 והוא דומה מאוד לפרוטוקול פציעת רוחב נוזל כלי הקשה לעכברים שפורסמו ביופיטר ידי Alder et al. 9 מאז טכניקת LCM יש נראה שיש לי מינימאלית או ללא השפעה על היושרה של DNA, RNA וחלבון ברקמות, זה כלי מצוין לניתוח מולקולרי וחלבונים מסוגי תאים מוגדרים.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PixCell IIe Laser Capture Microscope</td>
 <td>Life Technologies (Arcturus)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAqueous Micro- Kit</td>
 <td>Life Technologies (Ambion)</td>
 <td>AM1931 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capsure LCM caps</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>LCM0211/LCM0214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoro-Jade</td>
 <td>Histo-chem Inc.</td>
 <td>#1FJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cresyl Violet Acetate</td>
 <td>Sigma-aldrich</td>
 <td>C5042-10G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene (Histological grade)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>X3P-1GAL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
 <td>UTMB pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free barrier pipette tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> 
 <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> 
 <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica DM6000 B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury

לקות קוגניטיבית לטווח ארוך לאחר TBI משויכת לניוון מוחיה הנגרם פגיעה ביפוקמפוס, האזור באונה הטמפורלית מדיאלית שהיא קריטי ללמידה, זיכרון ותפקוד ביצועי. 1,2 לכן המחקרים שלנו להתמקד בניתוח של ביטוי גנים עצביים ספציפי אוכלוסיות באזורי משנה שונים של ההיפוקמפוס. הטכניקה של לכידת microdissection הליזר (LCM), הציגה בשנת 1996 על ידי Emmert-באק, et al., 3 אפשרה להתקדמות משמעותית בניתוח ביטוי גנים של תאים בודדים והעשירה את האוכלוסיות של תאים מרקמות הטרוגניות כמו המוח של יונקים המכיל אלף סוגי תאים פונקציונליים. 4 אנו משתמשים LCM ומודל מבוסס היטב חולדה של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס פתוגנזה של TBI. בעקבות נוזל כלי קשה TBI, מוח מוסרים בזמנים שנקבעו מראש, שלאחר פציעה, הוקפא מייד בקרח יבש,ומוכן לחתך בcryostat. את מוח החולדה יכול להיות מוטבע באוקטובר ונותח באופן מיידי, או לאחסן כמה חודשים ב-80 ° C לפני החתך ללכידת microdissection ליזר. בנוסף, אנו משתמשים LCM כדי לחקור את ההשפעות של TBI במקצבי יממה. לשם כך, אנו ללכוד נוירונים מגרעיני suprachiasmatic המכילים את השעון הראשי של המוח של היונקים. הנה, אנחנו מדגימים את שימוש LCM להשיג נוירונים בודדים מזוהים (נפצע ומתנוונת,-Jade חיובי Fluoro, או ללא פגע,-Jade שלילי Fluoro) ואוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס לניתוח ביטוי גנים לאחר מכן על ידי הזמן האמיתי PCR ו / או microarrays שלם הגנום. מחקרי LCM המותאמים אלה חשפו כי הפגיעות סלקטיבית של אזורים אנטומית שונים של היפוקמפוס העכברוש משתקפות בפרופילי ביטוי הגנים השונים של אוכלוסיות שונות של תאי עצב המתקבלים על ידי LCM מהאזורים שונים אלה. התוצאות ממחקרי התא הבודד שלנו, שםאנו משווים את פרופילי תעתיק מיתה וצמודה לשרוד נוירונים ביפוקמפוס, מרמזים על קיומו של ריאוסטט הישרדות תא המווסת את המוות של תאים והישרדות לאחר TBI.

במחקר LCM הראשון שלנו, הצליח להראות כי אזורי משנה ברורים תפקודיים (CA1 וCA3) של ההיפוקמפוס החולדה יש פרופילי ביטוי גנים המשקפים את פגיעותם לאיור 8 TBI. 1A-1C מראה לכידת ליזר של נוירונים ביפוקמפוס פירמידה (CA1- CA3), הנוירונים משוננים gyrus ונוירונים SCN לפני, ואחרי LCM. לוכד נקי של פירמידה, גרגר או נוירונים SCN, בהתאמה, מוצג על מכסי מאקרו. איור 2A-2B ממחיש גוסס, Fluoro-Jade עצב פירמידליים חיובי ולשרוד נוירונים, Fluoro-Jade שליליים פירמידליים לפני ואחרי LCM. הלכידה הנקיה של למות או לשרוד נוירונים מוצגת על ידי צפייה בתאים שנתפסו על כובעי LCM. לאחר LCM, רנ&quot;א כלל יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים מולקולריים כוללים ניתוח כמוני בזמן אמת PCR של ביטוי גנים באמצעות chemistries הירוק SYBR (האיור 3A) TaqMan או, הקטן focused מערכי PCR עם בדיקות SYBR ירוקות (איור 3 ב &#39;) או שלמים מחקרי microarray הגנום (האיור 3C). <img alt="איור 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> איור 1. microdissection לכידת הליזר של אגודות של אוכלוסיות תאים מוגדרים ממוח החולדה. סעיפי 10 מיקרומטר עטרה קפואים של מוח החולדה קבוע באתנול, מוכתם בכתם (סגול cresyl) nissl כתם ומוכן לLCM. הראה תמונות של היפוקמפוס העכברוש וגרעין suprachiasmatic לפני ואחרי LCM ותאים שנתפסו כדמיין על כובעי מאקרו. נוירונים פירמידת א &#39;מתת תחומי CA1-CA3 של ההיפוקמפוס החולדה. תאי גרגיר B. ברכס המשונן ביפוקמפוס. גרעיני suprachiasmatic ג Bilateral ממוקמים בכל צד של החדר השלישיוממוקם מעל chiasma האופטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> איור 2. microdissection ליזר לכידתו של נוירונים בודדים מהיפוקמפוס העכברוש. המוצגים הם א מתנוונת, (צבעוני) CA3 נוירונים ביפוקמפוס-Jade חיובי Fluoro וב &#39;שורד,-Jade שלילי Fluoro (כתם) CA3 נוירונים לפני ואחרי LCM. תאים שנתפסו הם דמיינו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. ניתוח ביטוי גנים של רנ&quot;א כלל מבודד מהנוירונים ליזר שנתפסו. נתונים כמותיים א בזמן אמת PCR של ביטוי גני שעון יממה בSCN. Heatmap ב &#39;של ביטוי גנים בגוססים ולשרוד נוירונים ביפוקמפוס מראים ביטוי של גנים הקשורים לאפופטוזיס באמצעות מערכי PCR ממוקדים . ג Agilent ניתוח microarray כל הגנום של ביטוי גנים בתאי עצב ביפוקמפוס CA1-CA3 מחולדות שקבלו פציעה מדומה, TBI או TBI בתוספת וירוס adeno הקשורים siRNA רקומביננטי נועד ביטוי מציאה של גנים הנגרם על ידי פגיעה מוחית (תחמוצת חנקן עצבית synthase וגלוטתיון פראוקסידאז-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

אנו מתארים כיצד להשתמש microdissection לכידת הליזר (LCM) להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים בודדים מחלקים קפוא של מוח החולדה הפצועה לניתוח ביטוי גנים בעקבות שימוש בזמן PCR הריאלי כמוני ו / או microarrays כל הגנום.

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

laser-capture-microdissection-enriched-populations-neurons-or-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.1K Views.  University of Texas Medical Branch. אנו מתארים כיצד להשתמש microdissection לכידת הליזר (LCM) להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים בודדים מחלקים קפוא של מוח החולדה הפצועה לניתוח ביטוי גנים בעקבות שימוש בזמן PCR הריאלי כמוני ו / או microarrays כל הגנום.

Video: Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

בידוד באף גזע תאים חוש הריח של מכרסמים או בני אדם

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

ניתוח שינויי ביטוי הגנים בהיפוקמפוס העכברוש לאחר Deep Brain Stimulation של Anterior התלמוס הגרעין

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.