Este trabalho é financiado por R01 NS052532 (para HLH), a Fundação Moody, e do Departamento de Anestesiologia. Agradecemos Laurie Bolding, Christine Courteau Butler e Christy Perry para a sua assistência editorial, e Christy Perry para layout e excelente produção de todas as figuras, tabelas e ilustrações.

1. Procedimentos Cirúrgicos e Percussão Fluid TCE <ol><li> Todos os experimentos com animais são primeiro aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso da Universidade do Texas Medical Branch, Galveston, Texas e do Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8 ª edição, Conselho Nacional de Pesquisa). </li><li> Os ratos (machos adultos Sprague-Dawley, 400-500 g obtido a partir do fornecedor de Charles Rivers, Portland, Maine) são alojados dois por gaiola e forneceu comida e água ad libitum num viveiro com estas condições constantes: ciclo de luz (600 a 1800 hr h), temperatura (21 ° C a 23 ° C) e humidade (40% a 50%) uma semana antes da utilização. </li><li> Anestesiar ratos com 4% isoflurano, intubar e ventilar mecanicamente (NEMI Científico; New England Medical Instruments, Medway, MA) os ratos com 1,5-2,0% de isoflurano em oxigênio: o ar (70:30) e prepará-los para parassagital fluido-percussão ferimento, como descrito anteriormente. 8, 10 </li><li> Sacrificar ratos no ponto de tempo apropriado após a lesão, dependendo do desenho experimental. Remover rapidamente os cérebros, congelar imediatamente em gelo seco, e armazenar a -80 ° C em um tubo de 50 ml ou prosseguir imediatamente para incorporar em OCT para seccionamento congelado. </li></ol> 2. Corte e coloração do cérebro de ratos <ol><li> O tecido do cérebro que não é utilizado imediatamente pode ser mantido à temperatura de -80 ° C, durante até um mês, se mantidas a uma temperatura constante. Cérebros que são congelados a -80 ° C, depois descongelado a 20 ° C durante o corte, e em seguida, re-congeladas não produzem RNA de qualidade após a descongelação segundo. Uma vez que o cérebro é descongelado, montado em OCT e seccionadas, as lâminas devem ser coradas dentro de 24 horas e usados ​​para a LCM dentro de 30 minutos a uma hora de coloração. Isto irá assegurar RNA de boa qualidade. Seguindo LCM, as células capturadas no LCM tampas podem ser armazenados em tampão de lise a -80 ° C durante até uma semana, mas ARN deve ser isolado de uma forma atempada, para garantir a melhor qualidade. &lt;/ Li&gt; <li> Antes do corte do cérebro, limpe o criostato com RNase-Zap e limpar os pincéis com EtOH (substitua a lâmina descartável entre cada cérebro). </li><li> Recuperar o cérebro no tubo de 50 ml a partir do congelador -80 ° C; colocá-lo no criostato a uma temperatura de -22 ° C e descongelamento no tubo durante cerca de 10 min. Remover o cérebro do tubo e local para o palco em gaze, lado ventral para cima. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, a fatia de cérebro para remover a porção posterior do cérebro apenas rostral do cerebelo e da porção anterior no quiasma. Encha uma cryomold com outubro meio de montagem (Tissue Tek), e colocar o cérebro para o molde com o lado anterior para baixo. Permitir que o tecido cerebral de congelar no meio de montagem até que fique branco (aproximadamente 10 min). </li><li> Congele a amostra de disco (Tissue Tek) no cérebro com outubro Remover o cérebro do molde. Insira o cérebro na cabeça do espécime e aperte os parafusos. </li><li> Insira um Disposavel, lâmina de perfil baixo (Fisher Scientific) no porta faca e apertar a alavanca para baixo. </li><li> Começar a cortar o cérebro menos de 20 um para remover a camada exterior de outubro Uma vez que a região do hipocampo é atingido, coloque o disco a 10 mícron. Colete cortes seriados coronais, colocando uma placa de vidro ou de vidro deslizante mais para a secção de tecido (Fisher Scientific). As lâminas são conservados a -20 ° C em um suporte de coloração RNase até seccionamento é completa. </li><li> Para remover todas as RNases de vidro onde as seções de tecido são processados, limpe todos os recipientes de coloração e cilindros graduados com Eliminase (Fisher Scientific) e enxaguar em água Milli Q. Preparar todas as soluções com RNase isento de água e filtrar a violeta de cresilo (Sigma-Aldrich) e Fluoro-Jade (Histo-chem) mancha com um filtro de 0,2 um antes da utilização. </li><li> Descongelar secções do cérebro, à RT durante 30 seg e fixar em 75% ETOH (1 min). </li><li> Para LCM de neurónios individuais lesados ​​de fixação, lavar as lâminas em água isenta de RNase (1 min), Contracoloração com 1% de violeta de cresilo (15-20 seg), lavar em água isenta de RNase (2 x 30 s), a mancha com Fluoro-Jade (4 min), lavar em água isenta de RNase (3 x 1 min), desidratar com ETOH a 95% feito de água isenta de RNase (30 seg), 100% de ETOH (30 seg), e xileno (2 x 3 min). </li><li> Para LCM de faixas de neurónios após a fixação, lavar as lâminas em água isenta de RNase (1 min), com 1% de mancha violeta de cresilo (1 min), lavar em água isenta de RNase para (3 x 1 min), com 95% de desidratar ETOH (2 x 30 s), ETOH a 100% (2 x 30 segundos), e xileno (2 x 3 min). </li><li> Ar seco em todas as seções um exaustor por 15 min antes da LCM. Slides podem ser armazenados os lados, seção-se, em uma caixa de lâminas revestidas com dessecante, se eles precisam ser transferidos de sala em sala. No entanto, os melhores resultados são obtidos se LCM é realizada imediatamente após cortes são secos. LCM deve ser limitado entre 30 minutos e 1 hora. Na seção seguinte, descrevemos primeiro como capturar trechos contínuos de células, o que é eaSIEST de dominar para aqueles que estão aprendendo esta técnica. Em seguida, descrevemos como precisamente captar neurônios individuais. No nosso processo, identificamos neurónios moribundos por sua afinidade para Fluoro Jade-um marcador de neurónios em degeneração. Células Fluoro-Jade-negativos se presume estar sobrevivendo neurônios. </li></ol> 3. Laser Microdissecção Captura (LCM) LCM de faixas de populações enriquecidas de neurônios do hipocampo <ol><li> LCM é realizada usando um microscópio PixCell IIe com um laser de diodo infravermelho (Life Technologies). </li><li> Ajuste o joystick centro para a posição vertical. Gire e bloquear o objetivo 4X na posição. </li><li> Coloque um slide no centro da platina do microscópio e ajustar manualmente até que a região do hipocampo está em vista. Use os ajustes de foco grosso e fino para trazer a imagem em foco. </li><li> Activar o mandril de vácuo pressionando o botão de vácuo no controlador. Gire e bloquear a objetiva de 10X em place. Concentre-se novamente com ajustes grosso e fino. </li><li> Carregar o CapSure Macro LCM tampas (Life Technologies) para o módulo de cassete CapSure e a posição de um tampão na posição da linha de carga. Gire o braço Colocação Cap e posição ao redor da tampa. Elevar o braço de posicionamento Cap para remover a tampa do módulo CapSure cassete. </li><li> Gire o braço Colocação Cap sobre a lâmina e abaixar o braço para baixo sobre o slide, o que irá colocar a tampa no slide. Ajuste o foco fino e mova o joystick para verificar se as células estão dentro do círculo preto na tampa. Todas as capturas células devem estar dentro deste círculo preto. </li><li> Defina os parâmetros do laser. Primeiro, pressione o botão do laser habilitar no controlador. O local alvo laser será visível como um ponto-de-rosa no campo de visão do monitor do computador. </li><li> Definir o tamanho do ponto de laser de pequenos (7,5 mm) para focar o laser e ajustar a potência e duração de 65-75 mW, para 1,0-2,0 msec, conforme necessário para a captação celular óptimo. </li><li> Para teª a laser, utilize o joystick para mover o ponto de laser para uma área onde não existem células para pegar. Disparar o laser utilizando o botão do polegar. Use o joystick para mover o ponto de laser de distância do local polímero fundido e verificar para ver se um anel visível escuro circunda uma área livre onde o laser foi disparado. </li><li> Para capturar as células, utilize o joystick para mover o ponto de laser sobre a área das células de capturar. Disparar o laser utilizando o botão do polegar. Mover o joystick quando disparar o laser para capturar uma grande área de células. Quando o laser é disparado derrete a película de polímero termoplástico sobre a tampa para a superfície das células alvo. O polímero absorve a radiação laser, o que não altera o RNA do DNA, ou proteína assegurar a integridade da amostra para futuras aplicações moleculares. </li><li> Depois de disparar todas as células de interesse, levantar o braço Colocação Cap. As células capturadas irá separar-se da secção de tecido e adere à tampa CapSure. O tecido remanescente e células ausentes serão visvel no campo de visão. As células da tampa também pode ser visto através da colocação da tampa sobre uma parte vazia do slide. </li><li> Levante o braço Colocação Cap e girá-lo para o Cap Unload Station. Abaixe a tampa na estação e girar o braço Colocação Cap de volta à sua posição anterior. </li><li> Deslize a ferramenta de inserção CapSure ao longo da plataforma e no tampão. Levantar a ferramenta a partir da plataforma. A tampa permanecerá ligado. Tocar levemente a tampa para a almofada CapSure limpo para limpar o tecido indesejado. </li><li> Colocar a tampa no tubo de 0,5 ml de RNase livre preenchido com 100 ul de tampão de lise obtido a partir do kit de isolamento Micro-RNAqueous. Imediatamente a tampa de vórtice durante 30 segundos para lisar as células. Incubar as amostras a 42 ° C durante 30 min e congelamento a -80 ° C até que o isolamento de ARN. </li></ol> LCM de um único FJ + neurônios no hipocampo <ol start="15"><li> Para capturar células individuais, coloque CapSure HS LCM tampas no módulo cassete CapSure e positisobre uma tampa na posição da linha de carga. Gire o braço Colocação Cap e posicioná-lo em volta da tampa. Elevar o braço de posicionamento Cap para remover a tampa do módulo CapSure cassete. </li><li> Definir o tamanho do ponto de laser de pequenos (7,5 mm) para focar o laser e ajustar a potência do laser e da duração de 65 mW para -75 0,45-0,50 msec para captura celular óptimo de células individuais. </li><li> Gire o braço Colocação Cap sobre a lâmina e abaixar o braço em direção ao slide. Isto irá colocar a tampa no slide. O Capsure HS superfície tampa senta elevada da amostra durante LCM. </li><li> Use o joystick para mover o laser mais simples FJ + células. Todas as células sendo capturados deve estar dentro do pequeno anel preto na tampa. Disparar o laser utilizando o botão do polegar. </li><li> Quando todas as células dentro da área do círculo preto foram disparados com o laser, levante o braço Colocação Cap. As células capturadas irá separar-se da secção de tecido e adere ao HS CapSure cap. </li><li> Coloque outro slide no microslidar fase e recolher FJ + células até que a tampa HS está cheio. Colocar a tampa no tubo de 0,5 ml de RNase livre preenchido com 40-50 ul de tampão de lise. Imediatamente a tampa de vórtice durante 30 segundos para lisar as células. Incubar as amostras a 42 ° C durante 30 min e congelamento a -80 ° C até que o isolamento de ARN. </li></ol> 4. Isolamento de RNA total a partir de amostras de LCM (Esta secção será apenas descrito na apresentação de vídeo) <ol><li> O RNA total de células é isolado utilizando o Kit de RNAqueous-Micro (Ambion), seguindo os protocolos do fabricante. Todos os reagentes e soluções de lavagem são fornecidos no kit. Pré-molhado o micro filtro conjunto de cartucho por adição de 30 ul de tampão de solução de lise para o filtro. Após 5 minutos, centrifugar o filtro durante 30 segundos a 10.000 x g. </li><li> Adiciona-se 3 uL de aditivo LCM ao lisado de amostra, pipeta para misturar e centrifugar. </li><li> Adicionar 52 ul de EtOH a 100% (1/2 volume) ao lisado de amostra; pipeta para misturar e transferir o lisado para o filtrocoluna. </li><li> Centrifugar a coluna de filtro a 10.000 × g durante 1 minuto para se ligar ao ARN para a coluna. Se existirem vários tampões para uma amostra, girar cada ligado através da mesma coluna separadamente. </li><li> Completar o processo de isolamento de ARN, tal como descrito no kit de RNAqueous Micro. </li><li> Realizar um tratamento com DNase e DNase inactivação das amostras de LCM de ARN, tal como descrito no kit, transferir os ARN a um tubo de RNase e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 5. RNA Quantificação e aplicações a jusante Avaliação da qualidade do RNA e quantificação é realizada com um Agilent Bioanalyzer utilizando os reagentes do kit de Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) seguindo o protocolo do fabricante. <ol><li> O RNA total é analisado num Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies). O software avalia a concentração e a integridade da amostra de ARN através da atribuição de um número de integridade do RNA (NIR) para cada f amostra variandorom 1 a 10. 1-5 indica RNA degradado e 7-10 indica RNA de boa qualidade. </li><li> Não degradados RNA intactas será usado para o Real-Time PCR; ensaios individuais Taqman ou RT2 matrizes de perfil utilizando Sybr-química verde. O ARN também pode ser utilizado para a análise de mRNA e análise microarray microarray microRNA. </li></ol>

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	<li>Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medial+temporal+lobe.">The medial temporal lobe.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).</li><li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function:+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior.">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li><li>Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+networks+to+brain+networks.">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li><li>Schouten, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+in+traumatic+brain+injury:+a+complex+struggle+against+the+biology+of+nature.">Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature.</a> Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).</li><li>Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+a+novel+fluorochrome+for+the+sensitive+and+reliable+histochemical+localization+of+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration.</a> Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).</li><li>Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade+and+silver+methods:+application+to+the+neuropathology+of+scrapie,+a+transmissible+spongiform+encephalopathy.">Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).</li><li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Fluid+Percussion:+Model+of+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice.">Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice.</a> J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+long-term+gene+expression+in+neurons+of+the+hippocampal+subfields+following+traumatic+brain+injury+in+rats.">Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats.</a> Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).</li><li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice.">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).</li><li>Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons.">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li><li>Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury.">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).</li><li>Elstner, M., Morris, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson's+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death.">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li><li>Chen, H., Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Profiling+of+Nucleus+Accumbens+Neurons+Projecting+to+Ventral+Pallidum+Using+both+Microarray+and+Transcriptome+Sequencing.">Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing.</a> Front. Neurosci. 5, 98 (2011).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons,+numbers+and+the+hippocampal+network.">Neurons, numbers and the hippocampal network.</a> Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).</li><li>Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+long-term+treatment+with+L-deprenyl+on+the+age-dependent+microanatomical+changes+in+the+rat+hippocampus.">Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus.</a> Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).</li><li>Schmued, L. C., Hopkins, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+novel+fluorochromes+for+detecting+toxicant-induced+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration.</a> Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).</li><li>Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+use+of+laser+capture+microdissection+to+selectively+obtain+distinct+populations+of+cells+for+proteomic+analysis--+preliminary+findings.">The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings.</a> Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).</li><li>Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunostained+frozen+sections+for+mRNA+analysis.">Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis.</a> Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).</li></ol>

Os autores declaram não ter nenhum conflito de interesse.

Esta técnica LCM nos permitiu fazer avanços significativos na compreensão dos mecanismos moleculares de TCE. 8,10,11,12,13 Fomos os primeiros a utilizar esta técnica para demonstrar que as sub-regiões distintas do hipocampo de ratos têm perfis de expressão de genes que correlacionam-se com a sua vulnerabilidade selectiva de lesões. Nossos estudos mostraram que podemos quantificar a expressão de genes, por qPCR, de apenas 10 células de laser capturados e que poderíamos realizar genoma análise de microarranjo de tão poucos como 600 células capturadas. LCM seria uma ferramenta útil em estudos semelhantes de outras regiões do cérebro que se sabe estarem implicados em diversos distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos. Por exemplo, estudos utilizando LCM lançaram luz na patogênese da doença de Parkinson em neurônios dopaminérgicos da substância negra, 14 e ajudado estudos do genoma de perfil de núcleo accumbens, que está envolvida em circuitos de recompensa implicados no substance desordens de abuso. 15 Heterogeneidade neuronal é reflectida ao nível do genoma e 16 podem contribuir para a falta de sucesso dos tratamentos experimentais para o TCE em ensaios clínicos. Assim, o nosso objetivo é utilizar essa técnica para investigar os elementos críticos que influenciam a sobrevivência neuronal após o TCE. O nosso estudo profiling recente do genoma de morrer e adjacente sobrevivente neurónios do hipocampo após TBI sugerido que um reostato celular que reflecte a proporção dos níveis de expressão de genes para a sobrevivência das células de morte celular regula o destino da célula após TBI. Estes estudos em curso vai contribuir para a concepção e desenvolvimento de estratégias farmacoterapêuticas que podem influenciar positivamente o reostato sobrevivência celular. Além disso, usamos atualmente LCM para rastrear e monitorar os efeitos de potenciais tratamentos com drogas terapêuticas em neurônios do hipocampo após TCE. Assim, nossos estudos demonstram que dadas cuidadosas técnicas de RNase de manipulação e algunsmodificações dos protocolos existentes, é possível a obtenção de amostras de ARN de alta qualidade a partir de LCM para análise quantitativa de expressão génica precisas. No entanto, existem algumas armadilhas associados a técnicas de LCM. Por exemplo, a recolha de apenas células neuronais sem qualquer contaminação microglia pode ser quase impossível. Na camada de células piramidais do hipocampo foi estimado que 95% das células são neurónios, com 90% desta população de células piramidais ser e interneurônios 10%, deixando uma pequena percentagem de tipos de células da glia e outros. 8,17, 18 Em nossos estudos, utilizamos Fluoro-jade um corante fluorescente que, especificamente, somente etiquetas neurônios lesados ​​no tecido cerebral. Uma mancha diferente que é um marcador para a GFAP seria necessária para corar microglia 19. Recolha apenas as Fluoro-jade coradas individuais corpos neuronais assegura uma população mais homogénea de neurónios. Outro problema comum que pode exigir a resolução de problemas é um círculo que hát definido quando o laser é disparado. Se isto ocorre, é necessário controlar os ajustes do laser e ajustar a potência e duração, conforme necessário. Também é importante para garantir que a tampa é colocada sobre o tecido liso e assentado corretamente no braço. Consultando o manual da LCM técnico ou ligar para o suporte técnico, por vezes, ser necessário. Seguindo LCM e isolamento de ARN, a qualidade do RNA devem sempre ser avaliada utilizando um Bioanalyzer antes de qualquer análise da expressão do gene. Existem vários tipos de instrumentos de captura a laser atualmente no mercado, incluindo o corte a laser (Life Technologies, Leica Microsystems) e laser catapultando (Zeiss) instrumentos. O nosso sistema LCM funciona bem para a captura de pequenos números de células. Outros sistemas de alto rendimento e mais automatizado pode ser mais adequada para a obtenção de um maior número de células para a análise genómica e proteómica particularmente. Na verdade, LCM usando esses sistemas automatizados tem um grande potencial para a análise de protein expressão em células identificadas ou populações enriquecidas de células. 20 Além disso, LCM podem facilitar a análise de expressão de genes de células immunolabeled, 21, permitindo-nos a investigar a expressão de genes em tipos de células definidas independentemente da complexidade nos tecidos mais heterogéneos. Assim, LCM é uma excelente ferramenta para a ponta estudos moleculares de populações simples ou enriquecido de células.

A análise da expressão do gene de tecidos heterogéneos tem sido problemático,. Isto é particularmente verdadeiro no cérebro dos mamíferos, que possui cerca de 5.000 tipos de células diferentes de 4 Antes do desenvolvimento da microdissecação de captura laser (LCM), a técnica, os estudos genômicos dos efeitos da TBI in vivo foram baseadas na análise da expressão de genes de uma população mista de células cerebrais compreendidos, não só de diferentes tipos de células neuronais, mas também de células gliais de apoio e imunomoduladores. Os perfis de expressão resultantes complexos de genes obtidos a partir desses tecidos heterogéneos e os padrões frequentemente contraditórios de lesões induzidas por sinais celulares, pode ser uma explicação para a falha em ensaios clínicos humanos de estratégias terapêuticas mostrado eficaz em estudos pré-clínicos de TBI 5. Para se obter uma compreensão clara da lesão induzida pela expressão do gene em populações vulneráveis ​​de neurónios de rato a partir do quadrilpocampus, foi adotada a técnica de LCM, pela primeira vez por et al Emmert-Buck. 3 Posteriormente, modificado e aperfeiçoado esta técnica de microdissecção para captura eficiente de populações enriquecidas de neurônios e neurônios individuais para perfis mRNA usando quantitativa PCR em tempo real e análise de microarray . Para manter a integridade do mRNA em secções congeladas de tecido cerebral de análise genómica, modificamos protocolos existentes para a fixação, a coloração e captura rápida de neurónios de secções de cérebro de rato congelados. Para identificação e isolamento de feridos e moribundos neurônios do hipocampo, também otimizou a técnica de coloração Fluoro Jade-para LCM. Fluoro-Jade não faz distinção entre a morte celular por apoptose e necrose. Assim, todos os tipos de neurónios em degeneração pode ser detectada por esta mancha 6,7. Aqui, descrevemos o protocolo utilizado em nosso laboratório para obter piscinas de neurônios morrem ou sobrevivem, assim como trechos de enriquecido populatiComplementos de diferentes tipos de células neuronais (ou seja, CA1-CA3 neurônios para análise de expressão gênica após TCE). O procedimento para a lesão de percussão fluido cérebro realizado no nosso laboratório é descrito em detalhe em Shimamura et al., 8 e é muito semelhante ao protocolo de lesão de percussão lateral do fluido, em ratos publicadas em JoVE por Alder et al. 9 Uma vez que a técnica tem LCM mostrado ter um efeito mínimo ou nulo sobre a integridade do DNA, RNA e proteínas nos tecidos, esta é uma excelente ferramenta para a análise molecular da proteína e de tipos de células definidas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PixCell IIe Laser Capture Microscope</td>
 <td>Life Technologies (Arcturus)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAqueous Micro- Kit</td>
 <td>Life Technologies (Ambion)</td>
 <td>AM1931 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capsure LCM caps</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>LCM0211/LCM0214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoro-Jade</td>
 <td>Histo-chem Inc.</td>
 <td>#1FJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cresyl Violet Acetate</td>
 <td>Sigma-aldrich</td>
 <td>C5042-10G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene (Histological grade)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>X3P-1GAL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
 <td>UTMB pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free barrier pipette tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> 
 <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> 
 <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica DM6000 B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury

De longo prazo da deficiência cognitiva após TCE está associada com lesão induzida neurodegeneração na região do hipocampo, uma no lobo temporal medial, que é fundamental para a aprendizagem, memória e função executiva. 1,2 Daí nossos estudos se concentrar na análise de expressão gênica de neuronal específica populações em sub-regiões distintas do hipocampo. A técnica de captura de laser microdissecção (LCM), introduzido em 1996 por Emmert-Buck et al., 3 permitiu avanços significativos em análises de expressão de genes de células individuais e as populações de células enriquecidas a partir de tecidos heterogéneos, como o cérebro dos mamíferos que contém milhares de tipos de células funcionais. 4 Usamos LCM e um modelo de rato bem estabelecido de lesão cerebral traumática (TCE) para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patogênese do TCE. Seguindo fluido percussão-TBI, os cérebros são removidos em tempos pré-determinados após a lesão, imediatamente congeladas em gelo seco,e preparados para seccionamento num criostato. Os cérebros de rato pode ser incorporado em OCT e seccionados imediatamente ou armazenados durante vários meses à temperatura de -80 ° C, antes de seccionamento por microdissecção captura laser. Adicionalmente, nós utilizamos LCM para estudar os efeitos do TCE sobre os ritmos circadianos. Para isso, vamos capturar os neurônios do núcleo supraquiasmático que contêm o relógio mestre do cérebro de mamíferos. Aqui, demonstramos a utilização de LCM para obter neurónios individuais identificados (lesionado e degeneração, Fluoro-Jade-positivo, ou não lesionado, Fluoro-Jade-negativa) e as populações enriquecidas de neurónios do hipocampo para subsequente análise da expressão do gene por PCR em tempo real e / ou todo genoma microarrays. Estes estudos LCM habilitados têm revelado que a vulnerabilidade selectiva de regiões anatomicamente distintos do hipocampo do rato são reflectidos nos perfis de expressão de genes diferentes de diferentes populações de neurónios obtidos por LCM destas regiões distintas. Os resultados dos nossos estudos de célula única, quandoComparando os perfis de transcrição de morrer e adjacente sobrevivente neurónios do hipocampo, sugerindo a existência de um reostato sobrevivência da célula que regula a morte celular e sobrevivência após TBI.

Em nosso estudo LCM primeiro, fomos capazes de mostrar que as sub-regiões funcionalmente distintas (CA1 e CA3) do hipocampo de ratos têm perfis de expressão gênica que refletem a sua vulnerabilidade ao TCE. Figura 8 1A-1C mostra captura a laser de neurônios piramidais do hipocampo (CA1- CA3), os neurônios giro dentado e neurônios SCN antes, e após LCM. Limpas de captura piramidal grânulo, ou neurónios do NSQ, respectivamente, são mostrados nas tampas de macro. Figura 2A-2B ilustra a morrer, Fluoro-Jade positivos neurónios piramidais e sobreviver, Fluoro-Jade negativos neurónios piramidais antes e depois LCM. A captura limpa do morrer ou sobreviver neurônios é mostrado exibindo as células capturadas nas tampas LCM. Depois de LCM, o RNA total pode ser utilizado para uma gama diversificada de estudos moleculares, incluindo a análise quantitativa por PCR em tempo real da expressão génica utilizando TaqMan ou químicas de SYBR Green (Figura 3A), pequeno focused matrizes de PCR com sondas de SYBR Green (Figura 3B) ou de estudos de genomas inteiros de microarranjos (Figura 3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figura 1. Laser microdissecção captura de trechos de populações de células definidas a partir do cérebro do rato. Congelados 10 secções coronais uM do cérebro do rato são fixadas em etanol, coradas com um (violeta de cresilo) mancha Nissl e preparados para LCM. São mostradas fotografias de hipocampo de rato e no núcleo supraquiasmático, antes e depois de os neurónios e as células LCM capturados como visualizado nas tampas de macro. A. piramidais de os subcampos CA1-CA3 do hipocampo de rato. Células granulares no giro B. hipocampo denteado. C. Bilateral núcleos supraquiasmáticos localizados em cada lado do terceiro ventrículoe localizada acima do quiasma óptico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figura 2. Laser microdissecção captura de neurônios do hipocampo de ratos. Mostrado são A. degenerando, Fluoro-Jade-positivos (com detalhes) CA3 do hipocampo neurônios e B. sobreviventes, Fluoro-Jade-negativo (sem manchas) CA3 neurônios antes e depois da LCM. Células capturados são visualizados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Análise de expressão gênica de RNA total isolado de neurônios a laser capturados. A. Dados quantitativos PCR em tempo real de expressão circadiano relógio gene em SCN. B. Heatmap da expressão gênica em morrer e sobreviver neurônios do hipocampo mostrando a expressão de genes relacionados com a apoptose, utilizando matrizes focados PCR . C. Agilent todo o genoma análise de microarray da expressão gênica em hipocampais CA1-CA3 neurônios de ratos que receberam ferimentos farsa, TBI ou TCE, além de um vírus recombinante siRNA adeno-associado projetado para knockdown expressão de genes induzidos por lesão cerebral (óxido nítrico neuronal sintase e glutationa peroxidase-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Nós descrevemos como usar microdissecção a laser de captura (LCM) para obtenção das populações enriquecidas de neurônios do hipocampo ou neurônios individuais a partir de cortes congelados do cérebro do rato feridos para posterior análise de expressão de genes usando quantitativa PCR em tempo real e / ou do genoma inteiro microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

laser-capture-microdissection-enriched-populations-neurons-or-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.1K visualizações.  University of Texas Medical Branch. Nós descrevemos como usar microdissecção a laser de captura (LCM) para obtenção das populações enriquecidas de neurônios do hipocampo ou neurônios individuais a partir de cortes congelados do cérebro do rato feridos para posterior análise de expressão de genes usando quantitativa PCR em tempo real e / ou do genoma inteiro microarrays.