Bu yazının eleştirel okuma Dr Jessica Dominguez RIEG teşekkür ederim. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (Scientist Kalkınma Hibe 10SDG2610034), Nefroloji American Society bir Carl W. Gottschalk Araştırma Bursu, Diyabet Ulusal Enstitüsü ve Akut Böbrek Yaralanma Araştırma Sindirim ve Böbrek Hastalıkları O&#39;Brien Merkezi (tarafından desteklenmiştir P30DK079337), ve Gazi İşleri Bakanlığı.

1. Çözümler <ol><li> % 0.85 NaCl: 8.5 g NaCl / 1 L GKD 2 O (8.5 g / L). </li><li> 0.5 mol / L HEPES pH 7.4 (GKD 2 0 0.5 L HEPES 59,6 g çözülür ve 10 N NaOH kullanılarak pH 7.4 ayarlayın). </li></ol> 2. FITC inülin enjeksiyon solüsyonu hazırlanması <ol><li> Tamamen eriyene kadar 90 ° C&#39;ye kadar ısıtma ile% 0,85 NaCl (genellikle 100 mg / 2 ml% 0.85 NaCl) içinde% 5 çözeltisi hazırlamak ve çözünmesi için FITC inülin tartılır. </li><li> Çözünmüş FITC inulin çözüm ve not ağırlığı tartılır. </li><li> Diyaliz membran bir 20 cm parça (molekül ağırlığı kesme: 1.000) kesin ve zarından kalan NaN 3 kaldırmak ve daha sonra birkaç kez temizlemek için 30 dakika GKD 2 O koymak. </li><li> Diyaliz membran içine FITC inulin çözünmüş doldurun ve kapakları olan düzgün mühür. </li><li> Tüm diyaliz membran tartılır. </li><li> 1 L% 0.85 NaCl içerisinde diyaliz membranı koyun ve Ro, 24 saat süre ile ışıktan korunan yavaşça karıştırınom sıcaklığı. </li><li> Tekrar tüm diyaliz membran tartılır ve (su ozmotik membran ve ilişkisiz FITC taşımak veya FITC inulin &lt;1.000 molekül ağırlığı membran dışına hareket edecek bağlı olacak, bu yüzden, FITC inulin konsantrasyonunu önemli ölçüde azalacaktır) yeni konsantrasyonu hesaplamak . </li><li> Yeni FITC inülin konsantrasyonu (c) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: C = N / V, burada n = başlangıç ​​FITC miktarda inülin, V = yeni birim (diyaliz artı başlangıç ​​hacmi önce ve sonra diyaliz tüp ağırlık farkı FITC inulin çözeltisi). </li><li> 0.22 um bir şırınga filtresi ile filtre edilerek diyalizlenmiş FITC inulin çözeltisi sterilize Kullanım öncesinde. </li><li> FITC inulin 4 ışık (alüminyum folyo) korunmaktadır tutun ° C Diyaliz edilmiş ve FITC inülin sterilize 2 haftaya kadar için kullanılabilir. FITC inülin birkaç dakika boyunca 90 ° C&#39;de yeniden çözdürüldü edilebilir katıldı. </li></ol> Not: kullanıyorsanızDiyaliz gerektirmez FITC sinistrin 16-18, diyaliz için gerekli tüm adımları atlanabilir. 3. Enjeksiyon ve Kan Alma <ol><li> Deneyden önce farelerin vücut ağırlığı (va) alın. </li><li> Izofluran ile kısa bir süre fareler anestezi. </li><li> 6 farelerin yüksek verimlilik için Şekil 3&#39;te verilen protokol takip edin. </li><li> (Ilk kez iğne bir G30 ½ geçiş sonra iğne bir G26 ½ kullanarak ve 100 ul Hamilton şırınga içindeki hava kabarcıklarını çıkarmak iğne bir G30 ½ kullanarak retroorbital pleksus 24 içine diyaliz FITC inulin 2 g / ml bw enjekte enjeksiyonu). </li><li> Bir kez makas ile fare kuyruğu 1 mm kesin ve 35, 15, 10, 5, 3, 7 kan toplamak, 56 ve Na-Heparin minicapillaries enjeksiyon sonrası 75 dk. Cha-mühür ile kan alımından sonra Seal minicapillaries. </li><li> Işıktan korunmalıdır örnekleri tutun. </li><li> Kapalı minicapillaries içinde hemato koymakcrit kılcal ve 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Bir 0.2 ml tüp içine pipetleme bir elmas kesici ve transfer tüm plazma kullanarak minicapillaries kırın. </li><li> Yeni bir 0.2 ml&#39;lik bir tüp (numune gece boyunca 4 ° saklanabilir ° C flüoresans ölçümü için) plazma 2 ul ve 18 ul 0.5 mol / L Hepes (pH 7.4) kullanarak, bir 1:10 seyreltme olun. </li><li> Çiftleri NanoDrop 3300 ile seyreltilmiş numunenin 2 ul ölçün. Aygıtının Gözde kullanım burada 5&#39;te açıklanmıştır. </li></ol> 4. Standartlar hazırlanması <ol><li> Heparin kaplı hematokrit kılcal aynı arka plan suşu farelerden alınan kan toplayın, aşağı spin ve 0,5 mol / L HEPES (pH 7.4) ile 01:10 sulandırmak; genellikle 80 ul plazma + 720 ul HEPES. </li><li> Aşağıdaki standart seyreltme almak için seyreltilmiş fare plazma ile FITC inulin enjeksiyon çözümü sulandırmak: 01:10: 10 ul FITC seyreltilmemiş inulin çözeltisi + 90 ul seyreltilmiş fare plazma 1:100: 10 ve Mu, L (1:10) solüsyonu + 90 ul seyreltilmiş fare plazma 1:1,000: 10 ul (1:100) solüsyonu + 90 ul seyreltilmiş fare plazma 1:2,000: 30 ul (1:1) solüsyonu + 30 ul seyreltilmiş fare plazma 1:10,000: 10 ul (01:05) çözeltisi + 40 ul seyreltilmiş fare plazma 1:20,000: 20 ul (1:1) solüsyonu + 20 ul seyreltilmiş fare plazma 1:100,000: 10 ul (01:05) çözeltisi + 40 ul seyreltilmiş fare plazma Standartların konsantrasyonu, diyaliz bağlı olacaktır ve her zaman FITC inülin her hazırlanması için farklı olacaktır. Bu yeni bir standart eğri için her zaman konsantrasyon girmek için gereklidir. </li><li> Burada 15, 20 dahilinde tarif edilen ve Örnek Sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi iki aşamalı bir üssel fonksiyon kullanılarak uygun yazılımı (örneğin, GraphPad Prism) ile GFR hesaplamak için veri analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Renal+Blood+Flow+and+Glomerular+Filtration+in+Normal+Man.">The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man.</a> J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).</li><li>Darling, I. M., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+"true"+creatinine+clearance+in+rats+reveals+extensive+renal+secretion.">Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion.</a> Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).</li><li>Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

Yazar Thermo Fisher Scientific tarafından bu yayının masraflarını karşılamak için fon aldı.

Bu çalışma, iki fazlı üssel bir azalma 8 kan örneklerinde floresans tek bolus enjeksiyonu ve analiz bilinçli farelerde GFR belirlenmesi için bir yöntem açıklanır. 1 fare bir GFH ölçümü 75 dakika sürer. Özel bir akış şeması kullanılarak, 130 dakika içinde 6 farelerinin GFR ölçmek mümkündür. Bu kadar günde 4 kez bu akış şeması protokolü tekrar ve 24 farelerde GFR ölçmek mümkündür. Daha hızlı ve araştırmacılar kuyruk ven ponksiyon göre gerçekleştirmek için daha kolay olan küçük bir kuyruk kelepir yerine kuyruk ven delinme, kan toplamak mümkün olduğunu bu nedenle bu yöntem değiştirilmiş. 10 ul hematokrit kapiller ve 1:10 seyreltme kullanılarak, &lt;100 ul için gerekli kan toplam miktarını azaltmak mümkündür. Son olarak, floresan seyreltilmiş numunenin 1-2 ul floresan belirlenmesine izin verir NanoDrop 3300 fluorospectrometer kullanılarak ölçülür. Bu yöntem, ilgili investigato verecekra gerçek GFR değeri. Buna karşılık, farelerde kreatinin ölçümleri &quot;kreatinin kör aralığı&quot; ve belirli ve hassas belirlenmesi ile ilgili zorluklar dahil olmak üzere birçok zayıf yönleri vardır. Böbrek fonksiyonlarının 50% 19 kaybolana kadar serum kreatinin normal sınırlar içinde kaldığından &quot;kreatinin kör aralığı&quot; GFH için bir belirteç olarak işlevini sınırlar. Gen X bir nakavt fare varsayarak bir yabani tip fare ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük GFH (% 40), bir olurdu: bazı araştırmacılar böbrek fizyolojisi ve patofizyolojisi çalışma araştırmalarında genetik olarak değiştirilmiş fareler kullanmak için, bu aşağıdaki sorun taşımaktadır plazma kreatinin karşılaştırarak basit tarama bu fark tespit olmaz. GFR belirlenmesi iyi bir doğru bir yöntem için ihtiyaç GFR&#39;de farklılıklar çok daha küçük daha kritik hale gelmektedir. Fareler ticari müdahale onların plazma ve idrarda olmayan kreatinin chromagens yüksek konsantrasyonlardaMevcut kreatinin ölçülür. Bunun bir sonucu olarak, plazmadaki alkali pikrat Jaffe reaksiyonu fazla tahmin kreatinin konsantrasyonu dayalı tahliller, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) tayini 6, 13 ile karşılaştırıldığında. Başka bir sınırlama serum kreatinin HPLC belirlenmesi göre aşağıda çeşitli ticari testlerin tespit limitleri olduğunu. Ancak, enzimatik reaksiyonlar araştırmacılar kullanarak fareler 10, 22 plazma kreatinin belirlemek başardık. Benzer bir dizi GFR benzer bir tek bolus enjeksiyon yöntemi hem de idrar FITC inülin açıklık 14 kullanılarak bilinçli bir farenin bulundu. Kendi protokolünün aksine, kuyruk kelepir kullanarak protokol özel önlem kuyruk ven veya safen ven delinme göre geminin bütünlüğünü korumak için gerektirmez. FITC inulin tabanlı idrar / plazma klirensi için cerrahi iki osmotik mi implant gereklidirnipumps. Iki pompa arka plan açıkça ayırt edilebilir yeterince yüksek sabit-durum plazma FITC inulin konsantrasyonları elde etmek için gereklidir. Bu aynı zamanda, bir tam ve idrar toplanması için metabolik kafesler arasında kullanımını gerektirir. Kafesler aksi durulama olmadan meydana FITC inulin 25-37% arasında bir kayıp hesaba durulanması gereken. Bu FITC inülin yöntemi kullanmanın tuzaklar sınırlıdır. Müfettişler şu farkında olmalıdır: (i) FITC-çözüm enjeksiyon için kullanılan şırınga içinde hava kabarcığı olduğunu temin ederim, (ii) tam retrobulber enjeksiyon enjekte miktarı hesaplanan GFR belirler çünkü elde, ve olmalıdır ( iii) fareler, böylece böbrekler konsantrasyon yeteneğinin bir sonucu olarak, çok yüksek bir FITC inülin konsantrasyonuna sahip olacaktır idrar, kan örneği ile karışmasını 75 dakika GFR deney sırasında muhtemelen idrar kaçınır. Genel avantajları oF Bu FITC inülin yöntemi aşağıdakileri içerir: (i) (ii) (III) &#39;tahlilinde, bilinçli farelerde yapılabilir, aynı fare ölçümler birden çok kez tekrarlamak mümkündür, radyoaktif olmayan bir tekniktir ( iv) idrar toplama gereklidir, ve (v) Yüksek verimli bir seçenek kullanılabilir. Tek bir bolus enjeksiyon için dezavantajlar artık kullanılabilir ve özel bir minyatür cihaz 18 kullanılarak transkütan ölçülebilir daha iyi bir FITC işaretleyici, FITC sinistrin kullanılarak aşılabilir FITC inulin diyaliz ihtiyacını içerir. GFR ölçülür olsa da, bu yöntem ile akışkan veya iyonların fraksiyonel idrar ölçülmesi mümkün değildir. Birlikte ele alındığında, bu yöntem, bilinçli farelerde GFR ölçmek için yüksek verimli bir yöntemin uygulanabilirliğini içerir. Bu nedenle, bu teknik farelerde böbrek fonksiyon belirlenmesinde ilgilenen diğer araştırmacılar için ilgi çekici olabilir.

Glomerulus de plazma ultrafiltratında oluşum oranı renal fonksiyon (glomerüler filtrasyon hızı, GFR) değerlendirmek için temel haline gelmiştir. GFH belirlemek için ideal bir işaretleyici serbestçe, filtre salgılanan veya emilir ne ve metabolize olmamalıdır. Böyle bir davranış inulin için doğru bulunmuştur ve inülin klirensi GFR 3 belirlenmesi için altın standart haline gelmiştir. Kreatinin klirensi yaygın olarak, insanlarda ve hayvanlarda GFR bir ölçüsü olarak kullanılır ise, kreatinin ideal GFR marker gereklilikleri yerine getirmemektedir. Yaklaşık 10 - insanlarda kreatinin klirensi% 40 aktif tübüler sekresyon 1, 11 sonucudur, ve kreatinin böbrek salgısı da fare ve sıçan 4, 7, 9, 22 belirgindir. Böbrek fonksiyon bozukluğu GFR 1, 2 bir belirleyicisi olarak değerinin sınırlar kreatinin tübüler sekresyon arttırdığı bilinmektedir. Daha önce organik anyon taşıyıcı izoformu göstermiştir3 (OAT3) faregiller böbrek kreatinin sekresyon 22 katkıda bulunur. Bununla birlikte, tipik olarak inülin klirensi radyoaktif etiketli inulin (3 H ya da 14 ° C) kullanımını gerektirir. Inulin radyoaktif belirlenmesi anestezi ve bilinçli hem farelerde kullanılan, ancak çok sayıda güvenlik yönetmeliklerine ve radyoaktif izotopların kullanımı ile doğal katı işleme konularda dezavantajları barındırıyor olabilir. Bu doğrultuda, GFH belirlenmesi için cerrahi boşluk hazırlıkları zaman alıcı hem de doğada terminali bulunmaktadır. 1999 yılında Lorenz ve arkadaşları. 12 anestezi farelerde tek nefron GFR bir göstergesi olarak FITC inulin tanıttı. Beş yıl sonra Qi ve ark. 15 FITC inulin kullanarak bilinçli farelerde tüm böbrek GFR belirlenir. Alternatif protokolleri artık bilinçli ve anestezi farelerde GFR ölçmek için dışsal belirteç olarak FITC inulin kullanıyorsunuz. Bu protokoller, floresan detecti kullanılarak radyoaktif inulin duyarlılığı korumakve bir radyoaktif etiketli işaretleyici ile çalışma dezavantajları engellemeyi. FITC inulin testi NanoDrop 3300 fluorospectrometer en microvolume yeteneği yararlanmak diğerleri 7, 8 ve bize 22, 23 tarafından güncellenmiştir. Bu GFH ölçüm başına &lt;100 ul kan için gerekli olan toplam örnek hacmi azaltarak sağlar. Yöntem ve bu yayında sağlanan yüksek verimlilik protokolü ile, biz günde 24 bilinçli fareler için ölçüm GFR fizibilite göstermektedir. Bu teknik fare GFH okuyan diğer araştırmacılar için yararlı olabilir ve biz bu tür kreatinin ve kan üre azotu olarak böbrek fonksiyonu için endeksleri, daha az doğru yöntemlerinin yerini umuyoruz.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

Glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ölçümü böbrek fonksiyonu değerlendirmede altın standarttır. Şu anda, araştırmacılar endojen biyolojik kreatinin veya eksojen uygulanan radyoaktif etiketli inulin (3H veya 14 C) düzeyi ölçülerek GFR belirler. Kreatinin ~ 50 toplam renal kreatinin atılımının% ve bu nedenle kreatinin için proksimal tübüler sekresyon hesapları güvenilir bir GFH belirteç olmadığı önemli dezavantajı vardır. Gerçekleştirilen deney ile ilgili olarak, inülin klirensi intravenöz, bolus enjeksiyonu ya da sürekli infüzyon (damar içine ya da ozmotik mini-pompa) tarafından tespit edilebilir. Her iki yaklaşım sırasıyla, plazma veya plazma ve idrar toplama gerektirir. Radyoaktif etiketli inulin başka dezavantajları izotoplarının kullanımı, hayvanların zaman alıcı bir cerrahi hazırlanması ve bir terminal deney gereksinimi bulunmaktadır. Burada, tek bir bolus enjeksiyon kullanan bir yöntem tariffloresein izotiosiyanat-(FITC) işaretli inulin ve seyreltilmiş plazma 1-2 ul kendi floresans ölçümü. Fare başına 8 kan koleksiyonları ile, iki bölme modeli uygulayarak, özel bir iş akışı protokolü kullanarak günde 24 fareler için GFR ölçmek mümkündür. Bu yöntem, yalnızca sigara ölçülü ve uyanık fare toplanan tüm kan örnekleri ile kısa izofluran anestezi gerektirir. Başka bir avantajı da birkaç ay ve tedaviler (örneğin diyet değişikliği ya da ilaç uygulamaları ile eşleştirilmiş deneyler yaparak) bir süre boyunca farenin takip etmek mümkün olmasıdır. Biz ölçüm GFR bu tekniği fare böbrek fonksiyonu okuyan diğer araştırmacılar için yararlıdır ve bu plazma kreatinin ve kan üre azot gibi böbrek fonksiyonu, tahmin daha az doğru yöntemlerinin yerini umuyoruz.

GFR aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: GFH = n / (A/K1 + B/K2), burada n = enjekte miktarı (n = c • V, burada c = FITC inulin konsantrasyonu, V = enjekte hacmi) A = Span1, eleme y-kesmek Ortadan kaldırılması için sürekli K1 = çürüme B = Span2, y-kesişim dağılımının Dağıtımı için K2 = çürüme sabit Not: A, K1, B ve K2 GraphPad Prism, iki fazlı üstel bozulma analiz yeteneğine sahip her yazılım tarafından verilen kısaltmalar kullanılabilir, ancak, diğer bilimsel yazılım farklı kısaltmalar kullanabilirsiniz. Plazma FITC inülin konsantrasyonu esas iki fazlı bir üssel bir azalma eğri uyum, kullanılarak, Şekil 1 &#39;de gösterilene benzer bir eğri elde edilmelidir. Yukarıda gösterilen formül (GFR tarafından hesaplanması ve burada tarif &lt;)&gt; 20 destek tip 1 diabetes mellitus (Şekil 2) ile farelerde bulunan Böbrek işlevinde 15 veya glomerüler hiperfiltrasyon 8, 23 değer düşüklüğü algılamasını sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> Şekil 1. Bilinçli farelerde GFR ölçmek için, tek bir doz intravenöz enjeksiyonu takiben FITC inulin plazma kinetiği kullanılır. GFR hesaplanması için, iki bölümlü bir modeli kullanılmıştır. İki bölme modeli olarak, ilk hızlı bir bozulma faz dışı sıvı için intravasküler bölmesinden FITC inulin dağıtılması temsil eder. FITC inulin konsantrasyon yavaş çürüme ile daha sonra faz,, ağırlıklı olarak plazmadan sistemik klirensi yansıtır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> Şekil 2. DetectioN vahşi tip farelerde diyabet hiperfiltrasyonun. diyabet (STZ, birbirini takip eden 5 gün boyunca 50 mg / kg) intraperitoneal uygulaması streptozosin ile indüklendi Tip I. GFR önce (taban) ve 5 hafta diyabet indüksiyon sonrasında tespit edilmiştir. Tübüloglomerüler geri bildirim nedeniyle, proksimal geri emiliminin bir birincil artışın, erken diyabetik hiperfiltrasyon 21 vahşi tip farelerde tekrarlanabilir bir bulgu neden olan (n = 10, p &lt;0.01 &#39;e karşı taban aynı fare). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> Şekil 3,. 6 farenin bir dizi GFR ölçümü. Tek bir bolus enjeksiyon yöntemiyle tüm böbrek GFR ölçmek için akış şeması, 8 kan örnekleri 10, 15, 35, 56 ve 75 dakika sonra, 7, 3, 5 toplanmalıdır FITC inulin enjeksiyon. Sayılar zamanlarını göstermektedir. Parantez içindeki sayılar örnek sayısını gösterir. Dikey kırmızı çizgi sol zaman noktalarında enjeksiyon gösterirzaman noktalarında (0, 11, 22, 33, 44 ve 55 dakika). Her fare farklı bir renk ile işaretlenir. Ardışık kan koleksiyonları almak için okları takip edin. Gri kutular bir sonraki fare enjeksiyon önce izofluran anestezi için hazırlanmış olması gerekir bunu gösterecek. Bu protokolü kullanarak farklı farelerden alınan 2 kan koleksiyonları arasındaki minimum süresi 1 dk.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice at JoVE.com

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ölçümü böbrek fonksiyonunun değerlendirilmesi için altın standarttır. Burada iki aşamalı bir üstel bozulma modeli ile plazma ve GFR hesaplanmasında tek bolus enjeksiyon, floresein izotiyosiyanat belirlenmesi (FITC)-inulin kullanarak bilinçli farelerde GFR belirlenmesinde sağlayan yüksek verimli yöntem açıklanmaktadır.

Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

a-high-throughput-method-for-measurement-glomerular-filtration-rate

Research

JoVE Journal

Biology

43.1K Görüntüleme.  University of California, San Diego. Glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ölçümü böbrek fonksiyonunun değerlendirilmesi için altın standarttır. Burada iki aşamalı bir üstel bozulma modeli ile plazma ve GFR hesaplanmasında tek bolus enjeksiyon, floresein izotiyosiyanat belirlenmesi (FITC)-inulin kullanarak bilinçli farelerde GFR belirlenmesinde sağlayan yüksek verimli yöntem açıklanmaktadır.

Video: A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biyoloji

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

Çevre Örneklerinde Organik P Yüksek Verim Ölçme ve Sınıflandırma

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis</emYüksek Verim Genotiplendirme için 96-iyi Tabaklar ve Domates Tesisleri>

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Fizyoloji Laboratuvarı Gösteri: Bir Sıçan Glomerüler Filtrasyon Hızı

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...