We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

1. Bir Ekstrasellüler Flux yürütülecek olan arabelleğe Güç Ölçme: İki Variations NOT: hesaplamalar ve burada açıklanan yöntemler, bir Ekstraselüler Akı Analyzer kullanılarak geliştirilmiştir. Diğer enstrümanlar için ölçüm hacmi uygun ölçekli olmalıdır. <ol><li> Üretici talimatlarına göre (Materyaller ve Ekipman bakınız) HCl konsantre kullanılarak su içinde 0.1 M standart HCl hazırlayın. Not: Tüm dört enjeksiyon çıkışlarından kullanım için HCI enjeksiyonları hazırlanması için bir örnek hesaplaması, Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir: </li></ol><img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> Tablo iyi bir hücre dışı akı tahlil içine 1. Ardışık HCl enjeksiyonu. <ol start="2"><li> Ortam içinde HCI standart dilüe carr olan teknik çoğaltır sayısı için Tablo 1 &#39;de olduğu gibi denenmektedir edilmesibir tabak içinde ied, artı bir pipet hatası sağlamak için; örneğin, liman dört teknik çoğaltır A enjeksiyonu için, (48.9 ul x 5) tahlil ortamında (1.1 ul x 5) 0.1 M HCl bir stok hazırlamak. </li><li> Ölçüm probu kartuşunun her Liman A içine 50 ul dağıtın. Kalan limanlar B, C, ve D için bu yordamı yineleyin </li><li> Dört liman eklemeler her biri için [2 dakika karıştırın, 1 dakika bekleyin ve 5 dk ölçümü] iki döngü izledi standart kalibrasyon döngüsü ile bir hücre dışı akı tahlil 10, Run (bakınız Şekil 2). <ol><li> Yazılım talimatlarına göre alet yazılımı yukarıda deneyi programlayın. Makinenin içine hazırlanmış kartuşu yükleyin ve yazılım talimatlarına göre kalibrasyonu yapın. </li><li> Program tarafından istendiğinde, kalibrant içeren plaka kaldırmak ve iyi aracı haline her tahlil ortamı içeren plaka takın; programı devam ettirin. </li></ol></li><li> U<html> daha önce gelen kararlı durumda elde edilen 8-10 veri noktaları (genellikle son 8-10 puan) ortalamasını şarkı ve her port ilavesinden sonra, standart asidin her enjeksiyonundan kaynaklanan pH (ΔpH) olarak (kümülatif) farkı hesaplayın. </li><li> Nmol H karşı ΔpH Plot + ölçüm probu tarafından yakalanan 7 ul hacminde içeriyordu. Doğrusal eğim mph / pmol H + tamponlama gücü (BP) &#39;dir. </li><li> Alternatif olarak adımları 1,2-1,3, Tablo 2&#39;de olduğu gibi Liman D&#39;de bir HCI enjeksiyonu takiben bağlantı noktaları A, B, ve C Bir deney için kullanılan bir deneyde, aşağıdaki ΔpH ölçümleri yürütmek dört teknik eşlemeler Hücre dışı akı analiz plakasının (dört arka plan sıcaklık düzeltmesi kuyular hariç) 20 deneysel kuyularda 5 puanlık bir standart eğrinin her noktası oluşturmak için kullanılan. </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; Iyi bir hücre dışı akı tahlil içine Tablo 2. Tek HCl enjeksiyonu. 2. Harici pH Metre Kullanımı arabelleği Güç Ölçme Not: Harici bir pH sondasını kullanarak bir maddenin tamponlama gücünü ölçmek 37 ° C&#39;de sondasını ayarlamak ve deney süresince her reaktifler için bu sıcaklığı korumak için. <ol><li> Üretici talimatlarına göre HCl konsantre kullanılarak su içinde 0.1 M standart HCl hazırlayın. </li><li> Sıcak pH probu, pH standartları olan tamponlama kapasitesine ölçülecek deney ortamı, ve bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar 0,1 M HCI. </li><li> Üretici talimatlarına göre 37 ° C&#39;de pH sondasını kalibre edin. Bir ısı plakası ya da su banyosu kullanılarak analiz boyunca 37 ° C&#39;de tüm reaktifler koruyun. </li><li> Kısım küçük bir cam bardak veya konik tüp içine tahlil ortamı 10 ml. Sürekli bir dalmış pH prob kullanılarak pH&#39;ı izleyin. </li><li> Şu şekilde 0,1 M HCI ekleme10-20 ul alikotları orta söylüyorlar. <ol><li> Bir karıştırma çubuğu kullanarak veya elle her asit ilavesinden sonra kabı dönen karıştırma emin olun. </li><li> PH ölçümü stabilize etmek için bir kaç saniye sonra her eklemeden sonra pH&#39;ı kayıt izin verin. </li><li> Tablo 3&#39;te görüldüğü gibi, ilave yeterli sayıda doğru eğim hesaplama sağlamak ve deney sırasında beklenen pH aralığını karşılamak için tercih. </li></ol></li></ol><img alt="Tablo 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> Tablo 3. pH metre kullanılarak tamponlama gücü ölçümü. Veriler 0.1 M HCl altı 20 ul eklemelerle tipik bir deney temsil etmektedir. <ol start="6"><li> Nmol H + karşı komplo ΔpH tamponlama gücü (Şekil 1) temsil eden bir lineer eğim vererek, 7 ul başına katma. </li></ol> Şekil 1. tamponlama gücü belirlenmesi. HCI standart eğri Tablo 3&#39;te aşağıdaki Tablo 1, Tablo 2 (burada) &#39;deki gibi ölçülür. Lineer eğri uyum eğimi tamponlama gücü (pH / nmol H + 7 ul içinde) elde edilir. Her nokta n ± SEM = 9 teknik çoğaltır ortalama temsil eder. <ol start="7"><li> Tamponlama gücü Yöntem 1 veya yukarıdaki 2 ile bilinen kez iktidarı tamponlama ile ECAR bölerek PPR (pmol H + / dak / mg protein) için ECAR sinyali (mph / dak) dönüştürmek (BP) (mph / pmol H +) ve her bir kuyu protein içeriği ölçekleme: PPR tot (pmol H + / dak / mg protein) = ECAR (mph / dak) / BP (mph / pmol H + 7 ul) iyi (ug) başına / protein Denklem 6 </li><li> Alternatif olarak, Yöntem aynı deneyleri kullanmaks 1 ya da 2 otomatik veri toplama sırasında PPR hesaplamak için cihaz yazılımı tarafından kullanılan arabelleği Kapasitesi (BC) değerini hesaplamak için. NOT: Cihaz kullanım kılavuzu 12 (sayfa 107) hesaplanması ve M.Ö. olarak açıklanan tamponlama kapasitesi, kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlar BC (mol / L) = mol H + / (ΔpH x tampon hacmi (L)) Denklem 7 Not: Denklem 7&#39;de tanımlanan tamponlama kapasitesi, yukarıda tarif edilen cihaz veya harici pH probu deneylerinde hesaplanabilir. Tamponlama gücü ve tamponlama kapasitesi arasındaki Dönüşüm kolayca (ekli e-tabloyu bakınız) yapılır: BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + 7 ul) / 7 ul) Denklem 8 NOT: tahlili yapmadan önce Eğer biliniyorsa, tamponlama kapasitesi deneysel kurulum sırasında cihaz yazılımı doğrudan girilebilir. </li><li>Önceki yayın 6&#39;da tarif edildiği gibi, bu yordamı ve çoğu geleneksel tampon sistemlerinde yukarıda kullanılan hesaplamaları uygulanır. NOT: Tablo 4 tamponlama gücü ve çeşitli geleneksel medya tamponlama kapasitesi. </li></ol><img alt="Tablo 4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> Tablo 4. Tamponlama gücü ve seçilen medya tamponlama kapasitesi. 3. C2C12 Miyoblast Hücreleri Kullanarak Hücre dışı Akı Testi Sahne Not: Aşama 3.4.3 içinde, CO 2 açısından farklılık varlığını HCO 3 CO 2 tam dönüşümü için gerekli olmadığını öne C2C12 kültüründe karbonik anhidraz varlığına asit üretimi bağlıdır -türevli vardı - + H +. Ancak, ampirik farklı deneysel sistemlerde bu test om önce öneriliritting karbonik anhidraz. <ol><li> Kültür fare C2C12 11,1 mM glukoz, 2 mM glutamin,% 10 h / h cenin sığır serumu (FBS), 100 U Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) içinde% 95 hava /% 5 CO2 altında 37 ° C&#39;de 13 miyoblastlar / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin. </li><li> Testten 24 saat önce için 20.000 hücre, aynı kültür ortamında 100 ul plaka / tohum hücre / oyuk, herhangi bir ek kaplama ile 24 oyuklu polistiren hücre dışı akı deney plakası (Malzemeler ve Yöntemler bölümüne bakınız). </li><li> , FCCP oligomycin seyreltilir ve Krebs Ringer fosfat HEPES (KRPH) deney ortamı (2 mM HEPES, 136 mM NaCI, 2 mM NaH 2 PO 4, 3.7 mM KCI, 1 rotenon artı myxothiazol ve 10x son konsantrasyona HCI (isteğe bağlı) mM MgCI2, 37 ° C&#39;de 1.5 mM CaCl2,% 0.1 w / v yağ asidi-içermeyen sığır serumu albümini, pH 7.4) eklenmiştir. </li><li> Hücre hazırlığı <ol><li> 30 dakika önce tahlil için, ge aspire yapışık hücreler üç defa yıkamakntly kuyudan orta kaldırmak ve daha sonra yavaş yavaş 500 ul KRPH sözlerine ekledi. </li><li> Hava altında 37 ° C &#39;de, üçüncü bir yıkama aşamasından sonra hücreler inkübe (değil% 5, bu bikarbonat içermeyen ortamın pH değerini değiştirdiklerini CO2 altında). </li><li> Deney başladığında, ek bir alt-tabaka ile, 500 U / ml, karbonik anhidraz ve ya glikoz (10 mM) veya sadece ortam içeren 500 ul taze KRPH kuyularda KRPH değiştirin. </li></ol></li><li> Sensör kartuşu yükleme <ol><li> Liman A: 2 ug / ml oligomycin Port B: 0.5 uM FCCP, Port C (analizdeki nihai konsantrasyon da verilebilir) aşağıdaki gibi hücre dışı bir akış algılayıcısı, kartuşun kartuş bağlantı noktalarına Aşama 3.3&#39;te hazırlanan her bir 10x bileşik pipetleyin 50 ul tam bölünen miktarları : 1 uM rotenon, 1 uM myxothiazol, Port D: HCI (yukarıda ve Tablo 2&#39;de tarif edildiği gibi bir in-deney asit kalibrasyon gerçekleştirmek ise). NOT: Tüm solunum zincir engellenmesi amacı Burada anlatılan için, 1 uM benimxothiazol 1 uM antimycin A ile değiştirilerek kullanılabilir </li></ol></li><li> Ekstrasellüler akış deneyi: <ol><li> 10 de tarif edildiği gibi, solunum kontrol belirlenmesi için standart bir hücre dışı akı tahlili gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> NOT: Deneyin her segment için, karışımı belirlemek bekleyin ve ölçüm süreleri kesimi başına döngü yanı sıra numarası, istenilen. NOT: Tablo 5&#39;teki veriler üç deney çevrimleri tamponlama kalibrasyonu için HCI (farklı miktarlarda Port D ilave edildikten sonra meydana gelen, 2 dk karışımı, 1 dakika bekleyin ve her segment için 5 dakika ölçüm iki deney çevrimi üzerinde toplandı Tablo 2 deki gibi gücü). <img alt="Tablo 5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> Tablo 5. Hücre dışı akı tahlil yapılandırması. 4. Measuring sonu nokta Laktat Konsantrasyon Not: azaltılması (2 dakika boyunca), ilk hızının ölçümü geleneksel bir 96 oyuklu plaka içerisinde direkt olarak belirlenebilir hücre dışı bir akı deneyin sonunda bazı farklı sistem, son nokta laktat konsantrasyonu burada tarif Dolaylı tahlil doğrulamak için NAD + → NADH, bizim daha önceki yayında 6 ayrıntılı olarak tarif laktat dehidrojenaz ile katalize. Örnek Sonuçlar sunulan veriler için, glükoz-ihtiva eden test gözlerine bitiş noktası laktat konsantrasyonu ~ 40 uM idi. <ol><li> 2x hidrazin orta hazırlayın: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hidrazin, pH 9.8 22 ° C&#39;de),. Hemen deney başlamadan önce, 40 U / ml 4 mM ve laktat dehidrojenaz (LDH) NAD + ilave edin. Nihai deney ortamı bileşimi (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM, hidrazin, 2 mM NAD +, 20 U / ml LDH. </li><li> Hemen hücre dışı akı tahlili sonra, 100 kaldırmaOpak bir (siyah) bir çukuruna hücre dışı akı deney plakası ve iletiminin her kuyudan tahlil ortamı 96-çukurlu plaka ul. </li><li> Her bir numune için, 100 ul 2x hidrazin orta ekleyin. </li><li> Hemen bir mikro-okuyucu plaka yük ve 340 nm uyarma / 460 nm emisyon NADH floresan izleme başlar. </li><li> Yaklaşık 2 dakika boyunca başlangıç ​​hızı kaydedilir. </li><li> 0 ila 50 uM ilave laktat konsantrasyonları için laktat konsantrasyonuna karşı başlangıç ​​hızını gösteren standart bir eğri oluşturmak için benzer bir deney başlat. </li><li> Her deneysel iyi standart eğri kullanılarak laktat konsantrasyonunu hesaplayınız. </li></ol> 5. Protein İçeriği Ölçme <ol><li> Deney plakasının her bir oyuğuna kalan deney ortamını çıkarın. </li><li> Alt kuyu yüzeyindeki hücrelerin yerini değiştirmemek en aza indirmek için dikkatli olmak, BSA içermeyen KRPH ul wells 250 ile üç kez yıkayın. </li><li> 25 ul RIPA lizis ekleortamı (150 mM NaCI, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA,% 1 h / h Triton X-100,% 0.5 w / v sodyum deoksikolat,% 0.1 h / h SDS, 22 ° C&#39;de pH 7.4) deney plakasının her oyuğuna. </li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde plaka inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 1200 rpm&#39;de bir plaka karıştırıcısı üzerinde çalkalayın plaka. </li><li> Liziz tamponu bileşimin ölçümü yöntemi ile uyumlu hale getirmek için, bir BCA aracıyla, örneğin, standart yöntemler, protein konsantrasyonu ölçümü. Şekil 2&#39;de deneyde protein içeriği ~ 4 ug / oyuk oldu. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).</li><li>Renner, K., Jansen-D&#252;rr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption.">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).</li><li>Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+production+in+glycolysis-impaired+tumors+provides+new+insights+into+tumor+metabolism.">Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism.</a> Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li><li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Seahorse Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).</li><li>Blau, H., Chiu, C., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+human+heterocaryons.">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons.</a> Cell. 32, 1171-1180 (1983).</li></ol>

Dr. Shona Mookerjee o hiçbir rakip mali çıkarlarını sahip olduğunu beyan eder. Dr Martin Brand Bu maddede kullanılan araçlar ve reaktifler üreten Seahorse Biosciences için görüşmelerini tamamladı. Bu yazı için Açık Erişim ücretleri Seahorse Biosciences tarafından ödendi.

Hücre dışı asidifikasyon hücresel metabolik hızının kolayca ölçülebilir bir göstergesidir. (Laktat üretimi tarafından tanımlandığı gibi) düzgün bir deney ortamı tamponlama gücünü bilmek önemlidir hücresel glikoliz oranını belirlemek için, ve üretim oranları proton, oksijen tüketimi ve asitlenme dışı akı ölçümlerini dönüştürmek. Bu hesaplama gerçekleştirilmesi ile, sitrik asit döngüsünde serbest CO 2 kaynaklanan asidifikasyon laktat üretimi ile sonuçlanan asitlenme bırakarak çıkartılabilir. Bu düzeltme için tamponlama gücünü ölçmek için burada verilen çok farklı şekillerde, farklı avantaj ve dezavantajlara taşırlar. PH sondası kullanılarak Dış ölçüm son derece doğru ve tekrarlanabilir, ancak deney plakası, deney sırasında bileşiklerin eklenmesi ya da t mevcudiyetinde içinde ihtiva floroforlar ile getirilen pH tespiti küçük farklılıkları yansıtmayabilirO hücrelerin kendileri. In-plaka pH ölçümleri bu konuları ele, aynı zamanda deneysel gürültü değişen derecelerde tanıtmak. ECAR CO 2 Düzeltme ilk kez glikolitik oranı net ve kantitatif hesaplama sağlar ve bir deney sırasında, toplam ECAR solunum ve glikolitik katkı değişimini göstermektedir. Denklem 5 ve OCR, ECAR ölçümlerini kullanarak, güç ve tamponlama, glikolitik hızı sağlanan basit bir tablo (Tablo 6) kullanılarak hesaplanabilir. 6 istenirse bu oran post-hoc laktat ölçümü ile kontrol edilebilir. Pentoz fosfat yüksek ölçüde aktif olan hücrelerde, örneğin 6-aminonicotinamide olarak yolu inhibitörleri kullanımı glikolitik hız izole etmek için yararlı olabilir. Her iki CO 2 katkılarının hesaplanması - toplam ve laktat türevi H + Ekstra Hücresel Asidifikasyon Oranı ve Oksijen Tüketim ölçüleniyon Oranı metabolik aktivite konusunda güçlü ve nicel ifadeler yapmak dışı akı verilerini kullanmak için paha biçilmez bir araçtır. Tamponlama gücünün ölçülmesi ve araştırma ve istenen veri altında hücreleri için hücre dışı bir akış deneyi optimize etmek için çeşitli değişiklikler dahil olmak üzere, burada tarif edilen prosedürler kullanılarak, dokunulmamış hücrelerde glikoliz oranı, deney şartlarının geniş bir yelpazede altında belirlenebilir. Bu yöntem, bir polistiren yüzey (yapıştırılabilir ya da hücreler veya organellerin) yapışık kültürde büyüyebilen hücreler ile sınırlıdır. Kültürlenmiş hücreler homojen ve konfluent olduğunda yararlı veriler yine de bu bir koşul aralığı üzerinde elde edilebilir olsa en güvenilirdir. Hesaplamalar k hücreleri ise, ancak farklı alt-tabaka ve kısmi oksidasyon 6 daha tam oksidasyonu için 0.65 ile 1.0 en fazla H + / O olarak 2 aralıkları, hücrelerin metabolizması bilgisine ihtiyaçnown glikoz oksitlenmesi için, 1.0 bir değer kabul edilebilir. Sistemlerinde kullanıldıklarında tüm metabolik karakterizasyonu ile ilgili, bu yöntem özellikle yararlı olabilir rağmen burada solunum yolu ve aynı zamanda glikolitik metabolizması arasında bir kayma hücresel ATP kaynağı kök hücre ve tümör kaynaklı kanser hücreleri karakterizasyonu dahil olmak üzere, önemli bir fenotipi muhafaza etmek. Bu ve diğer bağlamlarda metabolik kontrol değişiklikleri anlamak bu hücre tiplerinin deney tasarımı ve analizi sofistike ve doğruluk yüksek derecede sağlayacaktır.

Bu yöntemin genel amacı doğru dışı akı analizi kullanılarak hücrelerin glikolitik oranını ölçmektir. Dışı asitlenmesine kullanarak glikolitik oranı kantitatif ölçümü birçok deneylerin istenilen uç noktasıdır. Bununla birlikte, hücre dışı asidifikasyon oranı toplam iki bileşenden toplamıdır: Solunum asitleştirme, CO (2 CO 3 daha sonra HCO 3 ayrışmaktadır H nemlendirir - + H +), 2 şeklinde, ve aynı zamanda glikolitik asitleştirme formda + H + - laktat. Toplam dışı asitleşmeye CO 2 katkıları yakın zamana kadar burada kullanılan ölçüm platformu, XF24 analizörü 7 önemsiz kabul edilmiştir. Ancak, 2 dışı asitleşme 4-5 büyük katkı olabilir CO çoklu diğer sistemlerde açıktır. Çoklu kağıtlar Bu con kabultribution, ancak asit 3,8,9 -türevlenmiş CO 2 doğrudan kantitatif çalışmayın. Biz son zamanlarda bu CO 2 üretimi, bu sistemde 6 hücre dışı asitleşme önemli bir kaynağıdır kantitatif gösterdi. Glikoz katabolizma gelen CO 2 üreten çok sayıda metabolik yol olmasına rağmen Dahası, bu sitrik asit döngüsü matris dehidrogenazlar tarafından yürütülen ezici katkıda ve tüm diğer kaynaklar deneysel hata 6 dahilinde CO 2 miktarını oluşturur. CO2 üretimi için düzeltilmesi olmadan, hücre dışı asitleşme oranı dolayısıyla glikolitik belirsiz bir göstergesidir ve kantitatif kullanılamaz. Daha önceki yayın solunum CO 2 bile genellikle öncelikle glikoliz 6 kullanmak inanılan hücrelerde toplam asitlenme sinyalinin toplu oluşmaktadır çeşitli örneklerini vurgulamaktadır. Buna ek olarak,Toplam asitleştirme solunum CO2 katılım bir deney farklı aşamalarında glikolitik oranının doğru karşılaştırma CO2 için düzeltme gerektiren gösteren yaygın metabolik profil deneyleri sırasında büyük ölçüde değişir. Hücre dışı asidifikasyon oranını kullanarak hücrelerin glikolitik hızını ölçmek için, üretilen toplam H + değişim pH değişiklikleri dönüştürmek ve sitrik asit döngüsünün çalışması sırasında ortaya çıkan CO2 neden olduğu hücre dışı asidifikasyon çıkartılması gerekli olmaktadır. Burada, (O 2 konsantrasyonunda hücre dışı değişiklikler elde edilmiş) ve CO2 üretimi (pH hücre dışı değişiklikler ve kalibre edilmiş deney ortamı tampon gücünden) hücre dışı bir proton üretim hızının ölçülmesi için basit bir yöntem tarif eder ve glikolitik hızı nasıl hesaplanacağını gösterir, Bu ölçümleri kullanılarak. Bu yöntem, mukavemet<html> laktat üretimi ile tanımlanan düzgün glikolitik oranını hesaplamak için kullanarak hücre dışı asitleşme ölçüm programı ens. Solunum CO 2 (ya da laktat doğrudan ölçümü) için düzeltme olmadan, belirlemek mümkün olup olmadığını ve toplam asitlenme hızı laktat üretiminin doğrudan ölçümü olarak toplam hücre dışı asitlenme kullanmak deneyler yorumlanması karıştırıcı, glikolitik oranını yansıtan ne ölçüde. HESAPLAMA CO 2 ve laktat deneysel hata içinde vardır, miyoblast hücreleri 6 deneylere dayalı dışı asit üretimi için sadece iki katkıda. Dolayısıyla, toplam hücre dışı asidifikasyon (PPR proton üretim oranı) oranı olarak tanımlanabilir: PPR tot = PPR solunu + PPR glisin Denklem 1 . _content &quot;&gt; tot = toplam; solunu = solunum, glisin = glikolitik Glikolitik PPR böylece: PPR glisin = PPR tot - PPR solunum Denklem 2 İşte, PPR tot = ECAR tot / BP Denklem 3 burada ECAR = dışı asitleşme oranı (mph / dk) ve BP = tamponlama gücü (mil / pmol H + 7 ul), süre PPR resp = (10 pH pKa 1 / (1 ​​+ 10 pH pK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Denklem 4 burada K 1 = CO 2 hidrasyon ve HCO 3 ayrışma kombine denge sabiti - + H; max H + / O 2 = the CO glikoz 6 tam oksidasyonu gibi belirli bir metabolik dönüşüm için 2 -türevi asitlenme; OCR = oksijen tüketimi oranı (pmol O 2 / dk), ve OCR rot / myx = olmayan mitokondrial OCR. Denklem 4 (mitokondriyal solunum zehirler rotenone ve myxothiazol dayanıklı OCR olarak tanımlanan) ve maksimum H hesapları + her bir taban (max H + / O 2 için tüketilen O 2 başına üretilen olmayan herhangi bir mitokondrial OCR çıkarılarak mitokondrial OCR izolatlarının ) () 6 ya bakınız, yanı sıra deneysel sıcaklık ve pH (10 pH pKa 1 / (1 ​​+ 10 pH pKa 1 H + sebebiyet veren CO2 oranı). glukoz tam oksidasyonu için, mitokondriyal Oksijen Tüketim Oranı (OCR) CO 2 üretim hızının tam olarak eşittir. ekstrasellüler akı ölçüm sınırlı tahlil hacmi, CO 2 üretmeksolunum yoluyla d tahlil ortamında sıkışıp kalır. + H + - tuzağa CO 2 Çoğu sonra HCO 3 ayrışmaktadır H 2 CO 3 için hidratlanır. Küçük bir kısmı çözündürüldü kalır ama hidrate olmadığı ve HCO 3 CO 2 hidrasyon ve ayrışma sabiti ile birleştirilmiş denge termodinamik dikte edildiği gibi bir küçük bir kısmı, sulu, ancak ayrışmış değil - + H + deney sıcaklığında (37 ° C) ve pH (~ 7,4). Böylece, PPR tot olduğu PPR resp çıkarılarak PPR g hesaplanması için tam denklem: PPR glisin = ECAR tot / BP - (10 pH pKa 1 / (1 ​​+ 10 pH pK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Denklem 5 benn bu yolu, solunum ve glikoliz yanı sıra bunların ilişkili ATP üretim oranları oranları, kantitatif basit ölçümlerle (oksijen tüketimi, hücre dışı asitleşme, tamponlama kapasitesi) ve diğer gerekli değerlerin ithalat veya hesaplama (H + / O 2 belirlenebilir P / O ve denge sabiti K 1) 6. Burada anlatılan deney Seahorse XF24 10,11 olarak Ekstraselüler Akı Analyzer gibi kullanmak için standart teknikler genişletir; Diğer dışı akı ölçüm biçimleri (örneğin, XF e 96 ya da XFP) için, aşağıdaki tüm birimler uygun ölçekli edilmelidir. Deney ortamı tampon gücü, kalibre edilmiş bir pH sondasını kullanarak ya doğrudan hücre-dışı akı platformda veya ayrı olarak, standart bir eğri elde ile ölçülebilir. Burada dışı akı deney ortamı ile tamponlama ölçmek için üç seçenek tüm Injecti kullanarak da dahil olmak üzere, verilenHücre içermeyen örnek kuyu veya hücre içeren kuyu (bölüm 1) veya harici pH ölçümü (bölüm 2) kullanılarak yalnızca son enjeksiyon portu kullanarak dışı akı analizör portları. Örnek verileri tam hesaplamalar için ekli elektronik tablo bakın. Hücre dışı akı enstrümanın pH tespit yeteneğini kullanarak tamponlama gücünü ölçmek için, sinyal değişimi en aza indirmek için hücre içermeyen kuyuları kullanmak için güvenli olduğunu. Bununla birlikte, hata payı içinde, anlamlı bir fark hücre içermeyen ve hücre ihtiva eden bu ölçümü gerçekleştirirken kuyu (veriler gösterilmemiştir) arasında bulunmaktadır. Not: Adım 1.7&#39;de tarif edilen varyasyon gürültüsü sinyalinin dezavantaj, ilave bileşikler ile ya da hücrelerin varlığı ile kazandırılan tamponlama herhangi bir potansiyel değişiklikler hesaba olanaklar taşır. Yukarıda belirtildiği gibi, ancak, önemli bir fark, Tablo 1 &#39;de gösterilen hücre içermeyen tasarım arasında hesaplanan tamponlama gücü bulunan veBurada tarif edilen deney koşulları altında, Tablo 2&#39;de sonrası deney tasarımı. Ayrıca, küçük ΔpH aralıkları (&lt;0.4 ünite, deneysel iyi 0.2 ünite ile sınırlı) üzerinden, doğrusal eğimi Δ mph / pmol H çizilerek elde + yeterince ΔpH ve [H +] ile logaritmik bir ilişki yakındır. Bu standart eğrinin eğimi dolayısıyla 7 ul pH / nmol H + test edilen deney ortamı tamponlama gücünü temsil, veya mph / pmol H + 7 ul. Biz orta tamponlama gücünün artırılması ya da ölçüm süresinde 0.2 pH birimi değişikliği aşan numuneler için hücre yoğunluğu azalan öneririz. Ölçüm süresi de azalmış olabilir, ama bu kararlı hal asitlenme hızının kısaltmak ve hızı hesaplama içine hatayı tanıtmak olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pherastar FS</td>
			<td>BMG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF-24</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>extracellular flux instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF assay plate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>V7-PS</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38280</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5580</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonic anhydrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2624</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3991</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7004</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> Şekil 2 tipik bir deney için ham verileri gösterir. OCR ve pH (dikey barlar gölgeli) hem de point-to-point kayıt son 10 ölçüm noktası hesaplamalar için kullanılmıştır. İlk endişeler her tahlil döngüsünün ortalama değeri (orta noktası ölçümü), dışarı kaynaklı değildi liman ilave ve sürekli hal asitlenme hızının arasında hafif bir gecikme ortaya çıktı özellikle de doğru bir hesaplama için oran yeterli çözünürlüğü sağlamak olmaz Bu hesaplama hatası önemli ölçüde katkıda görünmüyor gibi (gösterilmemiştir). Doğru tamponlama kapasitesi deneysel kurulum sırasında girilen Alternatif olarak, eğer PPR enstrüman yazılımında veya veri çıkış ayarları biri olarak mevcut PC uyumlu bir biçimde PPR çıkışı göstererek enstrüman veri toplama okuma doğrudan okunabilir. ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2, O ve H + 2. Örnek hücre dışı akı izleri. OCR ve pH deney başlangıcında 10 mM glükoz ihtiva eden, Tablo 5 &#39;de bir örnek deney için izler. D çıkışı (bu ortalama izleri gösterilmemiştir) tampon gücü kalibrasyonu için farklı HCl konsantrasyonları. Önceki yayında 6 veriler. Her nokta n = 8 biyolojik çoğaltır ortalama ± SEM temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Temsili sonuçlar Veri analizi -Tabloyu Tablo 6&#39;da gösterilen bir ek olarak sağlanır kullanılarak, tek tek oyuklara veri değerleri sarı başlıkları ile gösterilen sütunlar girilebilir. Altı sütunları<html> Sağ bu girdileri hesaplanır. Tablo 6&#39;da örnek PPR resp ile ya da ekledi glikoz olmadan doğal koşullar, oligomycin önceki Limanı bir ek için ayrı kuyudan ECAR ve OCR verileri kullanılarak PPR glisin hesaplamalarını gösterir. Her biyolojik hazırlık Teknik çoğaltır normalde son dört sütun halinde çıkışların tek değerleri vermek için ortalaması alınır, daha sonra farklı biyolojik hazırlıklar veri hatası BP istatistik ve bu dört değerlerin uygun yayılımı ile ortalaması alınır. <img alt="Tablo 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> Tablo 6. Solunum ve glikolitik asitlenme hesaplanması. Sarı başlı Sütunlar değerler hesaplamadan girilecek gösterir (örneğin, BP, max H + / O 2), ya da veri toplama (örn, ECAR tot, OCR).<html> ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu tablonun büyük halini görmek için tıklayınız |. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">tıklayınız bir Excel elektronik olarak bu tabloyu indirmek için .</a> Düzeltme sonrası PPR için glikoliz ve solunum Katılımlar Şekil 3 FCCP ek (Liman B) Aşağıdaki yerli glikolitik ve solunum asidifıkasyon oranları, ek (Liman A) oligomycin aşağıdaki oranlara ve oranları Tablo 6&#39;daki olarak hesaplanan verilerin grafiksel çıkışını gösterir. Bu veriler açıkça substrat seçimi ile solunum ve glikolitik asitlenme değişim oranları (hiçbiri ile kontrol (CTL vs glikoz) eklenmiştir) nasıl göstermek ve mitokondriyal durumu (yerli fonksiyon vs farmakolojik fonksiyonu değişmiş) ile. &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> Glikolitik ve solunum kaynaklardan Şekil 3. Proton üretim hızı (PPR). Solunumla PPR (açık kısımları) ve katma glukoz (üç sol çubuklar) veya katma glikoz (üç sağ çubuklar olmadan) Denklem 5 kullanılarak hesaplanan C2C12 hücrelerinin glikoliz (dolu bölümleri). 6 ila veriler. Tüm veriler n ± SEM = 8 biyolojik çoğaltır ortalama temsil etmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate at JoVE.com

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

measurement-analysis-extracellular-acid-production-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

24.9K Görüntüleme.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Video: Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Biyoloji

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Canlı Mikroskopi ve Açık Kaynaklı Yazılım Kullanılarak Aspergillus nidulans Büyüme Hızının Nicel Analizi

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...