Göz morfogenezini anlamamız önceki sabit doku çalışmalarından gelmektedir. Ancak bu çalışmalarda hücre ve doku dinamikleri eksiktir. Zaman atlamalı görüntülemeyi kullanarak, tüm bu süreci görselleştirme ve analiz için yakalayabiliyoruz.
Zebra balığı embriyolarının optik netliğindeki dış gelişimden yararlanan, canlı görüntülemeyi kolaylaştıran ve çoğu araştırma kampüsünde kolayca bulunan lazer tarama konfokal mikroskopisini kullanan yöntemimiz. Bu yöntemde yeni olan araştırmacılar, kullanılabilir bir veri kümesi elde etmeden önce bazı deneme yanılmalar beklemelidir. Birçok adım, özellikle enjeksiyonlar ve gömme, başarı için iyi gitmelidir, bu yüzden sabırlı olun.
Zebra balığı üremeye başladığında, yumurtaların döllenmesini sağlamak için 15 ila 20 dakika beklerken, çekilen bir cam kılcal mikro enjeksiyon iğnesini RNA'nın ilgi seyreltmesi ile geri yüklemek için bir P10 pipet ve P10 mikrolitre uçları kullanın. Yumurtalar hazır olduğunda, yumurtaları enjeksiyon kalıbına dikkatlice yüklemek için bir transfer pipet ve bir diseksiyon mikroskobu kullanın, embriyoları tek hücrenin gerektiği gibi görünür olacak şekilde yuvarlaması için tokalar kullanın. Daha sonra tüm embriyoları tek hücreli aşamada enjekte edin, gelişmekte olan embriyonun düzgün bir şekilde etiketlenebilmesini sağlamak için yumurta sarısını değil hücreyi hedef edin.
Döllenmeden yaklaşık 11 saat sonra, E3 ortamına 42 santigrat derece ısı bloğunda% 1,6 düşük eriyik agarose bir ila beş mililitrelik bir aliquot yerleştirin ve genel floresan parlaklığına sahip başarılı bir şekilde enjekte edilen embriyoları taramak için floresan mikroskobu kullanın. Embriyoları düzgün bir şekilde sahneleyene kadar somitleri sayın. Döllenme sonrası 11 saatte üç somit gözlenmelidir.
İdeal bir örnek güçlü EGFP ve mCherry sinyallerine sahip olacak ve doğru gelişim aşamasında olacaktır. Monte etmeden önce, embriyoları ağar kaplı bir kaba yerleştirin ve her embriyodan korozyonu çıkarmak için önlük kullanın. Tüm embriyolar denuded zaman, bir embriyo aspire etmek için bir cam silindir pipet kullanın.
Mümkün olduğunca çok E3 fırlatın, böylece embriyo camın ucuna oturur Pasteur pipeti ve embriyoyu ısı bloğundan agarose tüpüne bırakın. Embriyo ile birlikte küçük bir agarose hacmi apire etmeden önce embriyoların agarose içine batmasına izin verin, embriyonun pipet ucunda kalmasına dikkat edin. Embriyoyu ve agaroseyu cam bir alt tabaktaki agarose damlacığı içine atlayın ve agarose damlacığı sertleşmeden önce embriyo dorsal tarafını aşağı yönlendirmek için hızlı ama dikkatli bir şekilde uzunlayıp kullanın.
Aynı şekilde 10 ila 12 embriyo monte ettikten sonra, tüm damlacıkları tek bir agarose diskinde kaplayan yemeğin altını tamamen kaplayacak kadar agarose ekleyin. Agarose sertleştiğinde, örnekleri nemli tutmak için agarose üzerinde E3 tabakası. Lazer tarama konfokal mikroskobu zaman atlamalı görüntüleme için uygun parametrelere ayarladıktan sonra, cam alt kabın altını suyun kırılma indeksine uyan daldırma ortamıyla serbest bir şekilde kaplayın, hava kabarcıklarından kaçınmaya özen edin ve 40X su hedefine küçük bir daldırma ortamı damlası uygulayın.
Cam alt kabı sahne kesici ucuna sabitleyin ve embriyoları gece boyunca nemli tutmak için ek E3 ortamı ekleyin. Plastik kapağı kabın üzerine kapatmak ve çanakla temas etmek için hedefi yükseltmek için modelleme kilini kullanın. Mikroskop yazılımının konumlar başlığı altında, zaman aşımına uğradırılacak ilk örneğin XYZ bilgilerini kaydetmek ve güçlü bir floresan ve optimum montaja sahip bir örnek seçmek için ekle'yi tıklatın.
Bul sekmesinin altında, bir sonraki örneği arayın ve gösterildiği gibi örneği seçmek için konum ve ekle'yi tıklatın. Tüm örnekler seçildiğinde, ilk konumu vurgulayın ve taşı'yı tıklatın. Sürekli tarama yaparken, optik veziklini çerçeve içinde hizalayarak ön ve distal bölgelerde optik vesiklin ve beyne göre geniş alan bırakın.
İlk ve son Z dilimlerini atamak için, optik kabın büyümesine uyum sağlamak için toplam dilim sayısını yaklaşık 63 olan ince odak düğmesiyle Z yönünde ilerlerken ilk ve son olarak ayarlayın'ı seçin. Büyüme için yer açmak için optik veziklinin ventral tarafına ilave oda ekleyin. İlk ve son Z dilimleri ayarlandıktan sonra, Z yığınının ortasına geçmek ve her iki lazer için lazer gücünü ve kazancını ayarlamak için C'yi tıklayın.
Lazer gücü ve kazancı ayarlandığında, taramayı durdurun ve konum bilgilerini güncellemek için güncellemeyi tıklayın. Bir sonraki konuma geçmek için ikinci konumu tıklatın. Hem ilk hem de son Z dilimleri gösterildiği gibi tanımlandıktan sonra, zaman serisi başlığını açın ve döngü sayısını 300'e ve zaman aralığını 2,5 dakikaya ayarlayın.
Her şeyin son halini verdiğinden emin olmak için ayarları gözden geçirdikten sonra, zaman atlamalı çalışmaya başlamak için başlat'ı tıklatın ve zaman atlamalının gece boyunca çalışmasına izin vermeden önce görüntülemenin ilk turunun doğru şekilde yakalandığını onaylayın. Tek hücreye doğrudan enjeksiyon, düzgün bir etiketleme ve sağlam bir floresan için gereklidir. Agarose'a daldırılmalarından sonra, embriyolar yemek boyunca eşit olarak yer almalıdır.
Embriyolar doğru, yeterince floresan ve yeterince monte edilirse, zaman atlamalı sırasında görüntüleme çerçevesinde kalır ve tüm organın görüntülenmesini sağlar. Yatay veya çapraz olanlar gibi dorsal eksen boyunca yönlendirilmeyen örnekler, zaman atlamalı ilerledikçe görüntüleme çerçevesinden çıkacak ve daha fazla analiz için kullanılamaz. Aşırı döndürülen bir embriyo daha arka zaman atlamalı olacaktır.
Az döndürülen bir embriyo sadece en ön dokunun gözlenmesine izin verecektir. Ek olarak, çerçevenin yönüne göre monte edilen örneklerin başarılı bir zaman atlamalı sonuç verme olasılığı daha yüksektir. Ventral tarafa yönelik bu önyargı, ventral yönde doku büyümesi için ekstra alan sağlar ve bu da optimum zaman atlamalı sonuçlanır.
Bu kriterler karşılanmadığında, zaman atlamalı artık doku geliştikçe tüm 3D hacmini yakalayamaz ve daha fazla analiz için kullanılamaz. Bu bilgi açısından zengin veri kümeleri, hücre hızı ve yörünge nicelikleri ile 4D hücre takibi, hücre ve doku hacmi ölçümleri ve 3 ve 4D görselleştirmeler dahil olmak üzere birçok şekilde analiz edilebilir.
