Bu protokol, kas hastalığını modellemek ve klinik öncesi terapötik testler yapmak için kullanılabilen insan iskelet kası ksenogreftlerini oluşturmak için kullanılabildiği için önemlidir. Bu ksenogreft modeli araştırmacılar daha iyi insan kas hücre biyolojisi anlamak ve nadir veya edinilmiş kas hastalıkları için yeni modeller geliştirmek için vivo insan kas çalışma sağlar. Bir insan kas biyopsisi aldıktan sonra, kas orta içeren bir 100-by-15-milimetre Petri çanak örnek yerleştirin ve kalan fasya veya yağ dokusu kaldırmak için bir stereo mikroskop ve cerrahi makas kullanın.
Kas biyopsisini yaklaşık 7'ye 3'e 3 milimetrelik parçalara ayırın ve liflerin numune içinde uzunlamasına olarak düzenlenmesine dikkat edin. Daha sonra, buzun üzerinde parçalanmış kas içeren Petri kabını aktarın ve sentetik, emilemeyen dikişleri %70 etanoliçeren 100 ila 15 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Sekiz ila 12 haftalık bir ayak sıkışması yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, anestezi NOD-Rag-gama fare, immüneksik hayvanın gözlerine merhem uygulamak, ve diz ayak bileği tibialis anterior örten saç kaldırmak için bir düzeltici kullanın.
Daha sonra, povison-iyot solüsyonu ve%70 etanol ile cerrahi bölgeyi dezenfekte etmeden önce bir dakika boyunca maruz kalan cilde tüy dökücü krem uygulayın. İnsan dokusunu aşılamak için, ilk fare bacak aşağı bant, ve tibialis anterior üzerinde düz bir kesi yapmak distal tendon kaynaklanan ve diz altında sonlandırıcı. Kas dokusundan cildi ayırmak için künt diseksiyon kullanın, ve daha az-0.5 milimetrelik kesi tibialis anterior kas epimiyyum yoluyla yapmak için makas kullanın, tendondan başlayıp diz de biten.
Tibialis anterior distal tendon kestikten sonra, iris forceps ile tendon kavramak, ve diz doğru kas çekin. Sonra, ekstansör digitorum longus distal tendon kesmek ve diz doğru ekstansör digitorum longus çekin. Peroneus longus kasının proksimal tendonu görünür olduktan sonra ekstansör digitorum longus ve makas ile tibialis anterior çıkarın.
Hemostaz elde edilene kadar hafif basınç uygulamak için PBS ile ıslak bir cerrahi silme kullanın ve proksimal peroneus longus tendonundan bir dikiş geçirin, tendonun her iki tarafında yaklaşık 1,5 inçlik bir iplik parçası bırakarak. Bir daire oluşturmak için sıkma olmadan iki el cerrahi kare düğüm ilk yarısında olun ve daire içine bir ksenogreft yerleştirin, greft doku güvenliğini sağlamak için döngü sıkma. Peroneus longus proksimal tendon ksen dikmek için kare düğüm diğer yarısını tamamlamak ve distal tendon kare düğüm tekniği tekrarlamak için distal peroneus longus tendon ile dikiş iplik.
Greftin her iki ucu da sabitlendiğinde, ksenogreftli kasın üzerine deriyi çekin, kesiyi cerrahi tutkalla kapatın ve yapıştırıcının üzerine 2-3 cerrahi zımba yerleştirin. Daha sonra fareyi tam yedek alana kadar izleyerek ısıtmalı bir ped üzerinde temiz bir kafese yerleştirin. Ameliyattan 4-6 ay sonra, ksenogreft hasattan önce en az 30 dakika boyunca kuru buz kutusuna 200 mililitre 2-metilbütan içeren kapalı bir kabı yerleştirin.
2-metilbütan soğuduktan sonra, ayak sıkışmayanıt eksikliği onaylamak, ve bir düzeltici ve tüy dökücü krem ile ayak bileğinden diz tibialis anterior örten saç kaldırın. Ksenogrefti yerinde tutan dikişler deri de gözlenmelidir. Bacağı bantla sabitleyin ve her iki dikiş ortaya çıkana kadar ksenogreft üzerinde deriyi açmak için makas ve iris forsepskullanın.
Peroneus longus kas ve gastroknemius kas arasında kesmeden önce ksenogreft bir tarafı serbest ksenogreft arasında kesmek için bir neşter kullanın. Distal sütür altında ve peroneus longus distal tendonu ile kesin ve altta yatan kas dokusuuzak ksenogreft kesmek için makas kullanırken diz doğru dikiş kavramak ve saptırmak için iris forceps kullanın. Daha sonra, ksenogreft ve peroneus longus kaldırmak için proksimal sütür üzerinde kesmek için makas kullanın ve karton küçük bir parça üzerinde hasat örnek yerleştirin.
Lif oryantasyonun ani dondurma işlemi sırasında korunacağını sağlamak için kasları hafifçe gererken dokuyu mümkün olduğunca dikişlere yakın sabitle. Pimler güvenli bir şekilde yerleştirildiğinde, kasları pimleri yukarı kaydırın, böylece doku karton un hemen üzerinde durun ve eksi 80 derece santigrat depolama için önceden soğutulmuş 2-metilbütan'daki ksenogrefti tutturun. Başarılı bir ksenogreft insan ait antikorlar ile tanımlanan insan miyofiberlerinin sağlam bir rejenerasyon gösterir.
Miyofenlerin bir oranı içinde pozitif embriyonik miyozin boyama rejenerasyon sürecinin hala devam ettiğini gösterir. Buna karşılık, kötü cerrahi teknik veya yetersiz bir örnek kas liflerinin kötü bir rejenerasyon yol açabilir. İdiyopatik inflamatuar miyopati tanısı alan bir hastadan yapılan ksenogreftler dört ve altı aylık koleksiyonlarda orta sayıda rejenere insan miyofiberi sergiler ve embriyonik miyozin boyama altı ayda devam eder.
İnflamatuar hücreler de ksenogreft içinde mevcuttur, H ve E boyama gözlenen gibi. Bireysel miyofiber boyutları idiyopatik inflamatuar miyopati ksenogreftlerinde dört ila altı ay arasında benzerdir. Ksenogreftlerde 3, 500 mikrometre karelik kesitsel alanı gösteren nadir lifler, idiyopatik inflamatuar miyopati biyopsilerinde gözlenmez, bu da ksenogreftlerde bulunan bazı miyoliflerin sağlıklı miyofiberlere benzer boyutta kesitsel alana doğru yenilenebildiğigörülür.
Bu işlemin en önemli kısımları, ilk kesi yapıldıktan sonra ayak bileğindeki tüm tendonların tanımlanması ve epimisyumu başarıyla kesmektir. Ksenogreftlerin fonksiyonel yeterliliği, tek miyoliflerin enzimatik olarak izole edilmesi ve kalsiyum geçicilerinin test edilmesi veya elektriksel stimülasyon sonrasında uyarılmış zorunlu ölçümler intibak ettirilerek değerlendirilebilir.
