Bu yaklaşım, rekombinant aşıların hızlı gelişimi için HVT genomuna diğer viral antijenleri tanıtmak için etkili bir yol sunmaktadır. Bu tekniğin bir diğer avantajı, kolay görselleştirme için önce kesici uça bir GFP ifade kasetinin eklenmesi ve daha sonra Cre-LoxP sistemi tarafından kaldırılmasıdır. Aynı yaklaşım HVT genomunun farklı yerlerinde daha fazla viral gen eklemek için kullanılabilir, veya multivalent rekombinant aşıların geliştirilmesi için diğer kuş herpes virüsleri.
Prosedürü gösteren Katy Moffat, hücre sıralama konusunda uzman olacaktır. Na Tang, Yaoyao Zhang ve Guanggang Qu, laboratuvarımdan bilim adamları. Transfeksiyon dan bir gün önce metin protokolünde belirtildiği gibi civciv embriyo fibroblastları hazırlayın.
Tohum 1.3 milyon hücre 2.5 orta mililitre her bir kuyu içine altı kuyu plaka. CeF hücrelerini her biri 0,5 mikrogram iki Cas9 kılavuz RNA plazmidi ile ve üreticinin talimatlarına uygun bir transfeksiyon reaktifi kullanarak donör plazmidin bir mikrogramını dönüştürün. Hücreleri 38.5 santigrat derecede %5 karbondioksitle 12 saat kuluçkaya yatırın.
12 saat transfeksiyon sonrası M199 kültür ortamı ile HVT virüs stoku mililitre başına 100, 000 plak şekillendirme birimleri konsantrasyonuna seyreltin. Transfected hücrelerin her kuyuya seyreltilmiş virüs 130 mikrolitre ekleyin. Negatif kontrol olarak transfected olmayan hücrelerin bir kuyu ayarlayın ve virüs aynı miktarda ekleyin.
Hücreleri 38.5 santigrat derecede %5 karbondioksitle üç gün kuluçkaya yatırın. Sıralamadan bir gün önce her kuyuya 20.000 hücre tohumlayarak iki 96 kuyu plakası hazırlayın. Üç gün sonra enfeksiyon transfected ve enfekte CEFs içeren altı kuyu plakaları almak.
Her kuyudan orta aspirat ve PBS ile hücre sayfasını durulayın. Her kuyuya %0,05 tripsin-EDTA mililitresini ekleyin ve hücreleri yaklaşık beş dakika boyunca %5 karbondioksitle 38,5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, FBS 50 mikrolitre ile hücreleri yeniden askıya ve 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp bu süspansiyon aktarın.
5 dakika boyunca 200 kat daha fazla yer çekiminde santrifüj. %1 FBS içeren bir mililitre PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri saymak ve hücre yoğunluğunu mililitre başına bir milyon hücreye ayarlamak için bir hemositometre kullanın.
Daha sonra, hücreleri süzgeç kapağından polistiren sıralama tüpüne aktarın. Bir hücre ayırıcıkullanarak, GFP'yi ifade eden tek hücreleri önceden tohumlanmış 96 kuyu plakasına sıralayın. Plakaları 38.5 santigrat derecede sıralanmış hücrelerle beş gün boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.
Beş gün sonra 96 kuyu plakaları kontrol etmek ve tek bir GFP pozitif plak içeren kuyuişaretlemek için floresan mikroskobu kullanın. Her GFP pozitif ini 50 mikrolitre tripsin-EDTA ile üç dakika boyunca deneyin. Daha sonra, hücreleri yeniden askıya almak ve CEFs ile altı kuyu plaka bir kuyuiçine bu süspansiyon aktarmak için kültür orta 50 mikrolitre ekleyin.
Üç gün sonra dondurucu ortamda rekombinant virüslerin ilk nesil her bir şişe aşağı dondurun. Bu hasat edilen virüsleri sıvı nitrojende saklayın. Virüslerin ilk nesil her 100.000 hücreleri toplamak.
Hücreleri 2,000 rpm'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. DNA çıkarma işlemi yapmaya hazır olana kadar hücreleri negatif 20 derecede saklayın. DNA ekstraksiyonu yapmaya hazır olduğunuzda hücre peletlerinin buzunu eritmek ve askıya almak için 50 mikrolitre ezme tamponu kullanın.
Örnekleri 65 derecede 30 dakika ve sonra 95 santigrat derecede iki dakika boyunca inceleyin ve proteinaz K.Perform apcr reaksiyonu ile her DNA örneğinin bir mikrolitresini kullanarak metin protokolünde belirtildiği gibi. Jel elektroforeziçin amplifikasyon ürünlerinin iki mikrolitresini %1'lik agarose jelin bir kuyuya yükleyin. GFP genini rekombinant virüsten çıkarmak için, CEF hücreleri ile preseeded edilmiş altı kuyu plaka içine Cre rekombinaz ekspresyonu plazmid iki mikrolitre transfect bir transfeksiyon reaktif kullanın.
Transfeksiyonsonrası 12 saat sıvı nitrojenden bir şişe rekombinant virüsünün buzunu çözer. Yavaşça virüs ve tohum 50 mikrolitre transfected hücrelerin her kuyuiçine, bir yanı sıra virüs aynı miktarda negatif kontrol ayarı askıya. Üç gün boyunca 38.5 santigrat derecede kuluçkaya yat.
72 saat enfeksiyon sonrası daha önce açıklandığı gibi sıralama için hücreleri hazırlamak. Tek floresan olmayan hücreleri, CEF'lerle önceden tohumlanmış 96 kuyulu bir tabak halinde sıralayın. Daha sonra, seçilen plaketleri deneyin ve metin protokolünde belirtildiği gibi ilgili hücreleri yeniden askıya alın.
Hücrelerin yarısını, ikinci nesil olarak CEF'lerle preseeded edilmiş 96 kuyuplakasının her kuyuya geçirin. Her klonun kalan hücrelerini beş dakika boyunca 200 kat daha fazla yerçekiminde santrifüj edin. Supernatant atın ve DNA çıkarma için bulaşıma tampon 50 mikrolitre ile hücreleri yeniden askıya.
Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi bir mikrolitre DNA şablonu kullanarak beş ana kavşak astarı ile PCR gerçekleştirin. PCR sonuçlarına göre daha fazla geçiş ve doğrulama için rekombinant HVT üç ila beş pozitif klonlar seçin. İlk olarak, bir preseeded 24 kuyu plaka rekombinant HVT ikinci nesil ile CEFs enfekte.
Enfeksiyondan 48 saat sonra kültür ortamını kaldırın ve hücreleri onarmak için PBS'de %4 paraformaldehit 500 mikrolitre ekleyin. 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Daha sonra fiksatifi çıkarın ve hücre katmanını PBS ile üç kez yıkayın.
PBS çıkarın ve hücreleri permeabilize için% 0.1 Triton X-100 500 mikrolitre ekleyin. 15 dakika sonra hücre tabakasını PBS ile üç kez yıkayın. Nonnonspecific bağlamayı engellemek için bir saat boyunca engelleme arabelleği ekleyin.
Daha sonra, birincil antikor anti-VP2 monoklonal antikor HH7 veya HVT enfekte tavuk serumu 1-200 bloke tampon seyreltmek. Her kuyuya seyreltilmiş primer antikor 200 mikrolitre ekleyin ve bir saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatın. Hücre tabakasını PBS ile üç kez yıkayın.
İkincil antikor keçi anti-fare IgG Alexa 568 veya keçi anti-tavuk IgG Alexa 488 bir ila 200 engelleme tampon seyreltmek. Her kuyuya 200 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
Protein ekspresyonunu kontrol etmek için floresan mikroskobu kullanın. Virüs genişlemesinden bir gün önce her T25 şişesine 2.6 milyon CEF hücresi girdi. En az üç pozitif klonları çözülür ve her şişeye bir şişe hücre veya virüs ekleyin.
Şişeleri %50 sitopatik etki gözlenene kadar %5 karbondioksitle 38,5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sonraki kültür orta iki mililitre hücreleri hasat. Yeni nesil cef hücreleri ile preseeded yeni bir T25 şişesi için 50 mikrolitre bulaştırmak.
En az 15 nesil boyunca rekombinant virüs passaging tutun. PCR kullanarak VP2 dizisinin varlığı için virüslerin her nesil analiz. Dolaylı bir immünoforesans tsay kullanarak VP2 ekspresyonunun her nesil virüslerini analiz edin.
Elde edilen saflaştırılmış virüs tek hücre sıralama sonra beklenen boyutta bir PCR ürün gösterir üç prime junction PCR tarafından analiz edilir. Cre recombinaz tarafından GFP muhabirinin eksizyonundan sonra plakların %50'den fazlası GFP ifadesini kaybetti. GFP eksizyonu sonrası saflaştırılmış plak tek hücreli sıralama ile elde edilir ve beklenen boyutta ürün gösteren beş prime junction PCR ile daha doğrulanır.
Protein ekspresyonu daha sonra VP2 spesifik monoklonal antikor ve anti-HVT tavuk serumu ile dolaylı immünfloresans tahkikat ile doğrulanır. Beklendiği gibi, ebeveyn HVT ile enfekte hücreler sadece anti-HVT serum ile lekeli olabilir. Rekombinant HVT enfekte hücreler açıkça VP2 geninin ekspresyonunu gösterirken.
Bir rekombinant virüs yüksek transfeksiyon hızı oluşturmak için virüs şansını en üst düzeye çıkarmak için gereklidir ve eklemek düzenleme gerçekleşmesi için aynı hücrede karşılamak için. Bu prosedürütaki rekombinant aşıların immünojenitesini ve etkinliğini değerlendirmek için hayvan deneyleri yapılabilir. Burada açıklanan CRISPR/Cas9 sistem platformunu kullanarak yeni çok yaygın vektör aşılarının geliştirilmesi, kümes hayvanları endüstrisinin birden fazla kümes hayvanı hastalığına karşı korunması açısından son derece yararlı olacaktır.
