Yazarlar Dr laboratuvarlarında geçmiş ve bugünkü üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Peter Palese ve NDVnin gelişimi için Adolfo García-Sastre genetik teknikleri ve teknik yardım için ters. NiaD R01AI088770 hibe ve Mükemmeliyet İç Güvenlik Bilim ve Teknoloji Merkezi Bölümü tarafından tarafından AG-S laboratuvarda Newcastle hastalığı virüsü Araştırma kısmen finanse Gelişen ve Zoonotik Hayvan Hastalıkları (CEEZAD, ödül sayısı 2010-ST-061-AG001). LM-S Araştırma laboratuvarında NIH hibe RO1&#39;e AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, Grip Araştırma ve Gözetleme (HHSN266200700008C) Mükemmeliyet NIAID Merkezleri ve biyosavunma Bağışıklık Modelleme için Rochester Merkezi Üniversitesi (HHSN272201000055C) tarafından finanse edilmektedir .

1.. Memeli Hücreleri hazırlanması (Şekil 4A, Gün 1) Bölünmüş HEp-2 ya da A549 hücreleri, 6 oyuklu plakalar içerisinde transfeksiyondan bir gün önce. Hücrelerin yoğunluğu ertesi gün% 80-90 ulaşması gerekmektedir. Genellikle, 100 mm tabak birleşik 8 kuyulara (kuyu başına 6 ila 10 x yaklaşık 1 hücreleri) ayrılabilir. Her virüs kurtarılmaya için, 2-4 farklı kuyular dahil edilmelidir, yanı sıra sırasıyla transfeksiyon ve MVA-T7 enfeksiyon verimliliği takip amaçlanmıştır kontrol pCAGGs-GFP ve GFP pCITE-18 için 2 ilave kuyular,,. 2. Bakteriyofaj T7 RNA polimerazı (MVA-T7) ifade Rekombinant Vaccinia Modifiye Ankara Virüsü ile enfeksiyon Memeli Hücrelerinin (Şekil 4A, Gün 2) <ol><li> 37 ° C&#39;de PBS 1x/BA/PS ve medya ısınmak </li><li> PBS 1x/BA/PS 1 ml ile iki kez, hücreler yıkayın. </li><li> Bir enfeksiyon çokluğu (en MVA-T7 virüs ile kültürlenen memeli hücreleri, Infect moi: 1) oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS / BA / PS 200 ul&#39;lik bir nihai hacim içinde pfu / hücre. </li><li> 3 de tarif edildiği gibi viral enfeksiyon inkübasyon sırasında transfeksiyon karışımı hazırlayın. </li></ol> 3. Memeli Hücreleri transfeksiyonu (Şekil 4A, Gün 2) <ol><li> Lipofectamine hazırlanması: kurtarma girişimi OptiMEM başına 250 ul LPF2000 1-2 ug karıştırınız ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> DNA hazırlanması: OptiMEM 50 ul her bir kurtarma için bir plazmid kokteyl yapın. 0,4 PTM1-NP ug PTM1-P, 0.2 ug, ve tüp başına PTM1-L 0.2 ug ekleyin. Her tüpe kurtarılmaya NDV&#39;nin tam boy cDNA klonu 1 ug ekleyin. Ayrıca iki kontrol transfections, pCAGGs-GFP 2 mikrogram ile birini (transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için) ve (T7 polimeraz MVA-T7 ile ifade tahrik kontrol etmek) pCITE-GFP 2 mikrogram ile diğer hazırlar. </li><li> LPF2000-OptiMEM solüsyonu, 5 dakika boyunca (adım 3.1) boyunca önceden kuluçkalanır sonra, ekleme 250DNA tüplere çözeltinin ul (3.2 adım) ve oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edilir. </li><li> MVA-T7 ile inkübasyondan sonra, aspirasyon ile virüs aşının çıkması ve DNA-LPF2000 transfeksiyon karışımı (adım 3.3) ile değiştirin. </li><li> Her yemeğin DMEM% 10 FBS / PS 1 ml ekleyin. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 6-8 saat (ya da gece boyunca) için enfekte / transfekte edilmiş hücrelerin inkübe edin ve daha sonra taze DMEM,% 10 FBS / PS 1.5 ml transfeksiyon ortamı değiştirin. </li><li> 24 saat post-transfeksiyon olarak, kontrol kuyuları transfeksiyon verimi (pCAGGs-GFP) ve T7 polimeraz aktivitesi (pCITE-GFP) (Şekil 5A) değerlendirmek için bir floresan mikroskobu altında gözlemlenebilir. Aşağıda tarif edildiği gibi kuş fibroblastlar ile enfekte / transfekte edilmiş hücrelerin ko-kültürü ile devam edin. </li></ol> 4. Avian Hücreler, memeli hücrelerinin ko-kültür (Şekil 4A, Gün 3) Genellikle, tavuk konfluent 100 mm doku kültürü çanağı (CEFS) or ördek (Defs) embriyoblastlarında iki transfekte kuyularının başına kullanılır. , Önceden, bütün kurtarma girişimleri başına kuş hücreleri yeterince 100 mm doku kültürü yemekleri hazırlamak için emin olun. Virüsün etkin kurtarılması için, DMEM,% 10 FBS / PS ortam alantoik akışkan, 30 mM MgCl2 ve% 5 ile takviye edilir. Bu noktada, 24 saat pi, memeli hücreleri nedeniyle MVA-T7 enfeksiyon, Şekil 5A&#39;da asevident için sitopatik etki (CPE) arası başlayabilir. <ol><li> 37 ° C&#39;ye kadar PBS 1x ve medya ısınmak </li><li> 1x PBS içinde 1 ml, 2x, memeli hücrelerini yıkayın. </li><li> Bu müstakil kadar EDTA-tripsin 0.2 ml memeli hücrelerini tripsinize edin. DMEM,% 10 FBS / PS 1 ml hücrelerin tekrar,% 5&#39;lik alantoik akışkan, 30 mM MgCI2 ve bir 100 mm doku kültürü çanağı transfer. Aynı medya 3 ml ekleyin. </li><li> 1x PBS içinde 4 ml ile iki kez, kuş hücreleri yıkayın. </li><li> Hücreleri ayırmak kadar 1 EDTA-tripsin ml ile tripsinize kuş hücreleri, 37 ° C&#39;de 1-2 dakika boyunca inkübe edin. Süspanse inci8 DMEM,% 10 FBS / PS,% 5&#39;lik alantoik akışkan, 30 mM MgCl2 ve 8 ml toplam hacim için ko-kültürlenmiştir 100 mm doku kültürü çanağı içinde memeli hücreleri tripsinize edilmiş hücre 4 ml eklemek e hücrelerin ml (4 ml memeli, kuş hücreleri 4 mi). </li><li> Yavaşça muntazam bir dağılımının ve daha sonra, 3-4 gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içinde yerleştirmek için, el ile 100 mm tabak içinde ko-kültür hücreleri sallayın. 3 ya da 4 gün memeli ve avian hücrelerinin ortak kültürden sonra yumurta enfekte edilmesi için kriterler (hücre yuvarlama, ölüm, yüzeyden ayrılması, vb.) MVA-T7 viral enfeksiyon gözlenmiştir ne kadar sitopatik etki bağlıdır. </li></ol> 5. Tavuk Embriyone Yumurta Enfeksiyon (Şekil 4A, Gün 6-7) <ol><li> Memeli ve avian hücrelerinin ko-kültür 3-4 gün sonra, yüzen doku kültürünün 1 ml çıkarın ve bir Eppendorf tüpüne ekleyin. </li><li> Bir tezgah içinde 12,000 rpm&#39;de 1 dakika için doku kültürü süpernatantı santrifüjhücresel enkaz kaldırmak için üst santrifüj. </li><li> Hava kesesi ve Allantoik boşluğu arasındaki arayüzünü görmek için bir ışık ışıklı denetim kutusunu kullanarak yumurta Mum. Arayüz sınır kan damarı yerelleştirme kaçınarak bir işareti yapmak. Steril koşulları kurmak için fazla yumurta% 70 etanol sprey. Yavaşça işaretli noktada kabuğu bir delik yapmak ve allantoik oyuğuna dikey ve doğrudan iğne amaçlayan, bir insülin (1 mi) şırınga kullanılarak süpernatan 500 ul inokülasyon. (Şekil 4B). </li><li> Erimiş mum veya parafin ile yumurta kabuğu içinde nick Seal. </li><li> 37 ° C sıcaklıkta 2-3 gün boyunca inkübe yumurta </li></ol> 6. Enfekte Tavuk Embriyone Yumurta dan Alantoyik Fluid (Şekil 4A, Gün 8-10) Hasat <ol><li> Tavuk embriyo öldürmek ve kan pıhtılaşmasını için 4 ° C&#39;de 2-4 saat veya gece boyunca enfekte edilmiş yumurta inkübe edin. </li><li> % 70 etanol (steril koşulların muhafaza edilmesi için) ile yumurta püskürtün. </li><li> Dikkatli bir kaşıkla hava boşluğunun üzerindeki yumurtanın apikal bölümüne dokunun. Yumurta kabuğu çatlamış sonra, forseps ile parçaları kaldırmak ve tam Allantoik zarı maruz. </li><li> Kan damarlarının zarar görmesini ve yumurta sarısı kaçınarak, forseps ve makas ile Allantoik membran kesilmesiyle Allantoik boşluğuna maruz. </li><li> Dikkatlice bir spatula ile embriyo aşağı doğru itin ve 10 ml pipet ile upflowing Allantoik sıvı (yumurta başına 8-12 ml) toplamak. Sarısı zarına zarar kaçının. Buz üzerinde bir 15 ml santrifüj tüpüne (yumurta için bir tüp kullanmak) için alantoik akışkan aktarın. </li><li> 1500 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ile, allantoik akışkanın açıklığa kavuşturulacaktır. Pelet bozmadan, yeni bir tüpe transfer süpernatant. </li><li> En fazla 1 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın örnekleri, hemaglütinasyon testi ile NDV nin varlığı için onları kontrol kadar. </li></ol> 7. Hemaglüsinasyon (HA) Deneyi Allant virüsün varlığıenfekte yumurtadan oik sıvı hindi, kırmızı kan hücrelerini (RBC) hemagglutinate kabiliyetleri ile makroskopik olarak belirlenebilir. NDV nin durumunda, ml başına yaklaşık olarak 10 birim oluşturan 6 plaka (pfu) HA deneyinde pozitif bir sinyal vermek için gereklidir. HA deneyler, V-dipli, 96 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir. Negatif (PBS 1x, bulaşmamış allantoik sıvı) gibi pozitif (herhangi NDV virüs allantoik sıvı) kontrol örnekleri her zaman doğrulamak için herhangi bir HA deneyde dahil edilmelidir. Bir HA deneyi gerçekleştirmek için: <ol><li> Pipet, bir V-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına PBS 1x 50 ul. </li><li> Pipet plakanın birinci sütun üzerindeki kuyu içine alantoik sıvı örneklerinin 50 ul. Plakanın geri kalanı ile 2 kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve son sütunda kuyulardan son, ilave 50 ul atın. </li><li> Kuyu başına PBS 1x 0.5% türkiye RBC 50 ul dağıtın. Hafifçe dokunarak plaka sallayın. </li><li> 4 ° C (ya da buz) f de inkübeya da 30-45 dakika ya da açık bir topak kadar negatif kontrol kuyuları oluşturulur. </li></ol>

<ol>
	<li>Lamb, R. A., Parks, G. D., Howley, P. H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2007).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li><li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Newcastle+disease+virus+from+cloned+cDNA:+evidence+that+cleavability+of+the+fusion+protein+is+a+major+determinant+for+virulence.">Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.</a> J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).</li><li>Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+lentogenic+Newcastle+disease+virus+from+cDNA.">Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.</a> J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).</li><li>Nakaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector.">Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.</a> J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).</li><li>Zamarin, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy:+old+challenges+and+new+directions.">Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions.</a> Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).</li><li>Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+V+protein+is+a+determinant+of+host+range+restriction.">Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction.</a> J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).</li><li>Park, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+(NDV)-based+assay+demonstrates+interferon-antagonist+activity+for+the+NDV+V+protein+and+the+Nipah+virus+V,+W,+and+C+proteins.">Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins.</a> J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).</li><li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+oncolytic+properties+of+recombinant+newcastle+disease+virus+through+antagonism+of+cellular+innate+immune+responses.">Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses.</a> Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).</li><li>Vigil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reverse+genetics+to+enhance+the+oncolytic+properties+of+Newcastle+disease+virus.">Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus.</a> Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).</li><li>Swayne, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+paramyxovirus+type+1-avian+influenza-H7+virus+as+a+vaccine+for+protection+of+chickens+against+influenza+and+Newcastle+disease.">Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease.</a> Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).</li><li>Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+viral+vaccine+constructs+with+dual+specificity:+avian+influenza+and+Newcastle+disease.">Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).</li><li>Carnero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+immunodeficiency+virus+gag+expression+by+newcastle+disease+virus+vectors+for+the+induction+of+potent+immune+responses.">Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses.</a> J. Virol. 83, 584-597 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+secretion+through+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+measles+virus+hemagglutinin+stimulates+antibody+secretion+in+the+presence+of+maternal+antibodies.">Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies.</a> J. Virol. 85, 200-207 (2011).</li><li>DiNapoli, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus,+a+host+range-restricted+virus,+as+a+vaccine+vector+for+intranasal+immunization+against+emerging+pathogens.">Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).</li><li>Martinez-Sobrido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+respiratory+syncytial+virus+by+a+recombinant+Newcastle+disease+virus+vector.">Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector.</a> J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).</li><li>Bukreyev, A., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+humans.">Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+type+I+interferon+response+by+the+nucleoprotein+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus.">Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).</li><li>Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thogoto+virus+ML+protein+suppresses+IRF3+function.">Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function.</a> Virology. 331, 63-72 (2005).</li><li>Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+anti-interferon+actions+of+the+influenza+A+virus+NS1+protein.">Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein.</a> J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).</li><li>Munoz-Jordan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+alpha/beta+interferon+signaling+by+the+NS4B+protein+of+flaviviruses.">Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses.</a> J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).</li><li>Cardenas, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+VP35+protein+binds+double-stranded+RNA+and+inhibits+alpha/beta+interferon+production+induced+by+RIG-I+signaling.">Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling.</a> J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).</li><li>Mibayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retinoic+acid-inducible+gene+I-mediated+induction+of+beta+interferon+by+the+NS1+protein+of+influenza+A+virus.">Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus.</a> J. Virol. 81, 514-524 (2007).</li><li>Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+open+reading+frame+(ORF)+3b,+ORF+6,+and+nucleocapsid+proteins+function+as+interferon+antagonists.">Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists.</a> J. Virol. 81, 548-557 (2007).</li><li>Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+coronavirus+delays+expression+of+a+subset+of+interferon-stimulated+genes.">Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes.</a> J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).</li><li>Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+alpha/beta+interferon+response+by+mouse+hepatitis+virus+at+multiple+levels.">Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels.</a> J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).</li><li>Andersson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crimean-Congo+hemorrhagic+fever+virus+delays+activation+of+the+innate+immune+response.">Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response.</a> J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li><li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Sendai+virus+multiplication+from+transfected+cDNA+or+RNA+with+negative+or+positive+sense.">Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.</a> Genes Cells. 1, 569-579 (1996).</li><li>Durbin, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+human+parainfluenza+virus+type+3+from+cDNA.">Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.</a> Virology. 235, 323-332 (1997).</li><li>Zhao, H., Peeters, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector:+effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication.">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li><li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rule+of+six,+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA.">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li><li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells.">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review.+New+mammalian+expression+vectors.">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li><li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+of+mononegavirales.">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li></ol>

Adolfo García-Sastre Mount Sinai Tıp Okulu Icahn aittir rekombinant Newcastle hastalığı virüsleri üzerinde patent bir mucit.

Çeşitli faktörler NDV tahlisiye sırasında iyi sonuçlar elde etmek için kabul edilmelidir. İlk olarak, kullanılacak olan tam uzunluktaki bir cDNA konstruktu NDV genomuna yeni transgenler / modifikasyonlarının işlevsel dahil edilmesini sağlamak için tasarlanmış olması gerekmektedir. (Ii) herhangi bir varsayımsal GE GS sekansları, dış içine vardır, yukarıda belirtildiği gibi, bu (i) Uygun bir gen ucu (GE), intergenik (IG) ve gen start (GS) dizileri gerekirse ilave edilmesi olduğu, anlamına gelir,...

Newcastle hastalığı virüsü (NDV), Avulavirus cinsine 1 ait bir kuş paramyxovirus, ciddi, tüm dünyada kanatlı hayvancılığın etkileyebilir ekonomik kuruluşları ve dolayısıyla yaygın olarak araştırılmış ve surveilled zoonotik ajandır. Bir insan patojeni rağmen, NDV de iyice bir model olarak paramixovirüsün nedeniyle son derece ilgi çekici doğal onkolitik özellikleri 6&#39;ya hem de veteriner alanının ötesine incelenmiştir. NDV&#39;nin Araştırma ölçüde ilk Conzelmann ve coleagues 2 ile kuduz virüsü için açıklanan tek iplikli, non-segmentli negatif anlamda RNA virüsler için ters genetik tekniklerin geliştirilmesi yararlanmıştır. Yabancı genlerin ya da vahşi tip genomun modifikasyonlarını taşıyan genetik olarak değiştirilmiş NDVs, bir dizi geniş beri incelenmiştir. Bu rekombinant virüsler ile çalışma NDV nin değil, aynı zamanda diğer ilgili huma sadece farklı hastalık oluşturma faktörlerini tanımlamak için önemli olmuşturn, influenza A virüsünün 7 gibi patojenler - veya acil Nipah virüsü 8. Ayrıca, farklı bir dizi çalışma çoğunlukla virüs immün sistemi uyarıcı özelliklerini geliştirerek, NDV 6,9,10 doğuştan gelen anti-tümör aktivitesini geliştirmek için bu tekniklerin kullanımı denenmiştir. Rekombinant NDVs araştırma diğer ilgili alanı, grip 5,11,12 gibi diğer viral hastalıklara karşı aşı adaylarının üretimi olmuştur HIV 13, SARS 15, 14, kızamık, ya da solunum sincytial virüsü (RSV) 16 kaynaklanır. NDV tarafından sağlanan çeşitli önemli avantajlar, insan popülasyonlarında önceden varolan bağışıklık eksikliği olan arasında, yabancı genetik uçlar, recombinatory bir etkinlik eksikliği ve genel olarak yukarıda sözü edilen doğal immün sistemi uyarıcı özellikleri 17, ve yüksek bir güvenlik profili kararlılığı. Ayrıca, p rekombinant bivalent aşıların potansiyel kullanımı çekicidiroultry, NDV karşı hem koruyucu ve çok patojen Avian influenza virüsleri 11,12. Bu nedenle de insanlar için korkunç bir kuş gribi olası arası özel atlama önlemek için yardım, evcil hayvanlara vahşi yayılan ikincisinin şansını azaltmak için mükemmel bir yol olabilir. Son olarak, raportör salgılayan NDV doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin değerlendirilmesi yanı sıra birden fazla virüs 18-27 tarafından kodlanan interferon antagonistinin tanımlanması için kullanılmıştır. Bir rekombinant kurtarma işlemi, segmentli olmayan, negatif-şeritli RNA virüsüdür temel olarak yapay ribonükleoprotein ve RNP olarak bilinen en az iltihaplı bir moleküler makinaları, (Şekil 2) kodlayan cDNA ile transfekte üreten bir hücre içinde viral replikasyon döngüsü zorlama üzerinde oluşur. RNP viral polimeraz (P ve L proteinleri) oluşur, nükleoprotein (NP) ve virüsün tam uzunluklu antigenomik RNA. Bu RNA + antigenome thAyrıca, viral RNP proteinlerinin geri kalanı ile ilişkili tamamlayıcı RNA-genomların, üretimi için gerekli e şablon, doğal bir virüs enfeksiyonu üzerine hücrenin sitoplazması (Şekil 2A ile ilgili serbest olacağı aynı bulaşıcı kompleksi tartışıldı .) Itibaren bu adımından, viral çevrim doğal olarak devam edebilir ve modifiye genomları encapsidating rekombinant virionları, (Şekil 2B) oluşturulur. Dikkate değer, yerine antigenomik cDNA&#39;nın genomik cDNA transfeksiyon büyük ölçüde engelleyen ya da tamamen ortadan kaldırmaktadır kurtarma verim 2,28-30. Antigenomik cDNA transfekte edilmiş olsa bile, transfekte edilmiş hücreler içinde RNP içine rekombinant RNA encapsidation verimliliği muhtemelen çok düşüktür. Bu nedenle, NDV için kurtarma protokoller genellikle permisif hücreler ve / veya bunları coculturing tarafından orijinal olarak transfekte edilmiş hücrelerden salınan birkaç viral parçacıkların yükseltilmesi için farklı adımlar şunlardırembriyolu yumurtaların enfeksiyonu. Önceki kurtarmak için, cDNA istenilen değişiklikleri oluşturmak için standart klonlama prosedürleri ile manipüle edilebilir. Farklı gen ürünleri ve virüs düzenleyici sekansların spesifik mutasyonlar doğrudan doğruya bu şekilde elde edilebilir olsa da, yeniden birleştirici NDV ile ilgili yayınlanmış iş birçok NDV genomuna yeni bir transkripsiyonel birim eklenmesini gerektirmiştir. Paramiksovirüs ailesinin diğer üyeleri gibi, NDV genomu farklı olarak, viral yaşam çevriminde kritik 1 azalan bir gradyanı içinde 3 &#39;ucuna konumları bakımından bağlı olarak ifade edilmiştir altı transkripsiyon birimleri halinde sekiz farklı proteinleri kodlar. Bu nedenle, genomu içinde yeni transkripsiyon ünitesinin yeri dikkatlice viral replikasyon ve transgen sentezlenmesi yetmezliği arasında bir denge elde etmek için seçilmelidir. P ve M genleri arasında Ekleme en, t kullanılmıştırhough diğer siteler de 13,31 test edilmiştir. (I) NDV genomuna dahil edilmesi için yeni bir gen, viral RNA-bağımlı RNA için uygun sinyallerinin kontrolü altında olduğu var ne olursa olsun, insert, NDV cDNA içine klonlama rescuable bir yapı oluşturmak için bazı kurallar takip etmek gerekiyor polimeraz. Bu sekanslar, yeni açık okuma çerçevesinin (ORF) üst akışında eklenmelidir, böylece polimerazı, bir tek nükleotid sekansı intergenik (IG) ile aralıklı, önceki geni (GE) ve yeni transgen (GS) başından sonuna tanıyabilir . Paramyxoviridae ailesinin en üyeleri için olduğu gibi, NDV nin (ii) etkili bir replikasyon, genom uzunluğu birden fazla olmak bağlıdır, geçerli bir Kozak (K) ökariyotik ribozomal Çeviri geliştirmek için dizisi eklenmesi de daha iyi bir yabancı protein ifadesi 32 için önerilir Altı 33, bu nedenle herhangi bir NDV ekleme, bu &quot;altı kural&quot; takip etmelidir. Gerekirse, reqedinilmiş ek nükleotidleri alt yeni ORF eklenebilir ve (iii) transgen sekansı bulmak için kontrol edilmelidir mümkün GE ve kurtarma verimlilik, transgen ekspresyonu ve / veya virüs canlılığını bozabilecek dizileri gibi GS. Eğer mevcutsa, bu diziler sessiz mutagenezi ile temizlenmelidir. Yukarıda belirtilen kurallara yeniden birleştirici tam uzunlukta bir cDNA üretimi etkili bir şekilde burada ayrıntılı biçimde açıklandığı gibi, genetik olarak değişime uğramış NDV üretmek için ilk adımdır. Sistemde tüm DNA yapıları, T7 RNA polimeraz promoteri (Şekil 3) kontrolü altındadır. Bu sitoplazmik polimerazı, bir modifiye edilmiş rekombinant vaccinia virüsü Ankara (MVA-T7) 34 ile birlikte-enfeksiyon ile trans sağlanır. Şekil 3A, tam uzunluklu antigenomik cDNA 5 kodlayan pNDV-B1 plazmid göstermektedir. Şekil 3B PTM1 plazmidler NP kodlayan gösterir, P ve L ORF. , U kodlayan plazmidler pCITE-GFP,nder T7 promoteri, yeşil floresan proteini (GFP) ve tavuk beta aktin promoteri 35 altında aynı ORF kodlayan pCAGGs GFP 18, kontrol olarak kullanılmıştır. Bu protokolde, lentojenik NDV soyu Hitchner B1 5 (Şekil 4) yeniden birleştirici NDV cDNA&#39;sından kurtarmak için bir işlemi göstermektedir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% Bovine Albumin (BA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232-936-2</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Cell lines 
			A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 &#176;C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. 
			Embryonated chicken eggs 
			Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 &#176;C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. 
			Turkey red blood cells (RBC) 
			Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 &#176;C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 &#176;C for several days. 
			Plasmids 
			Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer&#39;s instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 &#956;g/&#956;l and stored at -20 &#176;C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. 
			Viruses 
			The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. 
			Tissue culture media and solutions: 
			DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 &#176;C. 
			10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
			1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
			100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2&#8226;6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 
			1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4&#176;C.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna

Newcastle hastalığı virüsü (NDV), ailenin Paramyxoviridae 1&#39;in Avulavirus cinsinin prototip üyesi, segmentli olmayan, negatif sens, tek iplikçikli bir aşılama için bir vektör olarak olası uygulamaları ile RNA virüsü (Şekil 1) saran ve bir insan hastalıklarının tedavisi. Bu uygulamaların derinlemesine keşif sadece cDNA 2-5 olarak tam genomu kodlayan plazmid rekombinant virüsleri kurtarmak için ters genetik tekniklerin kurulmasından sonra mümkün hale gelmiştir. Viral cDNA uygun bir virüsün genotipinin değiştirilmesi için ve / veya yeni transkripsiyon birimleri dahil etmek için, standart klonlama prosedürlerini kullanarak, in vitro olarak modifiye edilebilir. Bu tür genetik olarak modifiye edilmiş virüsler Rescue faktörleri çok sayıda enfeksiyon aşamaları etki, hem de antijenlerinin ifadesi ve dağıtımı için vektörlerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için izin anlamak için değerli bir araç sağlarAşılama ve tedavisi için. Burada rekombinant NDVs kurtarılması için bir protokol açıklar.

NDV&#39;nin Kurtarma rutin virüsün tam cDNA erişebilir laboratuarlarda yapılan köklü bir işlemdir. Bununla birlikte, yöntemin içsel stokastik doğası zor% 100 verim elde etmek için kurtarma kılar. Işlemin ilk aşamaları, MVA-T7 ile özel olarak transfeksiyon verimi ve enfeksiyon izlenmesi, olası sorunları. Şekil 5A, standart transfeksiyon ve başarılı bir NDV kurtarma için yeterli transfeksiyon / enfeksiyon verimlilik gösterir belirleme yardımcı olur. Avyan memeli ko-kültür ve e...

Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA at JoVE.com

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA&#39;sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.2K Görüntüleme.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA'sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur. 

Video: Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...