Biz herv-V2 protokolünün ilk geliştirme ve optimizasyon katkılarından dolayı Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard ve Bertrand BONNAUD teşekkür ederim. Biz de etik konularla ilgili yaptığı rehberlik için Hader Haidous teşekkür etmek istiyorum.

1.. Cerrahlık Bir patolog tarafından sorumlu alınan kadar sonra, cerrah tarafından çıkarıldı, buz üzerinde prostat tutun. 2. Prostat Dokuların taşınması <ol><li> Perioperatif iskemi gecikmesini saygı, cerrahi ablasyon sonra 30 dakika içinde özel personel tarafından laboratuvara buz üzerinde radikal prostatektomi örnekleri aktarmak. Dondurma gecikme az 20-30 dakika (Şekil 3A) olmalıdır. </li><li> Tartılır ve her zamanki protokolü (sol tarafta siyah sağ tarafında, örneğin, yeşil, Şekiller 3B ve 3C) göre olan prostat leke. </li><li> Arka tarafında (Şekil 3D) bezinin enine geniş bir bölümünü gerçekleştirmek. Prostat yönlendirmek ve ön tarafta koydu. Steril bir cerrahi bıçak ile arka tarafında bezinin enine geniş bir bölümünü gerçekleştirmek. </li><li> Geçiş bölgesi üzerinde doku parçalarını incelemek,(Şekil 3E) bozulmamış boşluklarını bırakarak sağ ve sol çevresel bölgeleri üzerinde. </li><li> Bir Eppendorf tüpü içinde doku çekirdekleri bir ifadeyle, sıvı azot (Şekil 3F) içinde dondurulması ve depolanması ek. Yapıyoruz değilseniz biobank adım 2.7 ile doğrudan geçin. </li><li> Biyopsilerde kanser toplam uzunluğu 10 mm üstün yalnızca prostat bankacılık gerçekleştirin. Prostat kapatmak ve bezi bozulma ve cerrahi sınır (Şekil 3G) minimal aksamaması için bir dikiş ipliği kullanın. Sonra histolojik analiz için olağan prosedüre göre parafin içinde formalin ve embed ile radikal prostatektomi örnek düzeltmek. </li><li> Dikey Ekim küçük bir höyük üzerine dondurulmuş doku çekirdeği montaj ve cryostat bölümleri olun. Ilk tek 5 um frozen alın ve mavi toluidine ile leke. </li><li> Doku doğasını analiz etmek için hızlı bir histolojik inceleme yapın (yani. Iyi huylu veya kötü huylu). Tümöral içindoku, tümör hücrelerinin miktarını tahmin ve tümör hücrelerinin fazla% 80 ile sadece çekirdeklerini seçin. </li><li> Bunu takiben, yeni bir tek 5 um frozen gerçekleştirmek ve Hematoksilen, eozin ve Safran ile leke. Daha sonra, 30 um x 15 bölümleri kesilir ve RNAse serbest Eppendorf tüpü içinde yerleştirin. </li><li> Hematoksilen, eozin ve Safran için son 5 mikron frozen alın ve prosedürün sonunda tümör hücrelerinin miktarını kontrol etmek için leke. </li><li> Kuru buz Eppendorf tüp koymak ve moleküler biyoloji laboratuvarına numune göndermek. </li></ol> 3. RNA Ekstraksiyon, Arıtma ve Kalite Kontrol <ol><li> Homojenizasyon. Doku, tamamen bir çözelti içinde eritilir kadar Trizol/100 mg doku, 1 ml mevcudiyetinde homojenizasyon yapın. Yavaş yavaş Trizol çözüm ekleyin ve bir el değirmeni kullanarak buz üzerinde dikkatle geçin. Bir kez homojenize edilmiş, Eppendorf tüplerine çözeltisi eş-payı ve oda sıcaklığında Trizol bırakmakBeş dakika. </li><li> Faz ayırma. 300 ul kloroform (ya da 150 ul BCP/1.5 ml Trizol) eklenir. Vortex 15 sn sonra 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakın. 2-8 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüje </li><li> RNA yağış. Yeni bir tüpe dikkatli bir şekilde üst sulu faz transfer. 750 ul izopropanol ekleyin. 10 dakika (ile ters ajite) oda sıcaklığında inkübe edin. C. -19 ° C/-31 ° C&#39;de 2 saat inkübe 2-8 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri </li><li> RNA yıkama ve süspansiyon. Santrifüj sonrasında, süpernatant kaldırmak. Yıkama RNA 1 ml% 80 EtOH (Tüpleri yavaşça ters) ile pelet. 2-8 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 7500 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri P1000 ve P10 kullanarak süpernatant kaldırmak. 2-3 dakika boyunca havada kurumaya EtOH&#39;nin kalan izin verin. 70 ° C ısı bloğu 100 ul RNaz içermeyen su, transfer borular ekleme ve pelet çözmek için 2-3 dakika bekletin. Sonra buz koymak. -19 ° C/-31 ° C için kısa süreli depolama mağaza ve -, Uzun süreli depolama için 80 ° C. </li><li> RNA saflaştırma. RNeasy Mini Kit (Qiagen) kullanılarak RNA arındırın. Kısaca, 100 ul RNA numunesine 350 ul tampon RLT ekleyerek başlayın ve iyice karıştırın, daha sonra Qiagen prosedürü izleyin. Son olarak, kalite kontrol (adım 3.6) için (50 ul arasında) saflaştırılmış ürünün bir kısım, 3 ul alır. Saklayın RNA -19 ° C/-31 ° C, kısa vadeli bir süre için ya da uzun süreli saklama için -80 ° C&#39;de. </li><li> RNA QC (Şekil 4A). Üretici talimatlarına göre, RNA kalitesi ve Bioanalyzer (Agilent) ve bir Nanodrop (Thermo) kullanarak RNA bütünlüğünü kontrol edin. RNA Bütünlük sayısı (RIN) RNA kalitesini değerlendirmek için kullanılır. Özellikle, 18S ve 28S tepe saptanmasında başarılı kuvvetle daha fazla adımda örnekleri kullanılması önerilir. </li></ol> 4. WT-ovation RNA amplifikasyon WT-Ov kullanılarak amplifikasyon adımları gerçekleştirmek için Önerileruygun koşullarda ation amplifikasyon kiti: <ul><li> Pipetleme hassasiyetini sağlamak için bir defada en az sekiz güçlendirme örnekleri çalıştırın. 8 reaksiyonların 3 parti halinde kitin bir yarma gerektiren ana karışımları hazırlarken Daha sonra, 1 atık hacmi oluşturmaktadır. </li><li> Aksi belirtilmediği sürece her zaman buz üzerinde Çözülmüş bileşenleri ve reaksiyon tüpleri tutmak. </li><li> Arıtma için sadece taze% 80 etanol solüsyonu kullanın. </li><li> Protokol herhangi bir aşamada bitmiyor. </li></ul><ol><li> 25 ng / ul &#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için, toplam RNA seyreltin. Seyreltilmiş örnek 2 ul işleyin. </li><li> Hazırlanması Poli-A 1:25.000 seyreltme elde etmek için Poli-A Kontrol Seyreltme Tamponu (Affymetrix) ile Poli-A RNA Stokta bir seri seyreltme, RNA kontrol başak-in çözelti. Adım 1: 4,3 &#39;den ilk şerit cDNA sentezi - 4.8. Aşağıda belirtilen reaktif maddeler ile ilgili olarak ifade edilmiştir: A1 (First Strand Primer Mix), A2 (First Strand Tampon Mix), A3 (First Strand Enzim Mix). </li><li> Oda sıcaklığında A1 ve A2 çözülme. 2 sn 2 sn ve spin için bir vorteks mikser ile karıştırın. Daha sonra, hızlı bir şekilde buz üzerine yerleştirin. Buz üzerinde A3 yerleştirin. </li><li> Bir 0.2 ml PCR tüpü içinde total RNA (50 ng) 2 ul koyun ve A1 2 ul (nihai hacim: 4 ul) ekleyin. Şapka ve 2 sn tüp spin. </li><li> 5 dakika boyunca 65 ° C&#39;de inkübe edilir, daha sonra buz üzerinde tüp yerleştirin. </li><li> (A tek bir reaksiyon için verilen) aşağıdaki gibi First Strand cDNA Master Mix hazırlayın. Pipetleme karıştırın ve Master Mix kısaca aşağı doğru döndürün. Hemen sonra, buz üzerine yerleştirin. <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Hacim </th></tr><tr><td> First Strand Tampon Mix (A2) </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Poli-A RNA Kontrol (1:25.000) </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> First Strand Enzim Karışımı (A3) </td><td> 0.5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Ekle 6 &amp; #181; RNA / Primer içeren tüp Master Mix l. 2 sn için tüp spin hafifçe vurarak karıştırın ve hızlı bir şekilde buz (son hacim: 10 ul) üzerine yerleştirin. </li><li> 15 dakika boyunca, daha sonra 1 dakika boyunca, daha sonra 10 dakika daha sonra, 25 ° C, 10 dakika boyunca 42 ° C ve 70 ° C boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. 4 ° C&#39;de serin tutun , Termal döngü gelen reaksiyon tüpünü çıkarın kısaca döndürün ve buz üzerinde tutmak. Ikinci zincir cDNA Sentez, aşama a hemen devam edin. Adım 2: 4.8 &#39;den ikinci zincir cDNA Synthesis - 4.12. B1 (ikinci tür tampon Mix) ve B2 (İkinci Strand Enzim Mix): aşağıdaki gibi bahsedilen reaktif maddeler ile ilgili olarak adlandırılır. </li><li> 2 sn B2 ve B3 aşağı Spin ve hızlı bir şekilde buz üzerine yerleştirin. Oda sıcaklığında B1 çözülme. 2 saniye boyunca bir vorteks mikser kullanarak karıştırın, hızlı bir şekilde 2 saniye boyunca sıkma ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> (Tek bir reaksiyon için verilen) aşağıdaki gibi bir İkinci Strand Master Mix hazırlayın. Pipetleme karıştırın ve Master Mix brie aşağı spinsinek. Hemen sonra, buz üzerine yerleştirin. <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Hacim </th></tr><tr><td> İkinci Strand Tampon Mix (B1) </td><td> 9.75 ul </td></tr><tr><td> İkinci Strand Enzim Karışımı (B2) </td><td> 0.25 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Her First Strand Reaksiyon tüpüne Master Mix 10 ul ekleyin. 3x, ice (20 ul son hacim) 2 saniye ve yer için spin pipetleme karıştırın. </li><li> 5 dakika boyunca, daha sonra 1 dakika boyunca 30 daha sonra 10 dakika, daha sonra dakikada, 25 ° C, 50 ° C ve 70 ° C boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. 4 ° C&#39;de serin tutun , Termal döngü gelen reaksiyon tüpünü çıkarın kısaca döndürün ve buz üzerinde tutmak. Post-İkinci Strand Geliştirme adımda hemen devam. Adım 3: 4.13 Post-İkinci Strand Geliştirme - 4.15. Aşağıda belirtilen reaktif maddeler ile ilgili olarak ifade edilmiştir: B1 (ikinci tür tampon Mix), B3 (Tepkime Enhancement enzim Mix). </p&gt; </li><li> (Tek bir reaksiyon için verilen) aşağıdaki gibi B1 ve B3 Mix birleştirerek bir Master Mix hazırlayın. Pipetleme karıştırın ve Master Mix kısaca aşağı doğru döndürün. Hemen sonra, buz üzerine yerleştirin. <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Hacim </th></tr><tr><td> İkinci Strand Tampon Mix (B1) </td><td> 1.9 ul </td></tr><tr><td> Reaksiyon Geliştirme Enzim Mix (B3) </td><td> 0.1 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Her İkinci Strand Reaksiyon tüpüne Master Mix 2 ul ekleyin. 3x, ice (22 ul son hacim) 2 saniye ve yer için spin pipetleme karıştırın. </li><li> 20 dakika boyunca, daha sonra 1 dakika boyunca 15 dakika daha sonra, 37 ° C ve 80 ° C boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. 4 ° C&#39;de serin tutun Kısaca spin ve buz üzerine yerleştirin, termal döngü gelen reaksiyon tüpünü çıkarın. SPIA Amplifikasyon adımla hemen devam edin. Adım 4: 4,16 dan SPIA prosedür ile tek iplikli cDNA (sscDNA) sentezi -4.19. C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzim Mix): aşağıdaki gibi bahsedilen reaktif maddeler ile ilgili olarak adlandırılır. </li><li> Oda sıcaklığında C1 ve C2 çözülme. 2 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı, falso kullanarak ve hızlı buz üzerine yerleştirin karıştırın. Buz üzerinde C3 çözülme. Nazikçe 5x ters çevirerek karıştırın. Hava kabarcıkları tanıtmak için değil emin olun. Sonra, buz üzerinde 2 saniye ve yer için dönerler. </li><li> Aşağıdaki gibi bir 0.5 atık hacmi için muhasebe, bir SPIA-Master Mix hazırlayın. Pipetleme karıştırın ve Master Mix kısaca aşağı doğru döndürün. Hemen sonra, buz üzerine yerleştirin. <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Hacim </th></tr><tr><td> SPIA-Tampon Mix (C2) </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> SPIA-Primer Mix (C1) </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> SPIA-Enzim Mix (C3) </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Geliştirilmiş İkinci Strand Tepki t SPIA Master Mix 20 ul ekleyinube. 6-8x, falso pipetlenerek ve hızlı bir şekilde buz üzerinde (: 42 ul son hacim) koyun karıştırın. </li><li> 5 dakika boyunca, daha sonra 1 dakika daha sonra, 60 dakika boyunca 47 ° C ve 95 ° C boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. 4 ° C&#39;de serin tutun , Termal döngü gelen tüp çıkarın kısaca döndürün ve buz üzerine yerleştirin. </li></ol> 5. sscDNA saflaştırma ve Kalite Kontrol <ol><li> sscDNA saflaştırılması. QIAquik PCR saflaştırma kiti (Qiagen) kullanılarak sscDNA arındırın. Kısaca, yükseltilen cDNA ürünün 42 ul 200 ul tampon PB ekleyerek başlayın karıştırın ve kolon yük. Sonra Oiagen prosedürü uygulayın. Son olarak, kalite kontrolleri (adım 5.2) için (30 ul dışında) sscDNA saflaştırılmış ürünün bölüntüsünün 3 ul alır. </li><li> (Şekil 4B) elde edildi ve boyut dağılımı doğrulama sscDNA. Üretici talimatlarına göre, sscDNA verim ve Bioanalyzer ve Nanodrop kullanarak boyutu dağılımını kontrol edin. Amplifiye cDNA dağılım büyüklüğü b olmalıdıre genellikle 600 üsleri etrafında bir zirve ile uzun 100 ve 1500 üsleri arasında oluşmaktadır. </li></ol> 6. sscDNA Parçalanma <ol><li> Nükleazlar-serbest su ile ses düzeyini ayarlama, 30 ul cDNA 2 mg hazırlayın. </li><li> 10x OPA tampon PLUS çözüm başlayarak, 1x Tek-Phor-All Tampon PLUS (OPA) hazırlayın. </li><li> 0.2 U / ml DNase I hazırlanması (1 U / ml DNase I 5-kat seyreltme). </li><li> Aşağıdaki gibi bir parçalanma Master Mix hazırlayın (tek bir reaksiyon için verilen): <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Hacim </th></tr><tr><td> 10X Tek Phor-All Tampon PLUS </td><td> 3.6 ul </td></tr><tr><td> DNase I (0.2 U / ul) </td><td> 3 ul </td></tr></tbody></table></li><li> SscDNA ve 30 ul Parçalanma Mix 6.6 ul ekleyin. </li><li> Spin ve daha sonra 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de, DNase I, inaktive ve buz üzerinde tutulur, 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kısım 1 &amp;# 181; Agilent bazlı boyut dağılımı doğrulama için parçalanmış cDNA l. </li><li> sscDNA boyut dağılımı doğrulama (Şekil 4C). Bir Bioanalyzer (Agilent) kullanılarak sscDNA boyutu dağılımını kontrol edin. Parçalanmış cDNA&#39;nın boyut dağılımı, tipik olarak 35 ile 200 baz arasında yer alan olmalıdır. </li></ol> 7. Parçalanmış sscDNA Etiketleme <ol><li> DEPC su içinde 5 mM DRL-1a 7.5 mM seyreltin. </li><li> Aşağıdaki gibi bir etiketleme Master Mix (tek bir reaksiyon için verilen) hazırlayın: <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Hacim </th></tr><tr><td> 5x TdT Reaksiyon Tamponu </td><td> 14 ul </td></tr><tr><td> CoCl2 (25 mM) </td><td> 14 ul </td></tr><tr><td> DLR-1a (5 mM) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Terminal transferaz (400 U / ml) </td><td> 4.4 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Etiketleme karışımı 33.4 ul ekleHer parçalanmış cDNA örnek. </li><li> , Tüp hafifçe vurarak karıştırın kısaca döndürün ve 60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir, daha sonra buz üzerinde tutun. </li></ol> 8. Herv Chip microarray için hibridizasyon <ol><li> Ön-hibritleme Mix (Affymetrix) 200 ul herv GeneChip ön ıslatılmış ve 10 dakika boyunca, 50 ° C, 60 rpm&#39;de inkübe edin. </li><li> (A tek bir reaksiyon için verilen) aşağıdaki gibi Hibridizasyon karışımı hazırlayın: <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Hacim </th></tr><tr><td> Kontrol Oligo B2 (3Nm) </td><td> 3.3 ul </td></tr><tr><td> 20x Ökaryotik Melezleştirme Kontrol </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 2x Hibridizasyon Mix </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> % 99.9 DMSO </td><td> 17.7 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Nihai vo için oda sıcaklığında parçalanmış ve etiketlenmiş cDNA 69 ul hibridizasyon karışımı içinde 131 ul ekle200 ul lume. </li><li> Karışım 95 ° C&#39;de 2 dakika boyunca denatüre, daha sonra 5 dakika boyunca maksimum hızda 5 dakika santrifüj boyunca 50 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Önceden silinmiş herv GeneChip boşaltın ve 200 ul hedef hazırlık yükleyin. İki septanın sert noktalar uygulayın. </li><li> 18 saat, 50 ° C, 60 rpm&#39;de hibridize olur. </li><li> 18 saat sonra herv GeneChip boş ve 4 ° C de toplandı hibritleme çözeltisi depolamak Fişleri hemen ardından 4 ° C&#39;de depolanır akışkansal, üzerine çalışılmazsa 250 ul yıkama tamponu A ile prob dizisi doldurun </li></ol> 9. Yıkama ve Boyama <ol><li> GCOS menü çubuğundan Fluidics çalıştırın. Fluidics iletişim kutusunda, ilgi istasyonunu seçin (1 - 4), daha sonra tüm modüller için Shutdown_450 seçin, daha sonra çalıştırın. Milli-Q su içine 3 Fluidics aspirasyon hatları bırakın. LCD ekran yönergelerini takip ediniz. </li><li> Tüm modüllere Prime_450 programı uygulayın. Yıkama Tampon A için boru yerleştirin200 ml Yıkama Tampon B&#39;yi içeren bir şişe 400 ml Yıkama Tampon A ihtiva eden şişe ve Yıkama Tampon B için bir Sonra tekrar, LCD ekrandaki yönergeleri izleyin. </li><li> Iğneler yukarı kaldırın ve 600 ul leke kokteyl 1 (SAPE Çözüm Mix) ve 600 ul leke kokteyl yerleştirin 2 (Antikor Çözüm Mix) pozisyonları # 1 ve # 2 de mikrosantrifuj tüpler içeren ve 800 ul dizi pozisyonu # 3 de tampon solüsyonu tutan . </li><li> Ekrandaki yönergeleri izleyerek, FS450-004 protokolünü seçin ve her modülü çalıştırmak, her modül için doğru çip atayın. </li></ol> 10. Tarama <ol><li> GS3000 tarayıcıyı ısıtın. Bu ışığı yeşile döndüğünde taramaya hazır. </li><li> Sızmaması için septa üzerine sert noktalar uygulayın sonra tarayıcıya doğrudan alternatif robotun içine çip yüklemek ya. Taramayı başlatın. </li><li> Çip taradıktan sonra,. Cel dosyaları oluşturulur. &lt;Görüntü kontrol ve prob hücreleri (tanımlamak için noktaya ızgara hizalamakstrong&gt; Şekiller 4D-F). </li></ol> 11. Veri Analizi <ol><li> Kalite kontrol. Standart Affymetrix bakın herv-V2 cips QC kriterlerini karşılamak olduğunu doğrulamak için kontrol eder. Bu amaçla aşağıdaki temsiller kullanılabilir: yoğunluk medyan karşı günlük yoğunluk değeri dağılımı (yoğunluk araziler ve kutu araziler), medyan mutlak sapma (MAD) (MAD-Med) araziler, plan araziler, normalize ölçeklenmemiş standart hata (nkullan) araziler ve göreli günlük ifadesi (RLE) araziler. </li><li> Normalleştirme. Buna ek olarak, veri kümesi beklenmedik toplu etkilerini vurgulamak ve istatistiksel analiz önce bunları düzeltmek için araştırılmalıdır. Veri ön işleme böylece arka plan düzeltme (örneğin. Triptofan prob temel sinyaline dayalı), RMA normalleşme ve özetleme 15 tarafından takip içerir. </li><li> Veri madenciliği ve diferansiyel ifade genler için arama. Cips normalleştirmek ve hiyerarşik bir clusteri uygulamakveri kümesini (Şekil 6A) keşfetmek için ng yaklaşım. Sonra, mikrotertibin klasik bir önemli analizi (SAM) bir yanlış keşif oranı (FDR) düzeltme 17 tarafından takip prosedürü 16 kullanılarak farklı olarak ifade genlerin (°) için bir arama gerçekleştirin. Bu adımları tam Partek GS gibi bazı yazılım analizi suit entegre edilmiştir, ancak alternatif BioConductor projenin 19 paketleri ile R istatistik yazılımı 18 kullanılarak yapılabilir unutmayın. Yapılan istatistiksel analizler sonucunda, ifade değerleri az 2 6 olduğu için probesets dışlamak için veri kümesini filtre. </li><li> Görselleştirme ve yorumlanması. Açıklama veritabanlarını kullanarak özel bir arayüzü herv-V2 mikrotertibin gelen sonuçları yorumlayın. </li></ol>

Bu çalışma bioMérieux SA, Bakımevleri Civils de Lyon ve Fransız kamu kurumu OSEO (Yeni Tedavi Yaklaşımları için İleri Tanı, kişiselleştirilmiş tıp adanmış bir Fransız hükümet tarafından finanse edilen bir program) tarafından desteklenmiştir. PP, VC, GO, NM ve FM bioMérieux SA çalışanlarıdır. PP, NM ve FM bu yazının bulgularını kapsayan patent başvurularımız var.

Son 10 yılda, herv ifade ölçümü için girişimleri çoğu RT-PCR teknikleri kullanılmış ya herv cins 25,26 genel eğilimleri değerlendirmek için pol genlerin göreceli korunması dayalı özel bir lokus 20-24 veya odaklanmak . Buna ek olarak, herv ailesine 27,28 ekspresyonunu tespit etmek ve ölçmek için tasarlanmıştır düşük yoğunluklu mikrodiziler ile birleştiğinde çok dejenere primerler kullanılarak PCR büyütmesi. Bir aile içinde tek tek lokusunun ekspresyonunu izlemek için, daha sonraki klonlama ve sıralama ile kombine korunmuş bölgelerin PCR amplifikasyonu göre yaklaşımlar için HML-2 29,30 veya herv-E4.1 31 ailelerin transkripsiyonal olarak aktif ayrı elemanları etkin belirlenebilir. Ayrıca klonlama ve dizileme adımlarla biten, aktif HML-2 spesifik insan yalnız LTR tespit tekrarlar arasında destekleyicileri belirlemek amacıyla genom tekrar ifade izleme tekniği <sup&gt; 32,33. Bu arka arkaya bir aile içinde 34,35 paralog elemanları arasındaki çapraz tepkimeleri en aza indirgemek amacıyla tekrar element Sonda tasarımı için uygun yöntemler tanıtan herv transcriptome analizlerine özel yüksek yoğunluklu mikrodiziler iki nesil geliştirdi. Herv-W, herv-H, herv-E 4.1, herv-FRD, herv-K HML-2 ve herv-K HML-5 ailelerin 2.690 ayrı-virüsler ve 2.883 yalnız LTR hedefleyen herv-V2 yonga tanıttı farazi prostat kanseri biyolojik tanımlanması ile bu yazıda gösterildiği dokuların 35, geniş bir 1.718 herv loci (Şekil 7A ve B) &#39;nin ifadesi. Buna ek olarak, belirli bir lokus üzerinde birden probesets kullanımının kendi transkripsiyon düzenlemesi ile ilgili bilgi veriyor. İlk olarak, U5 pozitif biri ile bağlantılı olarak bir U3 negatif sinyal, bir promoter olarak LTR sınıflandırır, ve tersine U3 pozitif ve negatif sinyaller U5 bir poliadenilasyon rol yansıtabilir. Biz böylece idizisi tarafından sağlanan bu U3-U5 dikotom bilgilere dayalı dokular 35 ve geniş bir aralıkta 326 promotör LTR dentified, biz önerilen ve deneysel böyle özerk transkripsiyon bir metilasyon bağımlı epigenetik süreci 34 (Şekil tarafından kontrol edildiğini, bazı seçilmiş olgularda doğruladı 8). Plasentada ve tümöral testis 34 ERVWE1/Syncytin1 ekspresyon profili ile gösterildiği gibi İkinci olarak, örneğin, LTR gelen sinyallerin bulgulanması, gag ve env bağımsız probesets ya da belirli bir ek yeri birleşim hedef prob tarafından verilen, proviral birleştirme stratejisi ile ilgili bilgi veriyor. Bu herv spesifik prob seçimi işlemi (Şekil 8) olarak etkin bir geleneksel genler 36 için olduğu gibi, doku ile ilişkili birleştirme stratejisi kimlik desteklemek için yeterince sağlam olduğunu gösterir. Bu yöntem tek tek herv odağı ifadeyi belirlemek için ilk girişimAfpymetrix teknolojisine dayanan özel bir yüksek yoğunluklu mikrodizisi kullanılarak. Mikrodizi formatının açıkça tanımlanmış avantajları (i) &#39;den oluşan herv transcriptome çözmek için çeşitli herv ailelerin koordine arama ve her bir lokus için farklı bölgelerin (ii) aynı anda ve bağımsız analizi, örn. Solo ve proviral LSY ları, gag ya da env bölgelere ve herhangi bir önsel herv elemanın işlevselliğine olmadan proviral yapıları ile ilişkili olası spliced ​​kavşaklar için, U3 ve U5 etki. Beklentiler mikroarray ilişkili Biocomputing araçları açıklamaları bir gelişme güvenmek. Bu, böyle bir kanıtlandığı aktif HERVs lncRNA transkripsiyon, sürücü ya da daha fazla veya daha az yakın kodlayıcı gen ifadesini modüle eden olmadığı gibi biyolojik hipotez halinde çip sinyalleri dönüştürmek için izin vermelidir. Nitekim, bu tür varsayım v bileşenleri içeren prostat kanseri ile ilişkili ncRNA transkriptleri tespit son çalışmalar tarafından desteklenmektedirherv-K, endojen retrovirüs bir aile ya da bölümleri bir virüs LTR yükseltici bölgesi 37, hem de iki füzyon gen etkinlikleri, yani herv-K22q11-ETV1 ve herv-K17-ETV 38,39 ikinci iral ORF. Birlikte ele alındığında, LTR fonksiyonu ve ekleme stratejisi kimlikleri ile birlikte bu tüm transcriptome yaklaşım tetik kronik 40,41 içinde herv ifade bileşenleri ve bulaşıcı hastalıklara karşı 42,43 işaretleyici deşifre yardımcı olabilir.

(Ayrıca HERVs denir) İnsan endojen retrovirüsleri bizim genom boyunca yayılır. Onlar kopyala-yapıştır yayılma süreçleri takip ve Multicopy ailelere açan germ hattı içinde atalarının ve bağımsız enfeksiyonları, kaynaklanır. Bugün, onlar artık bulaşıcı ama onlar insan genomunun% 8&#39;ini işgal, karşılaştırma noktası olarak, ekzonlar insan genomunun% 2 yayılabilir. 2012 yılında yayınlanan KODLAMASI proje verilerini farklı RNA türleri arası bölgelerde üçte biri de dahil olmak üzere, genomun yaklaşık olarak% 62 kapsamaktadır gösterdi. Ayrıca, transkripsiyon düzenleyici motiflerin miktarı, protein kodlama ekson karşılık gelen bir daha az 4.5x daha fazla olduğu görülmektedir. Bulaşıcı retrovirüsler olarak her zamanki fonksiyonu olarak HERVs uzun terminal tekrar (LTR), potansiyel transkripsiyon düzenleyici elemanlar, geniş bir aralığı temsil eder. Tarihsel, ayrı plasenta veya testiste ifade birkaç loci adlı, yaygın herv nedeniyle ep sessiz olduğuna inanılırdıigenetic düzenleme. Bu nedenle, en iyi şekilde daha iyi onlar lncRNA transkripsiyon sürücü ya da gen ifadesini modüle eden kodlama halinde, aktif olup olmadığını anlamak için, tek tek herv loci ifade karakterize etmek amacıyla, Affymetrix biçiminde, yüksek yoğunluklu bir mikro tasarladık. Herv-V2 GeneChip adlandırılan bu araç 23.583 herv probesets entegre ve 5573 yalnız LSY ları oluşan farklı herv elemanlarının yanı sıra komple ve parsiyel-virüsler (Şekil 2) ayırt edebilirsiniz. Tanı, Değerlendirme ve Planı: Prostat kanserinin teşhisi klinik laboratuvar prostat spesifik antijen (PSA) biyolojik, morfolojik prostata değişmelerinin ve patolog tarafından gözlenen son olarak, prostat biyopsisi değerlendirmek için bir Dijital rektal muayene dozaj dayanır. Prostat kanseri için PSA gibi geleneksel kanser biyobelirteçlerinin, arasında yeterli özgüllük ve duyarlılık eksikliği, yaygın af kabul edilmiştirklinik etkileri ter birkaç yıl 1. Başlangıçta, PSA prostat adenokarsinomu 11 tanı ve tedavisi için önerilmiştir. Bu kanser taraması için önerilen ve hastalığın 12 gelişimini izleme ikincisi oldu. Ancak, düzenli olarak sorulan bir soru kalır: &#39;PSA nasıl kullanılacağı&#39;. (Ii) iki büyük çalışmada Avrupa&#39;daki insanların yüzbinlerce kayıt ve (i) 2.5-10 ng serumunda bir konsantrasyona karşılık gelen gri bir bölge / ml açık bir fark kanser ve kanser dışı 2 arasında yapılacak izin vermez , teoride olsa basit, böyle PSA temizliği, PSA hızı ve süresi iki katına gibi post-operatif PSA kinetik parametrelerinin (iii) analizi; ABD hastalığa özgü mortalite 13,14 açısından tarama kullanışlılığı hakkında net bir sonuca varamadı pratik uygulama 3,4 önemli sorunlar oluşturabilmektedir. Biz biyomarker APP, önümüzdeki yıllarda bekleyebilirizAtıf tetikte bekleyen ve daha fazla veya tümör fenotipe bağlı olarak daha az agresif tedaviler arasında bir klinik seçim destekleyecektir. Patolog tarafından verilen tanı ile ilgili olarak, ilk sınırlayıcı faktör (birçok kanser örnekleme tarafından kaçırılan) prostat biyopsisi içinde% 20 yanlış negatif tanı geliyor. İkinci mesele olumsuz etkileri ortaya çıkabilir olumsuz biri, aşağıdaki ek bir biyopsi işlemi için ihtiyacı ile ilgilenir. Radikal prostatektomi şu anda prostat kanseri için standart tedavilerden biridir. Bu, (10 Gleason 7), özellikle agresif desen durumunda, 45-65 yaşındaki yaşlanma, sağlıklı hastalarda çok odaklı tümör ya da tümör aşikar önerilmiştir. Şimdi robotik cerrahi ile kliniğimizde yapılmaktadır. Çünkü moleküler belirteçler önümüzdeki yıllarda büyük önem sahip olacağı artan kanıtlar, hepimiz hastalara prostat için bir programa katılan olasılığını önermeye karar verdidoku bankacılığı. Daha kesin olarak, prostat kanseri üzerindeki genişleyen moleküler araştırma programı prostatektomi örneklerden kaliteli taze tümör dokularına erişimi için artan bir gereksinim ortaya çıkmıştır. Bu araştırma, özellikle de genomik yaklaşımlar, yüksek DNA / RNA kalitesi büyük örnekleri gerekmektedir. Tümöral ve aynı hastadan alınan bitişik olmayan &quot;tümör dokuları ihtiyaç vardır. Radikal prostatektomi taşıma ve işleme için Öneriler sahne ve marj durumunu ve böylece potansiyel ileri tedavi ve prognozu belirleyen patolojik özelliklerini korumak için tasarlanmıştır. Herhangi bir taze doku örnekleme yöntemi, bu nedenle, teşhis için kabul edilebilir olması amacıyla, daha sonra patolojik değerlendirmeler bozmamalıdır. Prostatın makroskopik diseksiyonu zordur ve büyük ilgi marjı doku ve kapsül işgali ödenmesi gerekiyor: Prostat bankacılık için herhangi diseksiyonu her zaman aynı fikirde göre eğitimli üropatolog tarafından yapılmalıdırd protokolü. Tıp fakültesi ve devlet sağlık kurulu etik komitesi bu soruşturmaların kabul etti ve tüm hastalar prostat dokuları bankacılık dahil için onam alındı ​​bilgilendirdi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Trizol</td>
			<td style="width:92px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15596-026</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNA poly-A control stock</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900433</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DNAse 1</td>
			<td style="width:92px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M6101</td>
			<td style="width:295px;">1,000 U (1 U/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Terminal transferase</td>
			<td style="width:92px;">Roche</td>
			<td style="width:137px;">3333574001</td>
			<td style="width:295px;">400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DLR-1a</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900542</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900454</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">GeneChip Hybridization, Wash and staining</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900720</td>
			<td style="width:295px;">Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">10x One-Phor-All Buffer PLUS</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">74104</td>
			<td style="width:295px;">RNA cleanup protocol</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">WT-Ovation RNA amplification system</td>
			<td style="width:92px;">Nugen</td>
			<td style="width:137px;">2210-24</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">QIAquik PCR purification kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Material Name</td>
			<td style="width:92px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:295px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">GS30007G</td>
			<td style="width:295px;">Optional: autoloader</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">FS450</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Hybridization 640 Oven</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">640</td>
			<td style="width:295px;">Includes 4 GeneChip Probe array carriers</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:195px;">Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="232">
			<td height="232" style="height:232px;width:195px;">HERV-V2 chip</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Custom array. 
			For microarray availability (for research use only), please contact: 
			Fran&#231;ois Mallet 
			Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioM&#233;rieux 
			Medical Diagnostic Discovery Department 
			Centre Hospitalier Lyon Sud, B&#226;timent 3F 
			69495, Pierre B&#233;nite cedex France 
			Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 
			Email: francois.mallet@biomerieux.com</td>
		</tr>
		<tr height="717">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HERV-V2 conception 
			Dedicated database and annotations 
			 
			The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. 
			 
			Locus-specific probes design 
			Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. 
			 
			Custom HERV GeneChip microarray 
			The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microarray-based identification of individual herv loci expression: application to biomarker discovery in prostate cancer

Prostat spesifik antijen (PSA), klinik kullanımda, prostat kanseri için en önemli teşhis biyolojik olmakla birlikte, özellikle düşük dozaj değerleri 1 &#39;de, özgüllük ve duyarlılık yoksundur. &#39;PSA nasıl kullanılır&#39; de net bir farklılaşma kanser ve kanser dışı 2 arasında veya hasta takip için yapılan izin vermez 2.5-10 ng / ml serum bir konsantrasyonuna karşılık gelen gri bölge olarak tanı için, bir akım sorun olmaya devam etmektedir -up post-operatif PSA analizi gibi kinetik parametreler pratik uygulama 3,4 için önemli sorunlar oluşturabilmektedir. Alternatif olarak, kodlamayan RNA&#39;lar (ncRNAs), hastalık gibi yeni işaretleri olarak prostat kanserinde 5,6 örneğin PCA3 ve tümör biyolojisi uncharacterized yönlerini ortaya çıkarmak için potansiyeli olan, insan kanserinin anahtar moleküller olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, 2012 de yayınlanan KODLAMASI proje veri tipleri farklı RNA gen yaklaşık% 62 kapak gösterdiome. Ayrıca, transkripsiyon düzenleyici motiflerin miktarı, protein kodlama ekson karşılık gelen bir daha az 4.5x daha fazla olduğu görülmektedir. Bulaşıcı retrovirüsler olarak birincil işlevi olarak Böylece, bir insan endojen retrovirüsler (HERVs) uzun terminal tekrarları (Litre), varsayılan / aday transkripsiyon düzenleyici dizilerin bir yelpazede oluşturmaktadır. Insan genomu boyunca yayılır HERVs, kopyala-yapıştır yayılma süreçleri takip ve insan genomunun% 8 işgal aileleri (ekson bizim genomunun% 2 yayılan dikkat Multicopy giden germ hattı içinde atalarının ve bağımsız enfeksiyonları, kaynaklı .) Bazı herv loci hala kanser 7-10 dahil olmak üzere çeşitli patolojiler ile ilişkilendirilmiştir proteinleri ifade eder. Biz en iyi şekilde iyi onlar ncRNA transkripsiyonunu veya m sürücü ise onlar aktif olup olmadığını anlamak amacıyla, bireysel herv loci ifade karakterize amaçlayan Afpymetrix formatında, yüksek-yoğunluklu mikrodizisini tasarladıkodulate gen ekspresyonunu kodlayan. Bu araç, prostat kanseri alan (Şekil 1) olarak uygulanmıştır.

Transkriptomik çalışmalar başlangıç ​​değeri, biyolojik maddenin kalitesi esas almaktadır. RNA ekstraksiyonu, uygun koşullarda gerçekleştirilir ise, RNA bütünlüğü numarası (RIN) tipik olarak 7 veya daha yüksek (Şekil 4A) &#39;dir. Affymetrix herv-V2 çip üzerindeki cDNA 2 ug hibridize için ihtiyaç bir amplifikasyon işleminin kullanılmasını ifade eder. Başarılı bir yükseltme adımı, bir çan şeklindeki dağılımı (Şekil 4B) yol açar. Daha sonra, DNAse1 parçalanma yaklaşık 100 nükleotid hibridizasyon (Şekil 4C) önce cDNA boyut dağılımı daha homojen hale getirmek için gerçekleştirilir. Hibridizasyon ve tarama (Şekil 4D) sonra, görüntünün bir görsel denetim ızgara iyi noktalar (Şekil 4E) hizalanmış olup olmadığını kontrol için bir olanak sağlar ve melezleme kontrolleri tutarlı ise (Şekil 4F). Bu adım, mikrodiziler dışlamak için de faydalı olduğu hava kabarcıkları veya hata<html> Deney sırasında oluştu. Cips QC (Şekil 5) geçti ve normalleştirme sonra, Lyon-Sud Hastanesi&#39;ne 5 maç-pair tümör ve normal prostat RNA örneklerinin istatistiksel analiz diferansiyel ifade değerleri ile 207 herv probesets belirlenmesi (p.val yol açtı kez &lt;0.05) (Şekil 6A). Bu kayıtları desteklemek ve prostat spesifik bilgiler elde etmek için, 35 ek maç çifti örnekleri (kolon, yumurtalık, testis, meme, akciğer ve prostat) sonunda tespit analizi ve SAM-FDR prosedürü (FDR =% 20) ilave edildi 44 prostata özgü herv probesets. Bunlar arasında, en uygun 10 herv yapılar (Şekil 6B) tarif edilmiştir. Ileri klinik çalışmalar bu aday biyomarkerların duyarlılık ve özgüllük değerlerini değerlendirmek için gerekli olacaktır. pload/50713/50713fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; . Klinikten genel yöntemin Şekil 1 Scheme aday biyomarkerların tanımlanmasına yol açan: (numune hazırlama, hedef hazırlama, mikroarray işleme 2-6) tezgah (1 klinisyen ve patolog tarafından doku hazırlanması tarafından prostatektomi) (7: herv microarrays Biocomputing analizi). Normal dokudan türetilmiş nükleik asitler turuncu tasvir edilir; tümöral alanda türetilen nükleik asitler (turuncu) ve tümör spesifik (siyah) nükleik asitler normal bir karışımı oluşur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig2.jpg" width="500px" /> . Şekil 2 Anlayışı ve herv-V2 çip içeriği: herv dizileriİnsan genomunun alınan herv-gDB3 adı verilen bir veritabanında depolanır, daha sonra 25-mer aday sondalar, elde edilen hedef alt bölümlerinin her biri için tasvir edilmiştir (en sonunda dizisi üzerinde sentezlenen önce özel bir melezleştirme modelleme işlemi (EDA +) geçmesine aile). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig3.jpg" width="500px" /> Patolog tarafından Şekil 3. Prostat taşıma. (A) Taze radikal prostatektomi numune laboratuvara transfer edilir. (BC) prostat (sol tarafta siyah sağ tarafta yeşil) lekeli. (D) arka tarafında bezinin büyük enine kesit. (E) sağlam, piec marjları bırakmakdokuların es prostat bezinin farklı alanlarda disseke. Doku (F) Çekirdek, bir Eppendorf tüpü içinde yerleştirilir. (G) Dikiş ipliği prostat kapatın ve bezi bozulma ve cerrahi sınırın asgari aksamaması için kullanılır. Sonra, radikal prostatektomi örnek histolojik analiz için olağan prosedüre göre formalin içinde tespit için hazır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig4.jpg" width="500px" /> Nükleik asit hazırlanması ve hibridizasyon verimliliği Şekil 4,. Kalite kontrol eder. (A) RNA bütünlüğü, (B) cDNA hedefleri ve hibridizasyon aşamada kullanılan (C) parçalı büyütülmüş hedefler. Thüç kalite kontrolleri RNA nano cips ve Eukaryote Nano Serie II deneyi kullanılarak Bioanalyzer ile elde edilmiştir ese. (D) taramadan sonra herv-V2 mikroarray hibridizasyon alanında, (E) sol üst köşesi gösteren grid hizalama kontrolleri genişlemesi ve melezleme kontrolleri lekelenme gösteren merkez alanın (F) genişleme genel görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig5.jpg" width="500px" /> Şekil 5, sinyalleri. Processing. (A) Affymetrix polyA başak-amplifikasyon kontrolleri. PoliA B. Dap, Thr, Lys Phe ve kontrol transkriptleri subtilis genleri RNA örnek çivili ve genel başarısını değerlendirmek için hizmet edilir<html> Hedef hazırlık adımları. Şiddeti hiçbir önyargı yüksek ve düşük ifade genler arasındaki WT-Ovation amplifikasyon sırasında orada olduğundan emin olmak için, bu başak denetimlerin arasındaki değerleri azalan tespit edilmelidir. (B) Affymetrix başak-melezleme kontrolleri. E izole Bu hedefler coli ve P1 bakteriyofaj etiketleme prosedürü önce çivili. BioB, BIOC, Biol ve Cre gelen artan değerleri, melezleşme genel başarısı göstermektedir. RMA normale döndükten sonra, çip sinyallerin (C) yoğunluk dağılımı. Alt 2 6 (arka) daha yüksek değerlere sahip probesets sergi sinyallerin çoğu, özellikle bazı özel herv loci sınırlı genel bir ifade ettiğini belirten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig5highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . ftp_upload/50713/50713fig6.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Şekil 6,. Veri analizi. Normal ve tümör örnekleri (A) Hiyerarşik kümelenme analizi. Ve aşağı normal ve tümöral örnekleri arasında (mavi)-regülasyon - bölümleme kümeleme, Öklid uzaklık fonksiyonu algoritmasını kullanarak (kırmızı) içine probesets gruplama normalize ifade değerleri uygulanmıştır. Prostat kanserinin aday biyomarkeri olarak tanımlanan ilk 10 herv yapıların (B) Seçim. Her herv öğesi için, ilgili herv aile, genomik koordinatlar (NCBI 36/hg18) ve herv yapısının kısa bir açıklama verilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig7.jpg" width="500px" /> Şekil 7. </strong&gt; Herv repertuar. (A) insan genomunun Sıralama 25.000 protein kodlayan genler (eksonları,% 2) ve 200.000 uzun terminal tekrarı (LTR) retrotranspozonları (herv,% 8) dahil transposable elementlerin büyük miktarda saptandı. Herv-V2 yonga içeriği (B) Ekstrapolayon ve ilgili ifade verileri (tümöral doku tiplerinin karşı 8 normal menşeli 79 örnekleri) herv repertuar üçte biri transkripsiyonel etkin olduğunu düşündürmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig7highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 8," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig8.jpg" width="500px" /> Şekil 8. Çip sinyallerin Fonksiyonel yorumlanması. (A) Promoter kimlik ve epigenetik kontrol: U3 negatif sinyal (kırmızı prob, 5&#39;LTR) R-U5 pozitif sinyaline karşı (mavi prob, 5&#39;LTR) farklı CpG metilasyonu (katı siyah daireler) tümöral dokularda karşı peritümoral normal U3 içeriği ile desteklenen U3-odaklı transkripsiyonu, öneririz. (B) Ekleme stratejisi: mRNA tümör içinde özel olarak ifade edilen kodlayan varsayımsal 3.1 kb kaplama üst üste binen SD1/SA2 prob ekleme birleşme ile tanımlanır. * Olmayan diğer plasental dokularla karşılaştırıldığında Yazışmalar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig8highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer at JoVE.com

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

İnsan genomunun% 8&#39;ini işgal insan endojen retrovirüsleri (herv), kıt kodlama kapasitelerini ama yüz bin uzun terminal tekrarları (LSY) korur. Özel bir Affymetrix mikroarray bireysel herv odağı ifade belirlemek için tasarlanmıştır ve gelecekteki klinik çalışmalar için kavramının bir kanıtı olarak prostat kanseri dokularda kullanıldı.

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

microarray-based-identification-individual-herv-loci-expression

Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K Görüntüleme.  Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux.  İnsan genomunun% 8'ini işgal insan endojen retrovirüsleri (herv), kıt kodlama kapasitelerini ama yüz bin uzun terminal tekrarları (LSY) korur. Özel bir Affymetrix mikroarray bireysel herv odağı ifade belirlemek için tasarlanmıştır ve gelecekteki klinik çalışmalar için kavramının bir kanıtı olarak prostat kanseri dokularda kullanıldı. 

Video: Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Tıp

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

miRNA kullanarak Meme Kanseri Dokularındaki miRNA İfade Klinikopatolojik Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

İnsan Prostat Kanseri klinik öncesi Ortotopik murin modeli

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary to produce erythema (inflammatory reddening) on the surface of the skin. In this context, the MED is regarded as a key factor in determining starting doses for UV phototherapy for common skin conditions such as psoriasis and eczema. In research settings, MED testing also has potential to be a powerful tool for assessing within- and between-persons variation in inflammatory responses. However, MED testing has not been widely adopted for use in research settings, likely owing to a lack of published guidelines, which is a barrier to obtaining reproducible results from this assay. Also, protocols and equipment for establishing MED vary widely, making it difficult to compare results across laboratories. Here, we describe a precise and reproducible method to induce and measure superficial erythema using newly designed protocols and methods that can easily be adapted to other equipment and laboratory environments. The method described here includes detail on procedures that will allow extrapolation of a standardized dosage schedule to other equipment so that this protocol can be adapted to any UV radiation source.

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is used to establish dosage schedules for ultraviolet radiation phototherapy. It can assess individual variation in inflammatory response but lacks methodology for achieving reproducible results. Here, we present a precision implementation of MED and demonstrate its ability to capture individual variation in inflammatory response.

İnsan İnflamatuar Yanıtında Bireysel Değişimi Değerlendirmek Için Minimal Eritem Dozu (MED) Testinin Hassas Uygulanması

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...