Yazarlar Translational Araştırma Birimi teknik personeli teşekkür etmek istiyorum; Mary Economou José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni ve Patoloji Enstitüsünde Bilişim Ekibi, Bern Üniversitesi.

NOT: Bu çalışma Insel Hastanesi, Bern, İsviçre (07-10-13) yerel etik kurul tarafından onaylandı. Dokular Tümör bankanın Patoloji Bern, Enstitüsü, Bern Üniversitesi elde edilmiştir. 1. Planlama ve Tasarım (Danışmanlık) <ol><li> Araştırma sorusu düşünmek cevaplanması gereken. Doku tipleri üzerinde karar projeye dahil edilecek. Histolojik yapıları soruyu cevaplamak için önemli olan ne belirleyin. </li><li> En yararlı çekirdek çapı ve proje için hasta başına çekirdeklerinin sayısını teyit edin. Biyomarkerların miktarına göre nesil Doku Mikro Array (ngTMA) kopya sayısına karar araştırılmalıdır. </li><li> Doku mikrotertip (TMA) inşa edildikten sonra örnek büyüklüğü ve analizi gibi istatistiksel yönlerini düşünün. Çalışmaya dahil hastaların sayısını belirlemek için bir dizi kontrol dokuların oluşturulması. </li><li> Histolojik Al (veyadiyagnostik) Hematoksilen ve Eosin (H &amp; E), her bir hastanın kayar. Kısaca slaytları inceleyin ve proje için ilgili bilgi ve histoloji içeren olanları belirlemek. NOT: özel leke veya immünohistokimya slayt slayt tarama ve açıklama için istenirse yerine H &amp; E slaytlar, parafin blok yeni bölümler olun </li></ol> 2. Slayt Tarama <ol><li> PC ve slayt tarayıcı ve açık tarama yazılımı açın. Önizleme ekranından parlak bir alan tarama için &quot;Otomatik modu&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Slayt kalite parametrelerini ayarlamak için &quot;tarama seçenekleri&quot; üzerine tıklayın. Bu anda, slaytlar doğrudan web tarafından veya yerel bir sürücü (sürücü veya harici) erişilebilir dijital platforma taranacak olup olmadığını seçin ve tarama ve odak noktalarının sayısı türlerini ayarlayabilirsiniz. </li><li> &quot;Vaka merkezi&quot; tarama &quot;Server Parametreleri&quot; üzerine tıklayın. Bu aşamada, daha dergiler eklediğiniz tüm slaytlar etiket ve setslaytlar saklanmalıdır Vaka Merkezi&#39;nde klasör. Her dergi 25 slaytlar kadar tutar. </li><li> Giriş kalite / tarama için gerçek histolojik slaytlar temizlik. % 70 etanol ile gerekli temiz, slaytlar halinde. </li><li> Etiketler içe bakan ile dergi başına 25 slaytlar kadar yükleyin (Şekil 3A) </li><li> Tarayıcıya dergi yerleştirin. Birden fazla dergisi için, birbirinin üzerine koyun. </li><li> Yeşil ok (Şekil 3B) tıklayarak slayt taramaya başlayın. Tüm slaytlar tarandığında, dergi kaldırma ve programı PC ve slayt tarayıcı kapatın. </li></ol> 3. Dijital Slayt Açıklamalar <ol><li> Dijital slayt yönetimi merkezi için tarayıcı adresini girin ve ücretsiz dijital slayt görüntüleyici yazılımı indirmek. </li><li> Dijital slayt görüntüleyici yazılımı açın ve dijital slaytlar (Şekil 4A) içeren klasörü seçin. </li><li> , Notlar ekleyebilir yeniden düzenlemek ve yönetmek Digital slayt klasör veya meslektaşlarına kullanıcı hakları atamak veya klasöre ekleri ekleyin. </li><li> Dijital slayt görüntüleyicide istediğiniz dijital slayt tıklayın. </li><li> Büyütme aracını kullanarak, slayt değerlendirmek ve ngTMA entegrasyon için ilgi alanları bulabilirsiniz. </li><li> &#39;TMA açıklama aracını&#39; kullanarak, istenen çekirdeğin büyüklüğü ve şerhinin rengi seçin. (Şekil 4B) üzerine tıklayarak, dijital slayt üzerinde şerhi. </li><li> NgTMA (Şekil 4C) içine dahil etmek için arzu edilen histolojik yapılarla açıklama getirin. </li><li> Bir çekirdek boyutu ve istenen bir açıklama rengi, açıklama aracını kullanarak seçerek tekrar şerhinin bu işlemi tekrarlayın. Klasördeki tüm slaytlar üzerinde slayt görüntüleme ve açıklama tekrarlayın. </li><li> Alternatif olarak, TTB içine 0.2 ml tüpler yerine entegrasyon içine PCR için doku çekirdeği yerleştirin. Tanımlamak için farklı bir renk kullanarak slaytlar AnnotateDaha fazla moleküler analiz için bu noktalar. </li><li> Bunlara karşılık gelen açıklamalarla ve renkleri ile tüm olguların bir listesini oluşturun. </li></ol> 4. Doku Mikroarray İnşaat <ol><li> Doku microarraying için istenen amacıyla blokların sıralayın, tüm açıklamalı dijital slaytlar için gelen parafin doku blokları alın. </li><li> Doku blokları 4 mm kalınlığında, en az olduğundan emin olun. Aksi takdirde, bir doku reembedding gereklidir. </li><li> Ve otomatik doku mikro-dizici aracı &quot;AÇIK&quot; Turn PC. Doku mikro-dizici yazılımını açın ve projeye bir ad </li><li> Bir &quot;Aracı Değiştir&quot; gerçekleştirin ve proje için gerekli alet çapı seçin (örneğin, 0.6, 1.0, 1.5 veya 2.0 mm). </li><li> Makinenin içine 12 &#39;alıcı&#39; TMA blokları yükleyin. 12 blokların her biri bir numarası </li><li> Her alıcı blok için bir TMA düzeni oluşturun. Satır, sütun, ve gidilmeyeceği sayısı ile bir TMA tasarım gözlemlemeky hatları gibi çekirdek arasında mesafe. Her alıcı blok için yeni bir düzen yaratmak, art arda veya aynı düzeni kullanmak. </li><li> İlk çekirdek almak için alıcı blok düzeninde imleci yerleştirin. </li><li> Sonraki, doku mikro dizicinin (Şekil 5A) içine 60 donör kadar blok yük. Her bloğu bir donör numarası F&#39;ye her satır A on blok yerleştirin. Doku mikro dizicinin tarafından otomatik olarak elde bilgisayar ekranında her donör bloğun görüntüleri gözlemleyin. </li><li> Ilk blok ile başlayarak, &quot;Slide&quot; üzerine tıklayın. Dijital slayt görüntüleyici kullanarak dijital slayt yönetim merkezi (veya harici sürücüde) saklanan açıklamalı dijital slayt gözlemleyin. Donör blok görüntü ve dijital slayt yan yandan görünüşüdür. </li><li> Blok görüntü üzerinde seçin referans noktaları dijital slayt ile donör blok görüntü bindirmek için </li><li> &quot;Next&quot; tıkladıktan sonra, bloğun bir büyük resim üzerine açıklamaları gözlemlemek. (Şekil 5B &lt;/ Strong&gt;). Onaylamak ve &quot;Başlat&quot; tıklayın açıklamaları üstüne tıklayın. Not: Bu, seçilen başlangıç ​​noktasında alıcı blok çapı 0.6 mm bir delik başlatmak için doku mikro-dizici ister. Daha sonra, bir ikinci aşamada, delme aleti ile, cihaz tam açıklamalı ve teyit bölgesinde seçilen donör bloktan dokuda delik açar. Çekirdekler daha sonra alıcı blok vericiden aktarılır. </li><li> Yaklaşık 500 çekirdek sonra, ksilen bir bez kullanılarak matkap ve delme aracı temizleyin. </li><li> Doku çekirdekleri (yerine bir ngTMA içine yumruklar daha) istenirse, blok için &quot;PCR&quot; aracını tıklayın 4 işaretlere kadar teyit ve vurmak &quot;Başlat&quot;. Bu yumruk ve 0.2 ml tüp içine çekirdeği transfer olacak. </li><li> Tekrar nokta, ikinci verici bloğu ile 4,9-4,11, vb. </li><li> Tüm donör blokları kullandıktan sonra, doku mikrodizisinden donör blok ikinci turda (61-120) giriner ve adımları 4,8-4,11 devam ediyor. </li><li> Proje ilerleme delme ve delme (Şekil 5C) yapılırken ise donör ve alıcı blok görüntüleri yenileyin. </li><li> Proje tamamlandıktan sonra, bir &quot;Export&quot; gerçekleştirin. Donör ve alıcı blok kimlikleri ile .xslx dosyasını bulun, ihraç klasöründe TMA içindeki tüm yumruklar yanı sıra TMA düzen / tasarım lokalizasyonu. Ihraç klasör (Şekil 5D) jpg görüntü olarak tüm bindirilmiş açıklama ile tüm donör blok görüntüleri kaydedin. Nihai TMA Blok daha sonra hazır hale gelir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4, 844-847 (1998).</li><li>Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray+technology:+principles,+pitfalls+and+perspectives--lessons+learned+from+hematological+malignancies.">Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies.</a> Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).</li><li>Barlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activation+of+ribosomal+protein+S6+kinase+by+complementary+DNA+and+tissue+microarray+analysis.">Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis.</a> J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).</li><li>Bubendorf, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+gene+amplifications+during+prostate+cancer+progression+by+high-throughout+fluorescence+in+situ+hybridization+on+tissue+microarrays.">Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays.</a> Cancer Res. 59, 803-806 (1999).</li><li>Garcia-Caballero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-colour+CISH+is+a+reliable+alternative+to+FISH+for+assessment+of+topoisomerase+2-alpha+amplification+in+breast+carcinomas.">Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas.</a> Breast Cancer Res Treat. , 81-89 (2014).</li><li>Schraml, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+gene+amplification+surveys+in+many+different+tumor+types.">Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types.</a> Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).</li><li>Zlobec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RHAMM+within+the+hierarchy+of+well-established+prognostic+factors+in+colorectal+cancer.">Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer.</a> Gut. 57, 1413-1419 (2008).</li><li>Hsu, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+are+an+effective+quality+assurance+tool+for+diagnostic+immunohistochemistry.">Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).</li><li>Marin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+BRAF+p.V600E+Mutations+in+Melanoma+by+Immunohistochemistry+Has+a+Good+Interobserver+Reproducibility.">Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility.</a> Arch Pathol Lab Med. , 71-75 (2014).</li><li>Polley, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+International+Ki67+Reproducibility+Study.">An International Ki67 Reproducibility Study.</a> J Natl Cancer Inst. , 1897-1906 (2013).</li><li>Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+staining+intensity+in+the+interpretation+of+immunohistochemistry+for+tumor+markers+in+colorectal+cancer.">Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer.</a> Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).</li><li>Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+tissue+microarray+(ngTMA)+increases+the+quality+of+biomarker+studies:+an+example+using+CD3,+CD8,+and+CD45RO+in+the+tumor+microenvironment+of+six+different+solid+tumor+types.">Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types.</a> J Transl Med. 11, 104 (2013).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+ROS1+is+useful+for+identifying+ROS1+rearrangements+in+lung+cancers.">Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers.</a> Mod Pathol. , 711-720 (2014).</li><li>Droeser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+pattern+and+prognostic+significance+of+CD4+,+FOXP3++and+IL-17++tumor+infiltrating+lymphocytes+in+ductal+and+lobular+breast+cancers.">Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers.</a> BMC Cancer. 12, 134 (2012).</li><li>Fleischmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+are+differentially+expressed+in+Gleason+patterns+of+prostate+cancer+and+down-regulated+in+matched+lymph+node+metastases.">Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases.</a> Prostate. 71, 453-460 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+breast+cancer+susceptibility+gene+1+expression+is+a+potential+prognostic+biomarker+in+resectable+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pancreas. 42, 977-982 (2013).</li><li>Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her2+amplification+is+significantly+more+frequent+in+lymph+node+metastases+from+urothelial+bladder+cancer+than+in+the+primary+tumours.">Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours.</a> Eur Urol. 60, 350-357 (2011).</li><li>Zhang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Annexin+A1+protein+expression+in+human+gastric+adenocarcinoma+using+proteomics+and+tissue+microarray.">Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray.</a> World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).</li><li>Chaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+is+frequently+overexpressed+in+penile+squamous+cell+carcinomas:+a+tissue+microarray+and+digital+image+analysis+study+of+112+cases.">The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases.</a> Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).</li><li>McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+breast+tissue+microarray+images+using+contextual+classifiers.">Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers.</a> J Pathol Inform. 4, S13 (2013).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells,+early+metastasis,+and+survival+in+colorectal+cancer.">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).</li><li>Komiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+new+technique,+spiral+tissue+microarrays+constructed+using+needle+biopsy+specimens,+to+prostate+cancer+research.">Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research.</a> Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).</li><li>Quintayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+tissue+microarrays:+A+novel+and+viable+approach+to+optimising+tissue+micro-arrays+for+biomarker+research+applied+to+Ductal+Carcinoma+in+Situ+(DCIS).">Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS).</a> Histopathology. , 2-8 (2014).</li><li>Torata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tablet+method:+an+efficient+tissue+banking+procedure+applicable+to+both+molecular+analysis+and+frozen+tissue+microarray.">Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray.</a> Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).</li></ol>

The authors have no disclosures

Bu yazıda, ngTMA için bir protokol özetlenmiştir. ngTMA planlama ve tasarım, dijital patoloji ve slayt şerh içeren doku microarraying yanı sıra otomatik doku microarraying 12 için yeni kurulan bir kavramdır. Geleneksel ince microarraying ile karşılaştırıldığında, ngTMA birçok avantaj sunmaktadır. Bir ilk adımda, planlama ve tasarım aşamasında kritiktir. Odak hedeflenen araştırma sorusunu yanıtlayan üzerinde. Bu dikkate almalı histolojik konular (örneğin, kaç noktalar Ben istiyorum ki bölgeler ve dahil?), Istatistiksel planlama (örneğin, örneklem büyüklüğü? Sonra benim örnekleri analiz Nasıl?) Ve lojistik hususlar (örneğin, nasıl Birçok biyolojik belirteçler ve bu nedenle kaç kopya ngTMA?). Belirli bir ngTMA bu biyomarkör tarama ve yüksek verimlilik için olup olmadığını, özel ihtiyaçları için veya sadece birkaç iyi seçilmiş cas belirli histolojik yönlerini incelemek için tasarlanmıştıres. Bir değil ise, geleneksel ince kağıttan microarraying en önemli dezavantajı, histolojik slaytlar üzerinde işaretler imal edildiği düşük doğruluğudur. Spesifik histolojik yapıları, hücreler veya bölgelerde çalışma neredeyse imkansız hale gelmektedir. açıklamalar dijital slaytlar üzerinde doğrudan yerleştirilen çünkü ngTMA yüksek doğruluk sağlar. Bu tam olarak bölgelerini seçmek için araştırmacı spesifik hücreler de dahil olmak üzere, delikli sağlar. Bu örnekte, aynı doku bloğu içinde farklı alanları gibi küçük tümör hücre kümeleri ya da tek hücrelerin varlığı ile vurgulanan tümör merkezinde, istilası ve tümör ön / stroma etkileşim sahaları, düzenlenmesiyle dışarı delinir. Bu doğruluğu, ngTMA kullanılarak elde edilebilir. Slaytlar web-tabanlı dijital platform üzerine taranır, çünkü Üçüncüsü, görüntüleme slayt ve not bilgisayar aracılığıyla yerine mikroskop ile yapılabilir. Doku arraying yazılımı kullanıcı dostu sağlarBir yüksek esneklik derecesi, bu nedenle de farklı düzenleri ve ngTMA tasarımı ile arayüz elde edilebilir. TMA inşaat delme tarafından otomatik olarak yapılır bu yana, eller manevra ve inşaat için zamanın miktarı önemli ölçüde azalır az ihtiyaç vardır. Burada, bu örnekte TMA yapımı için süre 24 saat arasındadır. Geleneksel TMA yaklaşımı kullanarak ve saat başına 15 yumruklar tahmin, bu proje yaklaşık 304 saat alacaktı. ngTMA protein ifadesi, mRNA veya DNA yanı sıra, bu kombinasyonları incelemek için de uygulanabilir. 9 potansiyel biyolojik belirteçler bu uygulamaların birçok göstermektedir Şekil. Standart immünohistokimyasal Ki-67 ile kanserlerin çoğalma endeksi belirlemek için uygulanabilir. Bu gibi genler için HER2 protein ekspresyonu ve DNA amplifikasyon araştırmak için kombine olarak kullanılabilir. Dokular maliyetleri, doku kullanımı ve diğer kaynağın azaltılması için tek bir ngTMA üzerinde bir araya getirilebilirs. Buna ek olarak, HER2 ve diğer genler için in situ melezleme, kromojenik mRNA&#39;nın doku örneklerinin minimal numarasını kullanarak vakaların büyük sayıda tek mRNA belirlemek için gerçekleştirilebilir. CD8 gibi bağışıklık belirteçlerin İmmünohistokimya tümörün mikro-ortamı bağlamında görüntülenmiştir. Çift immünohistokimya, aynı zamanda, kanserlerin istila ön (kahverengi etiketlenmiştir), immün (kırmızı etiketli) hücreleri ve tümör hücreleri arasındaki etkileşim gibi ilgi konusu belirli bölgelerini vurgulamak için kullanılabilir. Ilgi Böyle bir bölge, geleneksel doku microarraying kullanılarak yakalanan olamazdı. Bununla birlikte, bu protokolü, bazı sınırlamalar içermektedir. En önemli zorluk donör blok ve dijital slayt arasındaki örtüşme olduğunu. Çeşitli faktörler bu adımı etkileyebilir. İlk olarak, blok en son bölümünde kayma tarama için kullanılmalıdır. Bir çok durumda, H &amp; E donör blok -Rathe son bölümü değilr bir immünohistokimyasal ya da diğer leke olduğunu. Son leke taranmış ve not ya da yeni bir H &amp; E ile yapılmalıdır olduğu üzere, bu durumda, aynı zamanda, bir boyanmış lam sürece kullanılabilir. Dokular slayt ve blok eşleme zorlu yol açan su banyosunda genişleyebilir olarak doku kesitleri yapıldığı zaman da bakımını alınmalıdır. İkincisi, şu anda projelerin tek seferde işlenen 12 alıcı TMA blokları ile sınırlıdır. 12 TMAlar aşan büyük projeler ikinci bir proje adı atanmalıdır. Üçüncü olarak, donör bloklar çeşitli boyutlarda kendini ayarlayamaz aracı olarak, standart kalıp ve kasetleri kullanılarak yapılmalıdır. Son olarak, donör bloklar optimum delme ulaşmak için minimum yüksekliği (4 mm) aşmamalıdır. Bazı durumlarda, bu dokuların reembedding gerektirir. Son birkaç yıldır yayınların Yüzlerce biyomarkör araştırma için değerli bir araç olarak TMA vurgulayın. TMAlar akciğer 13, kolorektal 7, bre incelemek için kullanılmıştırast 14, prostat 15, pankreas 16, mesane 17, ve mide 18 kanserleri, birkaç isim. Yazarların giderek artan sayıda görüntü analizi ve önemli adımlar bu yönde 19-21 yapılıyor ile TMAlar kullanımını birleştirdik. Ancak, yenilikçi TMA fikirleri 22-24 yayınlanmış araştırma grupları bir avuç yanında, biraz dikkat TMA tekniği kendisini optimize verildi. Böyle ATA-27 Estigen / Beecher&#39;la tarafından gibi otomatik doku microarrayers, düzeni tasarım ve uygun ve otomatik doku delme sağlarlar. Ancak bu ngTMA kavramı sadece 1 yönünü temsil eder. ngTMA geleneksel ince microarraying tekniklere kıyasla büyük bir gelişme görülür. Bu dijital patoloji esneklik ve hız ve otomatik TMA inşaat güvenilirliği dijital ek açıklamaları hassasiyetle histoloji ve TMA tasarım uzmanlığı içermektedir. NgTM kombinasyonuProtein ve moleküler belirteçlerin değerlendirilmesi için bir görüntü analizi ve gelecekte daha da klinik ve translasyonel araştırma kalitesini geliştirmek için güçlü bir araç olacaktır.

Son iki yılda, doku mikroarray&#39;ler (TMAlar) biyomarkör soruşturma çalışmaları dikkate değer bir etkisi oldu. TMAlar parafine gömülü &#39;vericinin blok tek bir TMA&#39; alıcının blok içine, esas olarak (Şekil 1), tipik olarak çapı 0,6 ila 2,0 mm arasında değişen boyutu küçük doku çekirdeklerinin tekrar transferi, doku tarafından üretilen &quot;arşiv&quot; 1. Küçük bir çekirdek boyutu kullanarak, az ya da çok farklı hastadan yaklaşık 500 farklı doku noktalar tek TMA 2 içine dizilmiş olabilir. Prognostik veya prediktif biyomarkör çalışmalar için TMAlar kullanımı birçok avantajı vardır. Imünohistokimya ile bir protein biyobelirteci ifade 450 hasta üzerinde değerlendirilecek olan örneği ele alalım. Aksine blokların aynı sayıda kesitli 450 hasta slaytlar üzerinde 450 immünohistokimyasal lekeleri gerçekleştirmek yerine, her örnekten küçük çekirdekler tek bir T üzerine dizilmiş olabilirMA bloğu. Birden çok çekirdek her bir hastadan alınan bile, blok en az sayıda üretilir. Bu şekilde bu masrafları ve diğer bilgi azalan ve doku yıkımı azaltma önemli bir etkisi vardır. Dokuların çok sayıda kullanarak Ayrıca bu uygun güç sağlar çalışmalar aynı deneysel koşullar altında değerlendirilmelidir. TMAlar çeşitli kullanımlara sahiptir. Örneğin bunlar, morfolojisi, protein ekspresyonu RNA ekspresyonunu ve farklı boyalarla boyanması ile DNA sapmaları incelemek için kullanılabilir, ya da in situ hibridizasyon 3-7 immünohistokimya veya kromojenik ve daha sonra fluoresans. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, aynı zamanda, boyama protokolleri içi ve laboratuar varyasyonlarını deneme özgünlük ve belirli gen mutasyon için antikorların oluşturulması duyarlılık ve uluslararası ortak olarak protein ifade gözlemciler tekrarlanabilirliği belirlenmesi için bir tmas kullandık <sus&gt; 8-11. Hasta-türetilmiş dokuları kullanılarak geleneksel TMAlar inşaat uzun bir çok aşamalı prosedür (Şekil 2). Bu alındıktan yerden bir patoloji enstitüsü veya diğer kurum, olası bir uygun durumlarda arama ve arşivlerden teşhis slaytlar seçimi ile başlar. Patolog vaka başına her slayt değerlendirir ve çalışmanın amaçları için en temsilcisi slayt seçer. Daha sonra, ilgi alanındaki bölgenin mikroskop altında doğrudan bir kalem ile işaretlenmiştir. Bu genellikle zorlu ve belirsiz ve sadece doku yumruklar alınmalıdır nerede bir &quot;tahmininde&quot; sonuçlanır. Sonra bu işaretlenmiş slaytlar karşılık parafin bloklar arşivden edilir. Blok ve kızak arasında hızlı bir karşılaştırma yapılır. Bir yarı otomatik veya ev yapımı doku dizici kullanarak, verici bloğu ilgi tahmini bölümünde dışarı doğru itilmekte ve bir alıcı blok içine aktarıldı TMA. Bu arraying tekniği kullanarak TMAlar İnşaat emek yoğun, zaman alıcı, kesin ve sert olduğunu. 3 nüsha olarak 475 noktalar bir TMA hazırlama çalışma yaklaşık 84 saat sürmesi tahmin ediliyor. Planlama ve tasarım (veya danışmanlık), histoloji uzmanlık ve otomatik TMA 12 arraying ile birlikte dijital patoloji: TMAlar inşası için yeni bir yaklaşım son zamanlarda Patoloji Enstitüsü, üç bileşenden dayanmaktadır Bern Üniversitesi tarafından tanıtıldı. Birlikte, bu kavram yeni nesil Doku Mikroarray (ngTMA) denir. Aşağıda, ngTMA için bir protokol metastatik kolorektal kanserli 134 hastanın bir örnek temelinde tarif edilmiştir. Burada primer tümörleri hem de lenf düğümü metastazı ve karaciğer metastazları sonraki analiz için biyomarker ngTMAs içine dizilmiştir edilecektir. Buna ek olarak, her bir hastaya küçük doku çekirdekleri gelecek nükleik asit ekstraksiyonu için arzu edilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic 250 Flash II</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Slide scanner</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TMA Grandmaster</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tissue Microarrayer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic Viewer</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;">free</td>
			<td>Slide viewing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Case Center</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital slide platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

Biyomarker araştırma doku mikrodizilerinin (TMA) dayanır. TMAlar bir &quot;alıcı&quot; blok içine bir &quot;verici&quot; blok küçük doku çekirdeklerinin tekrar transferi ile üretilebilir ve daha sonra biyobelirteç çeşitli uygulamalar için kullanılır. Geleneksel tmas yapımı yoğun emek gerektirmekte, kesin ve zaman alıcıdır. İşte, yeni nesil Doku mikrodizileri kullanarak bir protokol (ngTMA) özetlenmiştir. ngTMA TMA planlama ve tasarım, dijital patoloji, ve otomatik doku microarraying dayanmaktadır. Protokol 134 metastatik kolorektal kanser hastalarının bir örneği ile. Histolojik istatistik ve lojistik yönleri gibi TMA, TMA kopya doku noktalar, örnek büyüklüğü, istatistiksel analiz sayısı ve numarası eklenmesi için doku tipi, spesifik histolojik bölgeler ve hücre türleri olarak, kabul edilir. Her hasta için histolojik slaytlar taranmış ve bir web-tabanlı dijital platform üzerine yüklenir. Orada, onlar inceledi ve ann edilirotated bir 0,6-2,0 mm çaplı aracı, doku alanları ayırt çeşitli renkleri kullanarak birden çok kez kullanarak (işaretli). Donör blok ve 12 &#39;alıcı&#39; blok alet içine yüklenir. Dijital slaytlar alınır ve donör blok görüntülere eşleştirilir. Açıklamalı bölgelerin tekrarlanan arraying otomatik olarak ngTMA sonuçlanan gerçekleştirilir. Bu örnekte, altı ngTMAs altı farklı doku türleri / histolojik bölgesi ile planlanmıştır. NgTMAs iki kopyası arzu edilir. Taranan her hasta için dört slaytlar üç; 3 tarama çalışır ve gerekli gecede gerçekleştirilmez. Tüm slaytlar açıklamalı; Farklı renkler, farklı dokular / bölgeleri, yani tümör merkezi, istila ön, tümör / dokudan lenf nodu metastazı, karaciğer metastazları, ve normal doku temsil etmek için kullanılır. 17 açıklamalar / vaka yapılır; açıklama için süresi 2-3 dk / durumdur. 12 ngTMAs 4,556 noktalarını içeren üretilmektedir. Zaman arraying 15-20 saattir. Nedeniyle hassas, esneklik ve hız, ngTMA güçlüayrıca tmas kalitesini artırmak için bir araç ve klinik araştırma translasyonel olarak kullanılır.

Planlama ve Tasarım İşte biyobelirteçlerinin belirli bir dizi için araştırılmaktadır metastatik kolorektal kanserli 134 hasta örneği kullanılmıştır. Sadece bir ngTMA bu hastalar için planlanan, ancak DNA ekstraksiyon bazı belirtilen genin mutasyon analizi ile takip edilmektedir. NgTMA planlama ve tasarım aşamasında, aşağıdaki hususlar karar verilmiştir. Her hastanın, 6 farklı histolojik bölgeleri araştırılacak: tümör merkezi, tümör istilası ön, yoğun tümör alanları (tümör / stroma etkileşimi), normal doku, lenf nodu metastazı ve karaciğer metastazları tomurcuklanan. Tümör doku alanı başına üç tümör noktalar ve iki normal doku noktalar projesi (n = hasta başına 17 noktalar) dahil edilecek. 50&#39;den fazla biyo-malzeme üzerinde, bu hasta araştırılması planlanmaktadır için, son ngTMA iki kopyası arzu edilir. Bağlı lenf düğümü ve distan olası küçük boyutuT metastaz, bütün dokularda TTB yapımı için 0.6 mm çaplı küçük bir çekirdek tercih edilir. Buna ek olarak, farklı histolojik alanları ihtiva eden 6 ngTMAs üretilecek şekilde her bir bölge ayrı ayrı, dizilmiş edilmesi öngörülmektedir: bir ngTMA a) tümörle merkezi doku ihtiva b) ön istila, c) tümör alanları tomurcuklanma, d) normal doku e) lenf nodu metastazı, f) karaciğer metastazı. Bir 0.6 mm aracını kullanarak TMA tasarımı için, zımbalar arasındaki 0.4 mm rahat bir mesafe seçilecektir. Uzun sıralar ve sütunlar halinde doku noktalar değerlendirme genellikle yorucu olduğundan, iki değişik tasarım seçilir. Doku alanı başına 3 yumruklar ile tümör bloklar için, altı parça içeren bir tasarım oluşturulur. Bu 402 doku zımbalar toplam sayısına yol açmaktadır. Normal doku yumruklar için vaka başına 2 yumruklar dahil edilecektir. Toplam 432 yumruklar uydurma bir düzen seçilir. Ayrıca, her bir durumda, en fazla 40.6 mm iç kısımlar kesilerek çıkarıldı ve ek 0.2 ml&#39;lik tüplere yerleştirilir. Bu doku çekirdekleri de şerh edilecektir. Tüpler için hasta başına 4 çekirdek ek olarak, özetlemek, farklı dokuların 6 ngTMAs üretilecek (1 normal doku dizi x 2 yumruklar x 134 hasta 5 tümör diziler x 3 yumruklar 134 hasta x). Birlikte ele alındığında, 2814 ek açıklamalar yapılacaktır. Sonraki, seçilmiş hastalarda karşılık gelen H &amp; E slaytlar slayt arşivden edilir. Her vaka kısaca bir patolog tarafından incelenir ve her doku tipinin en temsilcisi slaytlar seçilir. Tarama Her histolojik bölümün dijital slaytlar gelecek açıklama için yapılır. Bu çalışma için, 3-4 doku slaytlar muhtemelen komşu normal dokulara, lenf nodu metastazı ve karaciğer metastazı ve ek slayt con olan veya olmayan, yani durumda, birincil kolorektal kanser başına taranacakNormal mukoza taining. Kadar 10 farklı dergi tam slayt tarayıcının içine yüklenebilir; Bu nedenle 250 slaytlar tek bir vadede taranabilir. Tarama ve dijital slayt boyutuna için zaman doku ve arzu edilen kalite faktörü boyutlarına göre değişir. Bu tarama kalitesi bir fark kaybı olmadan daha küçük tarama dosya boyutunu oluşturur beri 0&#39;dan Burada 100&#39;e kalite faktörü aralıkları, 60 bir kalite faktörü seçilir. Küçük biyopsiler 30 sn altında taranabilir ise 2 ile 10 dakika sürebilir Bu örnekte kullanılan olanlar gibi tam doku bölümleri. Dijital slayt boyutu da 2 MB ile 2 GB arasında olabilir. 60 kalite faktörü kullanarak, 600 MB ve 1 GB üretilmektedir arasındaki tarar. 402 ila 536 slaytlar 3 tarama çalışır bulan bu proje için gereklidir. Her bir işlem bir gece boyunca gerçekleştirilir. Yaklaşık depolama alanı 500 GB gereklidir. Slaytlar Olgu Merkezi adı verilen dijital platform üzerine doğrudan taranan (ngtma.unibe.pathcasecenter). Vaka Merkezi belirlenen kullanıcı adı ve şifrenizi girerek her yerden internet erişimi ile erişilebilir. Açıklamalar Açıklama için, iki yönü dikkate alınmalıdır: 1) Farklı doku alanları farklı açıklama renkler verilmeli ve 2) ek not sayısı son ngTMA istenen kopya sayısını yansıtmalıdır. Bu durumda, tek bir kopya tümör alanı başına 3 noktalar seçilmiştir. 2 kopyaları için, her bölgenin 6 noktalar kullanarak şerh edilmelidir. Faydalı uzak metastaz lenf nodu metastazı, turkuaz siyah ve bölgeler olması için nihayet beyaz (tümör / stroma) etkileşimi, tümör tomurcuklanması alanları için kırmızı, tümör yayılması ön için sarı, tümör merkezi için mavi, normal doku için yeşil borular için de kullanılır. Her davanın şerhi 2-3 dk gerektirir. ngTMA İnşaat Bu çalışma 6 ngTMA blok t gerektirirO 12 son blok ile sonuçlanır 2 nüsha olarak tertip edilebilmektedir. Her tümör blok 402 dokusu noktalar içerecektir ve her normal doku blok tüm proje genelinde 4,556 noktalar toplam 268 noktalar, içerecektir dizici tarafından desteklenen olabilir alıcı blok maksimum sayısı 12&#39;dir. Bir TMA düzeni her alıcı blok için oluşturulur ve proje (Şekil 6A, 6B) kaydedilir. 60 doku blokları paralel doku mikro dizicinin yüklenebilir; her bir vericinin blok bir görüntü alınır. İlk donör blok ile başlayarak, ilgili açıklamalı dijital slayt Vaka Merkezi&#39;nden alınır. Slayt uyan 1-3 dakika arasında sürebilir, yapılır. Açıklamalar teyit ve dizici (Şekil 7) delme başlatmak için istenir. Çekirdek delme ve transfer süresi yaklaşık 12 sn. Bu işlem sırasında çekirdek kaybı minimumdur. Bu projeyi arraying Toplam süre sli için zaman dahil, yaklaşık 24 saattirde / blok eşleştirme ve enstrümanın yeniden yükleme. NgTMA bazı örnekleri, Şekil 8A&#39;da gösterilmiştir. Sonraki moleküler analiz için Çekirdekler, gene bu zamanda (Şekil 8B) üzerinden açılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. A) &#39;donör&#39; blok. Donör bloktan Çekirdekler zımbalandı ve B) bir alıcı blok, doku mikrodizisinin (TMA) aktarılır. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> Patolog f verilen Şekil 2. geleneksel doku mikroarray iş akışı. A) histolojik slaytlar arşiv ve B alınır)<html> veya yorum. CD&#39;si) Açıklamalar transferi için &#39;tahmin&#39; bölgesini gösteren slaytlar üzerinde yapılır. D) gelen doku blokları alınır. F) Blok ve slayt eşleştirme için karşılaştırıldığında, hangi G olabilir) bazen zor bir görev olabilir. HJ ) Doku microarraying sonra alır yer. K) Damarlar, art arda transfer edilir ve L) bir nihai TMA inşa edilmiştir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> 25 slaytlar kadar Şekil 3. A) kalite faktörü Düzeltme) tarama. B her bir dergi yerleştirilebilir ve boyut yapılabilir. Tarama ilerleme izlenebilir. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Şekil 4. A) Taranan slaytları web-tabanlı platform, Olgu Merkezi. B) Sayısal slaytlar izlenebilir üzerine yüklenebilir. TTB açıklama aracı kullanıcı Açıklamalar dijital slayt üzerine doğrudan konabilir) açıklama. C için gerekli çekirdek boyutu ve rengi seçmenize olanak verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> 60 blok Yukarı Şekil 5. A) alınır doku mikro dizicinin, yani satır başına 10 donör blokları ve 12 alıcıları blok yanı. B) Her donör bloğun bir görüntü yüklenebilecek, digital slayt alınır. Blok ve sürgünün eşleştirme yapılır ve açıklamalar blok delme aracı delme sırasında düzenlenmesiyle ilerlemesi izlenebilir. ° C). D) için kullanılan delme gerçekleştirildikten sonra düzeninde her bir nokta konumunun bir ihracat ama Ayrıca gelen açıklamalarla her donör bloğun bir görüntü oluşur. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6. Bunlar TTB düzenleri A) tümör blokları ve B), normal dokuları arraying için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> Doku mikro-dizici yazılımın Şekil 7. Screenshot. Solda, 12 yenidencipient blok aracı yerleştirilebilir. Dibinde, her donör bloğun görüntüleri alınır. Merkezi, TMA düzeninde, delme ilerleme gibi açıklamaları ile her donör bloğun büyütülmüş görüntüleri bulundu. <img alt="Şekil 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> Şekil 8. A) yeni oluşturulan ngTMA blokların bazı örnekler. B) Diğer doku yumruklar sonraki moleküler analiz için alınabilir. Bu çekirdekler kesilerek çıkarıldı ve 0.2 ml tüpler içine yerleştirilir. <img alt="Şekil 9," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> Şekil ngTMA biyomarkır uygulamalar 9. örnekler. Kolorektal kanserde Ki67&#39;nin A) İmmünhistokimya boyama. Çift HER2, immünohistokimya / in situ) düşük protein (kahverengi salgılanması) ve sentromer (kırmızı) için Her2 geni (siyah) nisbetle herhangi bir amplifikasyon B gösteren hibridizasyonu deneyi, C) proteinin (kahverengi) ve Her2 gen amplifikasyonu yüksek ifade ( meme kanseri ngTMA tek mRNA gösteren Her2&#39;nin in situ hibridizasyon sentromer (kırmızı) d.) kromojenik siyah) göre belirlenmiştir. Kolorektal kanserde CD8 E) İmmünohistokimya. F) pan-sitokeratin işaretleyici AE1 / AE3 (kahverengi Çift immünohistokimyası leke; tümör hücreleri) ve CD68 (kırmızı;. Makrofajlar) kolorektal kanserde tümör mikro vurgulayarak <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies at JoVE.com

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Protokol biyomarker araştırma için inşaat ve doku microarrays kalitesini optimize edilmesini amaçlamaktadır. Bu planlama ve tasarım, dijital patoloji, sanal slayt açıklama ve otomatik doku arraying yönlerini kapsamaktadır.

Biyomarker Çalışmaları için bir sonraki nesil Doku Mikrodizi (ngTMA) Protokol

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

a-next-generation-tissue-microarray-ngtma-protocol-for-biomarker

Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.8K Görüntüleme.  University of Bern.  Protokol biyomarker araştırma için inşaat ve doku microarrays kalitesini optimize edilmesini amaçlamaktadır. Bu planlama ve tasarım, dijital patoloji, sanal slayt açıklama ve otomatik doku arraying yönlerini kapsamaktadır. 

Video: A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

Psikolojik Stres Başlatmaya Trier Sosyal Stres Testi Protokolü

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Tıp

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

Endotel Keratoplasti için Kornea Donör doku hazırlanması

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

İnsan Pankreas için Toplama Protokolü

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of microvasculature at the site of inflammation. Parabiotic partners share their circulating antigens and thus are free of adverse immune reaction. First described by Paul Bert in 18641, the parabiosis surgery was refined by Bunster and Meyer in 1933 to improve animal survival2. In the current protocol, two mice are surgically joined following a modification of the Bunster and Meyer technique. Animals are connected through the elbow and knee joints followed by attachment of the skin allowing firm support that prevents strain on the sutured skin. Herein, we describe in detail the parabiotic joining of a ubiquitous GFP expressing mouse to a wild type (WT) mouse. Two weeks after the procedure, the pair is separated and GFP positive cells can be detected by flow cytometric analysis in the blood circulation of the WT mouse. The blood chimerism allows one to examine the contribution of the circulating cells from one animal in the other.

Parabiotic joining of two organisms leads to the development of a shared circulatory system. In this protocol, we describe the surgical steps to form a parabiotic connection between a wild-type mouse and a constitutive GFP-expressing mouse.

Farelerde parabiyoz: Detaylı Bir Protokol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that cause tissue degeneration during ageing. Cancer, with incidence rates greatly increasing with age, is characterized by short telomere lengths and high telomerase activity. To study the roles of telomere dysfunction and telomerase reactivation in ageing and cancer, the protocol shows how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)-inducible TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) and Lox-Stopper-LoxTERT (LSL-mTERT). The protocol describes the procedures to induce telomere dysfunction and reactivate telomerase activity in mTERT-ER and LSL-mTERT mice in vivo. The representative data show that reactivation of telomerase activity can ameliorate the tissue degenerative phenotypes induced by telomere dysfunction. In order to determine the impact of telomerase reactivation on tumorigenesis, we generated prostate tumor model G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L and thymic T-cell lymphoma model G4 Atm-/- mTERTER/ER. The representative data show that telomerase reactivation in the backdrop of genomic instability induced by telomere dysfunction can greatly enhance tumorigenesis. The protocol also describes the procedures used to isolate neural stem cells (NSCs) from mTERT-ER and LSL-mTERT mice and reactivate telomerase activity in NSCs in vitro. The representative data show that reactivation of telomerase can enhance the self-renewal capability and neurogenesis in vitro. Finally, the protocol describes the procedures for performing telomere FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) on both mouse FFPE (Formalin Fixed and Paraffin Embedded) brain tissues and metaphase chromosomes of cultured cells.

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the knees by using different forms of mesenchymal stem cells (MSCs). In Korea, bone marrow concentrates and cord blood-derived stem cells have been approved by the Korean Food and Drug Administration (KFDA) for cartilage regeneration. In addition, an adipose tissue-derived stromal vascular fraction (SVF) has been allowed by the KFDA for joint injections in human patients. Autologous adipose tissue-derived SVF contains extracellular matrix (ECM) in addition to mesenchymal stem cells. ECM excretes various cytokines that, along with hyaluronic acid (HA) and platelet-rich plasma (PRP) activated by calcium chloride, may help MSCs to regenerate cartilage and improve knee functions. In this article, we presented a protocol to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with OA. The result of the protocol was first reported in 2011 followed by a few additional publications. The protocol involves liposuction to obtain autologous lipoaspirates that are mixed with collagenase. This lipoaspirates-collagenase mixture is then cut and homogenized to remove large fibrous tissue that may clog up the needle during the injection. Afterwards, the mixture is incubated to obtain adipose tissue-derived SVF. The resulting adipose tissue-derived SVF, containing both adipose tissue-derived MSCs and remnants of ECM, is injected into knees of patients, combined with HA and calcium chloride activated PRP. Included are three cases of patients who were treated with our protocol resulting in improvement of knee pain, swelling, and range of motion along with MRI evidence of hyaline cartilage-like tissue.

Here, we present a protocol to produce an adipose tissue-derived stromal vascular fraction and its application to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with osteoarthritis.

Yağ dokusundan elde edilen Stromal vasküler kesir için potansiyel kıkırdak rejenerasyon üreten klinik protokol

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) may detect adverse events of interventions such as fluid overload at an early stage. The Simple Intensive Care Studies (SICS) is a research line that focuses on the prognostic and diagnostic value of combinations of clinical variables.
The SICS-I specifically focused on the use of clinical variables obtained within 24 h of acute admission for prediction of cardiac output (CO) and mortality. Its sequel, SICS-II, focuses on repeated evaluations during ICU admission. The first clinical examination by trained researchers is performed within 3 h after admission consisting of physical examination and educated guessing. The second clinical examination is performed within 24 h after admission and includes physical examination and educated guessing, biochemical analysis and CCUS assessments of heart, lungs, inferior vena cava (IVC) and kidney. This evaluation is repeated at days 3 and 5 after admission. CCUS images are validated by an independent expert, and all data is registered in an online secured database. Follow-up at 90 days includes registration of complications and survival status according to patient&#39;s medical charts and the municipal person registry. The primary focus of SICS-II is the association between venous congestion and organ dysfunction.
The purpose of publishing this protocol is to provide details on the structure and methods of this on-going prospective observational cohort study allowing answering multiple research questions. The design of the data collection of combined clinical examination and CCUS assessments in critically ill patients are explicated. The SICS-II is open for other centers to participate and is open for other research questions that can be answered with our data.

Structured protocols are necessary to provide answers on research questions in critically ill patients. The Simple Intensive Care Studies (SICS) provides an infrastructure for repeated measurements in critically ill patients including clinical examination, biochemical analysis and ultrasonography. SICS projects have specific focus but the structure is flexible to other investigations.

Gözlem çalışması protokolü için tekrarlanan klinik muayene ve kritik bakım ultrasonografi basit yoğun bakım çalışmaları içinde

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) ...

A Porcine Heterotopic Heart Transplantation Protocol for Delivery of Therapeutics to a Cardiac Allograft

Cardiac transplantation is the gold standard treatment for end-stage heart failure. However, it remains limited by the number of available donor hearts and complications such as primary graft dysfunction and graft rejection. The recent clinical use of an ex vivo perfusion device in cardiac transplantation introduces a unique opportunity for treating cardiac allografts with therapeutic interventions to improve function and avoid deleterious recipient responses. Establishing a translational, large-animal model for therapeutic delivery to the entire allograft is essential for testing novel therapeutic approaches in cardiac transplantation. The porcine, heterotopic heart transplantation model in the intraabdominal position serves as an excellent model for assessing the effects of novel interventions and the immunopathology of graft rejection. This model additionally offers long-term survival for the pig, given that the graft is not required to maintain the recipient's circulation. The aim of this protocol is to provide a reproducible and robust approach for achieving ex vivo delivery of a therapeutic to the entire cardiac allograft prior to transplantation and provide technical details to perform a survival heterotopic transplant of the ex vivo perfused heart.

We present a protocol for utilizing a normothermic ex vivo sanguinous perfusion system for the delivery of therapeutics to an entire cardiac allograft in a porcine heterotopic heart transplant model.

Terapötiklerin Kardiyak Allogrefte Verilmesi için Domuz Heterotopik Kalp Transplantasyonu Protokolü

Cardiac transplantation is the gold standard treatment for end-stage heart failure. However, it remains limited by the number of available donor hearts ...