We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).

Bu deneyler için kullanılan tüm insan dokuları Chicago&#39;daki Illinois Üniversitesi&#39;nde Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylı protokol ve / veya muafiyet yoluyla elde edildi. 1. Bölüm Taze Donmuş Prostat PEN-slayt üzerine ve Ücretli Cam Slide üzerine <ol><li> Bir gün önce veya bir kaç saat numune kesit önce, temiz araçlar (yani, fırça, forseps, coplins, bıçaklar, PEN-çerçeveli slaytlar (değilse zaten RNaz ücretsiz), bir ETOH güvenli işaretleyici ve bir kalem) ve iç Bir sprey şişesi ve laboratuar mendil kullanarak çözüm-dekontaminasyon RNaz RT Kriyostat. <ol><li> RNaz dekontaminasyon çözüm silerek önce 5 dakika boyunca oturup çözüm ve (depcH 2 0 ile hazırlanan)% 70 EtOH ile son durulama RNaz-dekontaminasyon üzerinde sol kaldırmak için depcH 2 0 ile durulayın izin verin. Not: Bir RNaz ücretsiz çalışma alanı korumak için şarttır. Tüm coplins, araçlar, dondurulmuş montaj orta, bıçaklar ve kullanılan slaytlar RNaz ücretsiz iş için yalnızca kullanılmalıdırve standart bir olmayan RNaz ortamda hiç kullanmadım. Tüm enstrümanlar her deneyden önce bir Rnase dekontaminasyon solüsyonu ile tedavi edilmelidir. </li></ol></li><li> -24 ° C&#39;ye soğutun kriyostat. </li><li> Önce Kesit en az 30 dakika soğumasını kriyostat içinde aşağıdaki temizlenmiş RNaz ücretsiz araçlar yerleştirin: slayt coplin dolu% 100 etanol, araçlar, küçük dondurulmuş doku kaset ve montaj mandren ile. </li><li> Taşınması için bir kuru buz dolu bir köpük halinde dondurulup ve kova yere donmuş prostat dokusunu al. En az 30 dakika boyunca sıcaklık kriyostat denge sağlaması için kriyostat halinde doku yerleştirin. Not: lazer yakalama mikro diseksiyon İnsan prostat dokuları taze dondurulmuş veya da olabilir parafine gömülü (FFPE) formalin ile fikse. Zaman kısıtlamaları ve slayt hazırlama doku kaynakları arasında biraz farklıdır. Burada donmuş kesitler için adımları açıklar. </li><li> Bir seferde bir doku ile Çalışma ve botto içine donmuş montaj orta fışkırtmaKasetin m ve hızlı bir şekilde soğutulmuş forseps kullanılarak dondurulmuş montaj ortama donmuş prostat dokusunu monte edin. </li><li> Dondurulmuş montaj orta ayarlamak için 5 dakika süreyle kriyostat içinde soğutucu üzerine doku ile kaseti yerleştirin. </li><li> Chuck üzerine dondurulmuş montaj orta küçük bir miktar Squirt ve dikkatle dondurulmuş montaj ortamına kadar monte doku alt tarafı basın. 5 dk dondurulmuş montaj orta tamamen katılaşmaya izin vermek için kriyostat ayarlanır edelim. </li><li> Tutucu içine aynasını yerleştirin ve sıkın. </li><li> Kilitli pozisyonda kolu kilitleyin ve kriyostat üzerine yeni bir bıçak yerleştirin. Amplifikasyon aşamasını içerir aşağı moleküler uç noktaları için (yani, qPCR) bu bulaşmayı önlemek (veya sonraki numune için bıçak alanı kullanabilirsiniz üzerinde bıçağı taşımak) her hasta için yeni bir bıçak kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Kolu kilidini ve dikkatle eşitlemek için elle veya bir ayak pedalı ile doku ilerlemek ve 50 mikron ile doku maruzistenen doku maruz kadar m bölümleri ulaşılır. </li><li> 5 um Kriyostat ayarlayın, bir veya iki bölümleri kesmek ve hematoksilen ve eozin (H &amp; E) boyama için ücret cam slayt üzerine yerleştirin (Adım 2). </li><li> Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt yerleştirin. </li><li> Etanol tahsil cam slayt çıkarın ve H &amp; E boyama (Adım 2) geçmeden önce oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Bir çerçeve destekçisi RT PEN-çerçeve slayt yerleştirin. </li><li> RT PEN çerçeve slaytlar üzerine 10 mikron ve yer bölümlerine Kriyostat ayarlayın. Bir dört bölümler doku büyüklüğüne bağlı olarak her bir slayt üzerine bir yer olabilir. </li><li> Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt dalma. </li><li> Etanol PEN-frame slaytları çıkarın ve LCM için hazır olana kadar -80 ° C derin dondurucuda bir desiccator kutusunda bir slayt kutusuna slayt saklayın. Üç gün Optimal RNA kurtarma için maksimum depolama süresidir. </li><li> Tahsil cam kaydırdı SADECE Adım 2 ile devam edine. PEN-frame slayt için Adım 3 ile devam edin. </li></ol> 2. Hematoksilen Eozin ve-Y (H &amp; E) histolojik Mark-up için Leke Not: Bu yüklü cam slayt doku ve DEĞİL LCM PEN-çerçeve slayt için eğer. <ol><li> Aşağıdaki gibi derecelendirilmiştir etanol ile slayt daldırma yüklü cam slayt bölümleri hidrat: 3 dakika için iki% 70 etanol içinde bir kez 3 dakika boyunca, 3 dakika süre ile kayıcı% 95 etanol içinde iki kez% 100 etanol içinde iki kez daldırma 3 dakika boyunca damıtılmış H 2 O zamanlar. <ol><li> 99 ml% 70 etanol + 1 mi% 1 HCI ve% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi: 100 ml içinde 0.1 g sodyum bikarbonat damıtılmış H2O asidi alkolü çözeltisi hazırlayın </li></ol></li><li> 5 dakika boyunca hematoksilin Gill II (% 0.4) slayt batırın. </li><li> 3 dakika sürekli çalışan musluk H 2 O aşırı leke yıkayın. </li><li> Kayıcı asit alkol 10 kez batırın </li><li> 3 dakika boyunca musluk H 2 O çalışan slayt yıkayın. </li><li> Slayt Dip% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi içinde 30-60 sn mavi mor renge dönüşür için. </li><li> 3 dakika boyunca musluk H 2 O çalışan slayt yıkayın. </li><li> 10 dips% 95 etanol içinde slayt durulayın. </li><li> 15 saniye toplam Eozin-Y 2-3 kez slayt batırın. </li><li> Aşağıdaki gibi kademeli etanol ile slayt dehydrate: Ksilen slayt% 95 etanol içinde iki kez,% 100 etanol içinde iki kez ve iki kez daldırma (doku kapsamlı dehidratasyon gösterir açıkça göründüğünden emin olun). </li><li> Sulu olmayan kalıcı sabit montaj orta ve kapak kayma ile slayt monte edin. </li><li> 30 dakika boyunca slayt kurumasını bekleyin. </li><li> Herhangi bir tam slayt tarayıcı ile tarama slayt ve 8 &quot;x 11&quot; kağıt üzerine bir büyük, yüksek çözünürlüklü görüntü yazdırmak. </li><li> Ilgi Anahat alanları işaretleyici ile (genellikle bir kurul onaylı patolog tarafından yapılır). Bu biçimlendirme LCM prosedürü için kılavuzdur. </li></ol> PEN-frame Slaytlar 3. Toluidine Mavi Boyama Not: ThLCM olarak AYNI GÜN yapılır edilir. Tüm çözümler için depcH 2 O su kullanın. RNaz ücretsiz alan tüm adımları tamamlayın. Tüm coplins RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenmelidir. <ol><li> LCM gün 2 dakika süreyle daha sonra 2 dakika süreyle% 90 EtOH içine yavaşça daldırma slaytlar tarafından% 75 EtOH -80 ° C derin dondurucuda ve hidrat gelen PEN-frame slaytları çıkarın. <ol><li> Daha sonra oda sıcaklığında 0.2 um&#39;lik bir filtreden ve mağaza sterilize filtre moleküler biyoloji sınıfı su içinde eritilmesi ile% 0.5 toluidin mavisi hazırlayın. Bu çözelti, en fazla 6 ay süreyle yeniden kullanılabilmektedir. Not: Bu son derece öncesinde filtrasyon birkaç saat sürebilir olarak solüsyonu hazırlamak için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Yavaşça 5-30 saniye boyunca% 0.5 toluidin mavisi içine slaytlar batırarak prostat dokusunu Leke. Yıkama ile doku 3 dakika için 30 saniye için% 75 EtOH, ardından 15 saniye boyunca depcH 2 O 2 kez slaytlar destain. Not: Leke ve destain süreleri iyi boyama sağlamak için ayarlanabilir. Prostat leke üzerinde eğilimindedir. </li><li&gt; buz üzerinde RNAaz serbest kuru kaba PEN-kare slaytlar aktarın. </li></ol> 4. Lazer yakalama Mikro diseksiyon (LCM) <ol><li> LCM, 15 dakika boyunca 42 ° C &#39;de sıcak bir slayt kuru slayt hemen önce. Işlenmiş ve onlar için hazır olana kadar buz üzerinde kalan saklamak olacak Kuru, sadece slayt. </li><li> LCM ve bilgisayar bu sırada, mikroskop gücü, lazer tuşu, lazer anahtarı ve ardından bilgisayarı açın. Lazer Diseksiyon yazılımını başlatın. </li><li> Slaytlar ve toplama tüpleri yüklemek için mikroskop kontrol etmek için yazılımı kullanın. Daha sonra &quot;Devam&quot; butonuna tıklayınız, &quot;boşaltma numune tutucu&quot; üzerine tıklayın aşağı bakacak şekilde doku ile mikroskop lamı sahibinin üzerine bölümleri ile slayt yüklemek ve mikroskopta uygun yuvaya slayt tutucu takın. <ol><li> &quot;Boşaltma toplama tüpleri&quot;, etiketin üzerine tıklayın ve tüp tutucu üzerine 0.5 ml tüpler yüklemek ve enstrüman uygun yuvaya takın. bir Zamanlarkapaklar toplama kapaklar Lizis tampon 35 ul ekleyin ve kabarcıkları önlemek için deneyin, güvencesindedir. Daha sonra &quot;Tamam&quot; a tıklayın. Not: 25 ul lizis tamponu 10 ul depcH2O ile: buharlaşma bir sorun varsa, aşağıdaki gibi tampon sulandırmak. </li></ol></li><li> Yazılımda, slayt slayt tutucuya yerleştirildi konumu seçin. LCM numune toplamak için toplama kapağı seçin. </li><li> Görselleştirmek ve 10X de bilgisayar aracılığıyla slayt odaklanır. Ardından &quot;kalibre&quot; &quot;Laser&quot; seçerek lazer kalibre etmek için yazılımı kullanın. Lazer ışını tamamen ve verimli seçilen alanı kesmek için izin lazerin güç, diyafram ve hız, seçme &quot;lazer&quot;, sonra &quot;kontrol&quot; ayarlayın. Tamamen doku içinden lazer kesim kadar ayarlamalar tekrarlayın. </li><li> Bir kılavuz olarak 8 &quot;x 11&quot; patolog mark-up kullanarak, epithe istenilen alanlarını sınırlamak için &quot;şekil çizmek&quot; aracını kullanıngörünümünde Lium herhangi bir stroma toplama önlemek. Birden alanlar tek bir görünümde içinde seçilebilir, ancak &quot;şeklinde kesmek&quot; aracını tıklayarak ilk kesme olmadan başka görünüme hareket etmiyor: Not. <ol><li> Bir alan tamamen lazerle kesilmiş olsun yoksa manuel üzerine gitmek için &quot;hareket ve kesim&quot; aracını kullanın. Yeni görüşlere hedefi hareketli Devam ve slayt tamamen disseke edilir veya doku istenilen miktarda tahsil edilene kadar lazer kesim tekrarlayın (tipik olarak 100 huylu bezleri RNA 150-500 ng verim). (Şekil 1A örneğe bakın). </li></ol></li><li> Dikkatle kapaklar lizis tamponu ve doku dikkatli olmak, tahsilat sahibinin tüpleri kaldırmak ve kapaklarını kapatın. Kısaca tüpünün dibinde sıvı ve doku toplamak 30 sn için santrifüjlenir. RNA izolasyonu için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de 30 dakika ve mağaza 42 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Bir Fil ile 5. Toplam RNA izolasyonuter bazlı Takımı ve Kalite Analizleri <ol><li> Buz üzerinde tüpler dışarı çözülme ve 100 ul çözümün ses getirmek. </li><li> Filtrenin merkezine 30 ul ofLysis Çözüm uygulayarak RNA izolasyon kiti, mikro filtre önceden ıslak ve sonraki iki adımı (en azından 5 dakika) whileperforming bekletin. </li><li> Lizat (kitte sağlanan) LCM katkı maddesi çözeltisi 3 ul ilave edin ve 5 saniye için vorteks ile karıştırılır. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için 30 saniye boyunca santrifüjleyin. </li><li> Sıvıyı çıkarmak için en yüksek hızda 30 saniye ~ için önceden ıslatılmış filtre santrifüj. </li><li> Yukarı ve aşağı yavaşça, lizat karışımına girdap ya da pipet% 100 etanol (bu durumda 129 ul) 1.25 hacimleri ekleyin. ** Bu yöntem, büyük ve küçük RNA türleri hem de kurtaracaktır. </li><li> 1 dk filtreye RNA bağlamak için 10.000 xg&#39;de önceden ıslatılmış mikro filtre üzerine numuneyi ve santrifüj yükleyin. Daha sonra yıkama solüsyonu 1, R &quot;, 180 ul mikro filtre yıkama21; 1 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj. Not: Tüm santrifüj bu nokta 13.000 xg veya maksimum hızda yapılmalıdır seçin. </li><li> Kit protokol tarafından yönlendirildiği gibi yıkayın sırasıyla &quot;Yıkama çözümlerinin 2 ve 3&quot; 180 ul ile iki kez filtre. Santrifüj bakiye akışkan maddeyi ortadan kaldırmak ve kurutun 30 sn için, daha sonra akış atmak ve 1 dakika boyunca filtreyi dönerler. </li><li> Yeni bir koleksiyon tüpüne filtreyi aktarın. </li><li> (Takım ile birlikte verilme), -95 ° C&#39;ye kadar sıcak Elüsyon çözeltisi. </li><li> Filtrenin merkezine önceden ısıtılmış yıkama çözeltisi 10 ul uygulayın, kapağını takın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca muhafaza edin. Daha sonra RNA elüte etmek için 1 dk için santrifüj ve ~ RNA 20 ul elde etmek için bu adımı bir kez tekrarlayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca DNaz I tedavi gerçekleştirin. </li><li> 260 nm&#39;de absorbans ile spektrofotometre ile RNA ölçmek. 260 nm ve 280 nm dalga boylarında optik yoğunluk oranı saflığını değerlendirmek için kullanılırRNA 15 (Tablo 1). </li></ol> 6. Gen İfadesi Analizi Not: (mRNA ve lncRNAs gibi) uzun bir RNA türünün gen ekspresyonunu Aşama 6.1 ve kısa RNA türünün (mikroRNA gibi) gösterilir aşama 6.2&#39;de gösterilmiştir. Farklı kitleri RT-qPCR için kullanılabilir ve gerekli RNA miktarı (10 ng kadar az) kiti göre değişir. RNA sekans analizi, 6.3 tarif edilmektedir. <ol><li> Arka uyarlamak (RT) 5 RT ana karışımı ul (RT tampon maddesi, dNTP&#39;ler, rastgele primerler, RT enziminin, RNaz inhibitörü) ile 20 ng 5 ul / RNA örnek ul karışım cDNA&#39;ya RNA&#39;nın. 37 ° C&#39;de, sonra 120 dakika 25 ° C&#39;de 25 dakika boyunca reaksiyon inkübe ve 85 ° C &#39;de 5 dak. </li><li> RNaz içermeyen su ile RT reaksiyonu 1:10 seyreltin ve ilgi genleri için primer ya da primer / prob setleri ile 10 ul qPCR reaksiyon başına 2.5 ul kullanın. Not: kısmen bozulmuş RNA analizini kolaylaştırmak için bu fo primerler kullanılması tavsiye edilirr kısa amplikonlar (az 100 bp) 16. (Tablo 2B) <ol><li> MicroRNA ifade analizi için RT usta karışımı 5 ul 2-10 ng 5 ul / RNA örnek ul karıştırılarak RT reaksiyonu çalıştırın. Not: her biri ticari olarak temin edilebilen PCR bazlı mikroRNA algılama teknolojisi, özel ve özel bir RT primerleri kullanılmasını gerektirir. </li></ol></li><li> Alternatif olarak veya RT-PCR ilave olarak, RNA farklı türler ölçmek için yeni nesil dizilimi (RNA seq veya küçük RNA seq) kullanın. Genellikle, bu prosedür (Tablo 3) RNA 500 ​​ng kullanımı ve üretimi ve tespit aracı ile gösterildiği gibi yöntemi gerçekleştirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Schauer, I. G., Rowley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+reactive+stroma+in+benign+prostatic+hyperplasia.">The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia.</a> Differentiation. 82, 200-210 (2011).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).</li><li>McNeal, J. E., Haillot, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+spread+of+adenocarcinoma+in+the+prostate+as+related+to+cancer+volume.">Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume.</a> The Prostate. 49, 48-57 (2001).</li><li>Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+and+micro-RNA+expression+analysis+in+laser-capture+microdissected+prostate+biopsies:+valuable+tool+for+risk+assessment+and+prevention+trials.">mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials.</a> Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transcriptome+analysis+of+formalin-fixed+prostate+cancer+specimens+identifies+biomarkers+of+disease+recurrence.">Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence.</a> Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-coding+and+microRNA+biomarkers+of+recurrence+of+prostate+cancer+following+radical+prostatectomy.">Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy.</a> The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).</li><li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+vitamin+D+hydroxylases+and+inflammatory+genes+in+prostate+stroma+and+epithelium+by+1,25-dihydroxyvitamin+D+in+men+with+prostate+cancer+and+an+in+vitro.+model.">Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model.</a> The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).</li><li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+microRNAs,+miR-100+and+-125b,+are+regulated+by+1,25-dihydroxyvitamin+D+in+primary+prostate+cells+and+in+patient+tissue.">Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue.</a> Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC cell biology. 11, 95 (2010).</li><li>Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+prostate+cancer+epithelial+and+interstitial+stromal+cells+using+laser+capture+microdissection.">Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection.</a> BMC cancer. 10, 165 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+microRNA+profiling+of+prostate+carcinomas+with+increasing+tumor+stage+by+deep+sequencing.">Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing.</a> Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).</li><li>Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+siRNAs+and+noncoding+RNA-derived+small+RNAs+are+expressed+in+adult+mouse+hippocampus+and+are+up-regulated+in+olfactory+discrimination+training.">Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training.</a> Rna. 17, 166-181 (2011).</li><li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+analysis+of+microRNAs+in+prostate+cancer+by+next-generation+sequencing.">Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing.</a> The Prostate. 75, 500-516 (2015).</li><li>Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+six+RNA+extraction+methods+for+the+detection+of+classical+swine+fever+virus+by+real-time+and+conventional+reverse+transcription-PCR.">Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR.</a> Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).</li><li>Kong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+short+amplicons+in+FFPE-derived+long-chain+RNA.">Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA.</a> Scientific reports. 4, 7246 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

İnsan örneklerden gen ekspresyonu kalitesi veya uygun bir doku miktarı için değil, aynı zamanda, belirli bir doku numunesinde mevcut olan çeşitli histolojik kişiler için değil, sadece zor olabilir. Bu iyi huylu dokular büyük ölçüde stromal doku ve kanser alanlardır stroma yoksun olduğu prostat özellikle zordur. LCM, iki farklı hücre tipleri (Şekil 1A) daha doğru bir imza prostat stroma ve epitel RNA fiziksel olarak ayrılmasını kolaylaştırır. Macrodissection veya bütün doku...

Prostat bezi, öncelikle düz kas 1 oluşan Fibromusküler stroma ile çevrili glandüler asinüs düzenlenmiş salgı epitel oluşan heterojen bir dokudur. Bazal hücreler, salgı hücreleri, nöroendokrin hücre transit yükselterek hücre ve kök hücre 2: epitelial bölmesi, beş farklı ama organize hücre tiplerinin oluşur. Luminal epithelial hücrelerde ortaya çıkar, prostat kanseri (PCa) &#39;de, adenokarsinom büyüme stromal bölmesinde 3 arasında belirgin bir aşamalı bir düşüş olur. Bu nedenlerden dolayı, doku örnekleri PCa ölçüde göre stromal ve epitelyal hücre tipinin orantılı olarak belirgin farklılıklar vardır. Bu farklılıklar, istenen hücre tipi mikrodiseksiyon bakılmaksızın tüm dokulardan elde edilen gen ekspresyon verileri yanlı varsayımlar yol açabilir. Bu nedenle, bu önyargı kaldırmak için onu önce RNA ekstraksiyon ve hücre tiplerini ayırmak için esastırgen ekspresyon analizi. Macrodissection ya mikrodiseksiyon fiziksel çevredeki stroma 4 -6 den iyi karakterize edilmiş epitelyal alanları ayırmak için kullanılabilir. Macrodissection tipik bir mikroskop altında bir jilet ile yapılan ve büyük PCa stromadan nodüller ayırmak için iyi çalışır, ancak stroma çevreleyen benign epitel kaldırma yeteneğine sahip değildir (Şekil 1&#39;de huylu prostat histoloji örneğe bakın). Bir lazer (LCM) ile Mikrodisseksiyonla macrodissection önemli ölçüde daha fazla emek yoğun, ama çok doğru bir iyi huylu epitel 4 incelemek olabilir. Bizim laboratuardan Son yayınlar RNA başarıyla formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) biyopsi veya dondurulmuş doku 4,7-9 birinden LCM tarafından elde edilebilir olduğunu göstermiştir. LCM-RNA ekstraksiyonu büyük zorluklar R 1) doğru dokuda istenilen alanlarını incelemek için, ve 2) korumak için vardırLCM ve izolasyon işlemi 4.10 sırasında NA bütünlüğü. Saf hücre popülasyonlarının izole RNA ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) 7,8, mikrodizi 11 ve derin -sequencing 12-14 dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle gen ekspresyon analizi için kullanılabilir. Bu protokolün amacı, aşağı doğru gen ekspresyon analizleri donmuş dokudan LCM prostatik epitel toplam RNA&#39;nın izole edilmesi için.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNase-AWAY&#160;</td>
			<td>MBP</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN-membrane 4,0 mm slides&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11600289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides, Superfrost Plus</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon labs.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining jar)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M900-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining rack)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M905-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperio ScanScope</td>
			<td>Aperio(Leica)</td>
			<td>ScanScope&#174; CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>89640-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous&#174;-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>203301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin stain&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3536-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Richard Allan Scientific&#160;</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Bir önceki çalışmada aynı hastadan 4 dondurulmuş ve FFPE prostat dokularından mRNA ve microRNA RT-qPCR ifade profilleme karşılaştırmak epitel ve stromal doku toplamak için LCM kullanımını gösterdi. LCM RNA büyük miktarda nesil sekans analizi için toplanacak olan, özellikle de zaman alıcıdır. Bu nedenle, çalışma alanı tutmak için çok önemlidir ve araçları ücretsiz RNaz. (Bir sonraki paragrafta daha ayrıntılı olarak ele) toplandı RNA kaliteli ve hücre-özgüllük kontroller...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis at JoVE.com

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

laser-capture-microdissection-human-prostatic-epithelium-for-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

13.3K Görüntüleme.  University of Illinois at Chicago. The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Video: Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Proteomik Analizi İnsan Vitreus Gövde Elemanları diseksiyonu

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Tıp

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Prostat Karsinogenezde ve İyi Huylu Prostat Büyümesi ve Değerlendirilmesi için böbrek Kapsül Xenografting ve Derialtı Pelet İmplantasyonu

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Diyabet ile gözleri bir balık eğitim: mikrodiseksiyon, görselleştirme ve yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara analizi

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the quality of life. BPH includes 2 major treatments: medication and surgery. Surgical treatment is often the most effective and final intervention. Holmium laser enucleation of the prostate (HoLEP), one of the most efficient surgical procedures for BPH, is conducted transurethrally. During surgery, the most important and most difficult part is to locate the surgical capsule of the prostate, which is consistent to the idea of anatomic surgery. Different skills may be needed in treating different parts of the prostate. HoLEP tends to be efficient and safe with good hemostatic properties, and able to treat bladder calculus, which may be the complications of BPH. The technique is particularly suitable for prostate of varying volumes and sizes. Indeed, HoLEP also presents certain disadvantages, such as a long learning curve and costly equipment. Regardless, this method may be the "new standard" and the excellent method for the surgical treatment of BPH.

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate HoLEP.

Here we present a safe and efficient protocol, holmium laser enucleation of the prostate, to treat benign prostatic hyperplasia.

Benign Prostatik Hiperplazi için cerrahi tedavi: holmiyum lazer enükleasyon prostat (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak Vitro ve In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Dejeneratif Retina Hastalıkları için İnsan Dışı Primat Modelinde Retina Pigment Epitel Transplantasyonu

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...