Kronik HBV enfeksiyonunda, CD4 T hücreleri hem viral boşlukta hem de geri dönenlerde önemli roller oynar. Bu yöntem, HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmemizi ve HBV'ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamamızı sağlar. Prosedürü gösteren jianmei Xiao, bir araştırma asistanı.
Ve Xing Wan, Bilao'dan bir teknisyen. Başlamak için, 20 dakika boyunca 800 kez G'de Ficoll yoğunluk gradyan santrifüjleme kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerini veya PBMC'leri kandan izole edin. Daha sonra, bir pastör pipet kullanarak granülositleri ve kırmızı kan hücresi tabakası arasında toplayın.
Çözülmüş hücre süspansiyonu 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarın, Önceden ısıtılmış Benzonase RPMI 1640'ın bir mililitresini ekleyin, akıllıca bırakın, sonra yavaşça altı mililitre daha ekleyin. Kalan hücreleri almak için kriyo şişesini iki mililitre Benzonase RPMI 1640 ile durulayın. Daha sonra tüpü 10 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin.
Üstnatantı çıkarın ve tüpe dokunarak peletin gevşeyin. Peleti bir mililitre sıcak Bensenase NACE RPMI 1640'ta hafifçe yeniden askıya alın. Hücreleri hafifçe karıştırın ve herhangi bir hücre topaklanması görünüyorsa, 70 mikrometre hücre süzgecinden filtreleyin.
Trippan mavisi ve hemositometre kullanarak uygulanabilir hücreleri sayın. Mililitre IL2 başına 10 birim ve mililitre IL7 başına 10 nanogram içeren PBMC'leri ve komple kültür ortamını yeniden askıya alın. Mililitre başına 6 hücreye hücre yoğunluğunu 1,5x10 olarak ayarlayın.
Daha sonra hücreleri 96-Kuyu düz alt plakalarda kuyu başına 3x10'luk bir yoğunlukta beşinci hücrelere plakalayın. Her Kuyuya hepatit B virüsü veya HBV türevi peptit havuzları ekleyin. Arka plan ve pozitif kontrol Wells için aynı miktarda çözücü ekleyin.
Plakaları 37 santigrat derecede ve%5 karbondioksitte kuluçkaya yatır. Üçüncü günde, kültür ortamını IL2 mililitresi başına 50 birim ve IL7 mililitresi başına 10 nanogram ile tamamlar. Yedinci günde, kültür ortamının yarısını mililitre peptit başına dört mikrogram, mililitre IL2 başına 100 birim ve mililitre IL7 başına 20 nanogram içeren taze ortamla değiştirin.
10. günde, hücre kümelerini toplamak için her Kuyudaki hücreleri yedi ila dokuz kez hafifçe pipetle. HPV'ye özgü CD4 T hücre yanıt analizi için 96 Kuyu yuvarlak alt plakanın her bir kuyusuna uygulanabilir hücre sayısını sayın ve beşinci hücrelere 2x10 aktarın. 96-Well düz alt plakadaki artık hücreler için, aşırı ortamı atarak kültür ortamının hacmini 100 mikrolitreye ayarlayın.
Daha sonra, kültürü mililitre peptit başına dört mikrogram, mililitre IL2 başına 100 birim, mililitre IL7 başına 20 nanogram içeren 100 mikrolitre taze, tam kültür ortamı ile tamamlayın. 12. günde epitop tanımlaması için hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte kültlü hale devam edin. 96 Kuyu yuvarlak alt plakadaki hücreleri 200 mikrolitre RPMI 1640 ekleyerek, plakayı üç dakika boyunca 550 kez G'de santrifüjleyarak ve süpernatantı atarak yıkayın.
Son yıkama için tam kültür ortamını kullanarak yıkamayı iki kez tekrarlayın. Belirli bir peptit havuzu ile uyarılan her hücre kuyusu için, aynı peptit havuzu ile desteklenmiş 200 mikrolitre tam kültür ortamı ekleyin. Arka Plan Kontrol Kuyusu için, mililitre başına bir mikrolitre DMSO ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin.
Pozitif Kontrol Kuyusu için mililitre DMSO başına bir mikrolitre, mililitre PMA başına 150 nanogram ve iyonomisinin litresi başına bir mikromole ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede%5 karbondioksitte altı saat kuluçkaya yatır. Bir saatlik inkübasyondan sonra, kültüre mililitre monensin başına 1.37 mikrogram ekleyin.
Altı saatlik inkübasyon tamamlandıktan sonra, plakayı üç dakika boyunca 550 kez G'de santrifüjleyin. Üstnatantı çıkarın ve hücreleri daha önce gösterildiği gibi 200 mikrolitre DPP ile bir kez yıkayın. CD3, CD4 ve CD8 yüzey belirteçleri ve canlılık işaretleyicisi için leke.
Hücreleri vibratörle askıya aldıktan sonra plakayı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede soğutun. Plakayı 200 mikrolitre DPBS ile bir kez yıkadıktan sonra, hücreleri sabitleyin ve permeabilize edin, hücre içi sitokinler, TNF Alfa ve Interferon-gama için lekeleyin ve plakayı dört santigrat derecede 45 dakika soğutun. Hücreleri bir kez daha yıkayın ve 150 mikrolitre akış sitometri tamponunda yeniden askıya alın.
Ardından, akış sitometresi kullanarak akış sitomemetri verilerini alın. Alerjenik B-lenfoblastoid hücre hatlarını veya BLCL'leri bir T-75 şişesinde koruyun. PBMC genişlemesinin 12.
Hücreleri 10 dakika boyunca 350 kez G'de santrifüjleyin ve üst saltantı çıkarın. Hücre peletini ve tam kültür ortamını yeniden askıya alın. Daha sonra BLCL'leri kuyu başına dördüncü hücrelere 4x10'da 96-Well yuvarlak bir alt plakaya ve 80 mikrolitre tam kültür ortamına aliquot.
Tek bir peptitin mililitresi başına 10 mikrogram ekleyin ve iki arka plan kontrolü ayarlayın. HLADR blokajı ile peptit titreşimi ve DMSO titreşimi. Plakaları iki saat boyunca 37 santigrat derece ve%5 karbondioksitle kuluçkaya yatır.
Mililitre Mitomycin C başına 100 mikrogram ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir saat kuluçkaya yatırın. Plakası 200 mikrolitre RPMI 1640 ile üç kez yıkayarak itici peptidi ve Mitomisin C'yi çıkarın, ardından vibratör kullanarak hücreleri 120 mikrolitre tam kültür ortamında yeniden askıya alın. PBMC genişletmesinin 12.
Plakadaki hücreleri santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi 200 mikrolitre RPMI 1640 ile iki kez yıkayın. PBMC'leri her kuyuda 210 mikrolitre tam kültür ortamıyla yeniden askıya alın. Epitop tanımlaması için seçilen PBMC Wells için, hücre süspansiyonunun 70 mikrolitresini aliquot ve iki arka plan kontrolü de dahil olmak üzere üç Kuyuda peptit darbeli BLCL'lerle karıştırın.
Plakayı 37 santigrat derecede ve%5 karbondioksitle altı saat kuluçkaya yatır. Bir saatlik inkübasyondan sonra, kültüre mililitre monensin başına 1,37 mikrogram ekleyin ve her kuyudaki son hacmi tam kültür ortamı ile 200 mikrolitreye getirin. Bu temsili örnekte, peptid havuzu Core11 için TNF Alpha ve Interferon-gama salgılayan CD4 T hücre yanıtları, arka plan değerlerinin iki katından daha düşüktür, bu nedenle negatif olarak kabul edilir.
Bu arada, peptit havuzu Core09 için yanıtlar arka planın iki katından daha yüksektir ve olumlu olarak kabul edilir. Gri arka plan, pozitif CD4 T hücre yanıtına sahip Wells'i ve epitop tanımlama için aday peptitlerin kırmızı ile belirtildiğini, Core01'in sütun peptit havuzlarındaki CD4T hücrelerini salgılayan hem TNF Alpha hem de Interferon-gama'dan değerlendirildiğinde en yüksek yanıt oranına sahip olduğunu gösterir. Bu peptit havuzunda C1 ila 15, C31 ila 45, C61 ila 75 ve C91 ila 105 peptitleri, bu peptitleri içeren peptit havuzlarının sırası da olumlu sonuçlar gösterdiğinden aday peptitler olarak ayarlanır.
Peptit havuzları core07, 08, 09 ve 10 ile genişletilen PBMC'ler, bu peptitlerin epitop tanımlaması için kullanılır. Benzer şekilde, Core09 satır peptit havuzlarında en yüksek yanıt oranına sahiptir. Bu havuzdaki tüm peptitler aday peptitler olarak ayarlanır ve peptit havuzları ile genişletilen PBMC'ler:Core01, 02, 03, 04, 05 ve 06 bu peptitlerin epitop tanımlaması için kullanılır.
Peptit havuzu Core08 genişletilmiş PBMC'ler için, peptit C31 ile 45 darbeli BLCL ile uyarılmadan sonra, TNF Alpha ve Interferon-gama salgılayan CD4 T hücrelerinin frekansları arka plan kontrollerinden iki kat daha yüksektir. Bu nedenle, peptit C31 ila 45 doğrulanmış bir HLADR sınırlı CD4 T hücre epitopsudur. Oradaydı, epitop tanımlamadan sonra kalan ek genişletilmiş PBMC'ler.
Tanımlanan epitopların ince işaretlemesi kısaltılmış peptitlerden oluşan bir panel kullanılarak yapılabilir.
