Sarah A. Alfaqeeh Diş Hekimliği, Yüksek Eğitim Bakanlığı, Suudi Arabistan Krallığı Kind of Saud University College tarafından finanse edilmektedir.

1.. Kurma <ol><li> (Mineral yağ ile yağlanmış bir bileme taşı kullanarak) diseksiyon aletleri keskinleştirmek ve% 70 etanol sprey ve kuru ısı sterilizasyonu organ kültürü kullanmadan önce sterilize edin. 12 V kaynağı kullanarak 2 M sodyum hidroksit elektroliz kullanarak diseksiyon iğneler keskinleştirmek. </li><li> Glutamax,% 1 ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Advanced Modified Eagle Medium F12 (F12 DMEM) &#39;den oluşan, embriyonik organların diseksiyon ve kültür için kullanılan kültür ortamı hazırlayın. </li></ol> 2. Embriyo Diseksiyon <ol><li> Home Office ya da diğer yönetim kurulu tarafından onaylanan bir program bir yöntem kullanarak bir zamanlanmış evlendirdi hamile kadın itlaf. Alt karın çevresinde cilt uzak teşrih ve makas kullanılarak karın açmak kesti. Alt orta hatta birbirine bağlamak, iki rahim boynuzları, bulun. </li><li> Buz üzerinde orta ile dolu bir tüp içinde rahim ve yerde parçalara ayır. When, buz üzerinde, doku birkaç saat bırakılabilir. </li><li> Mikroskop altında ortam içinde bir Petri tabağına rahim ve yer çıkarın. Mümkün embriyo kontaminasyonu en aza indirmek için diseksiyon bir laminar akış başlığı içinde yapılmalıdır yerde. </li><li> Rahim embriyolar inceleyin ve onların Extraembryonic dokulardan onları serbest. </li><li> Bir tungsten iğne kullanılarak embriyolar başını kesmek ve ortam taze bir çanak içine kafaları aktarın. </li><li> Ağız boşluğu içine bir iğne koyarak kafaları çenenin izole ve başın arkasında (Şekil 1A ve 1B) doğru kesilmiştir. Doğrama için beklerken İzole çeneler geçici olarak buz üzerinde ortamda saklanabilir. </li><li> Bütün mandibula dilimleri için E11.5-E15.5 diş mikrop kültürü için idealdir aşamaları. E15.5 sonra mandibulada gelişen kemik doğrama için çok zor. Diş dilimleri hala yapılabilir, ancak kemik (dentary ve şekillendirme alveol kemiği) ilk olarak çıkarılması gerekir9 doğrama önce diseksiyonu. Tungsten iğneler ve forseps kullanılarak dikkatlice kemiği kaldırmak. </li></ol> 3. Embriyo Dilimleme <ol><li> Standart bir tablo doku kıyıcı (Şekil 1C) kullanarak mandibul doku dilimleri hazırlayın. Yaklaşık 200 mandibulalarındaki sonra taze bir bıçak kullanın ve düştüğünde o montaj diski ile aynı hizada emin olun. </li><li> Montaj Diski temizleyin ve kullanımdan önce% 70 etanol ile bıçak. Makineyi kullanırken bıçak çok keskin olduğu gibi bakım, alınmalıdır. </li><li> Numunenin yaşına göre um 200-400 arasında bir kesme mesafede helikopteri ayarlayın ve bütün diş mikrop gerekli olup olmadığına bağlı. Maksimumda bıçak kuvvet ayarlayın. </li><li> Bir pipet veya forseps kullanarak plastik montaj diske bir çene aktarın. Yönelim hala net olduğundan emin diskin yapımı üzerine mandibulayı düzenleyin. Gelişmekte olan dil yönünü belirlemek için yararlı bir dönüm noktası olarak kullanılabilir. Molarlar kullanım af içinkesici dişler için bunlar (Şekil 2A&#39;da doğrama uçak bakınız) büyüdükçe, bu dişlerin farklı yönüne göre çenenin üzerinden bir sajital dilim kullanırken Rontal / enine yönlendirme, (Şekil 1B doğrama uçak bakınız). </li><li> Biraz montaj diskte mandibulayı kurutmak için filtre kağıdı kullanılarak doku etrafında aşırı ortamı çıkarın. </li><li> Hemen kurutulduktan sonra, helikoptere dairesel paslanmaz çelik bir levha üzerine disk yerleştirin. Makineyi açın ve basın başlangıç. Bu tablo, aynı zamanda bıçak taşıyan kol doğrama yükseltilir ve / dk kadar 200 vuruş da düşmüştür soldan sağa doğru otomatik olarak geçmektedir. </li><li> Doku tamamen dilimlenmiş edildikten sonra makineyi kapatın. Bıçak kolu yükseltilmiş konumda olduğundan emin olun ve diski çıkarın. Bıçak kolunun altında parmaklarınızı yerleştirin veya doğrama zaman gözetimsiz makineyi bırakmayın. </li><li> Montaj diskini alın ve hemen orta t eklemeko sırayla disk üzerinde dilimler aşırı kurumasını önlemek için. Dikkatlice orta küçük bir Petri kabı (Şekil 2A) bir tungsten iğne ve daha sonra bir pipet kullanarak diskin altındaki doku dilimlenmiş çıkarmak. </li><li> Bir iğne kullanılarak dilim ayrı ve daha sonra bir stereo (Şekil 1D, 1E ve 2B) altında, ilgi konusu doku içeren doku dilimleri seçin. Ortam ile taze kültür tabaklarında seçilen dilimleri yerleştirin. </li></ol> 4. Dilim Kültür <ol><li> , Su kaybını önlemek için, dış oyuğuna otoklavlanmış suyun yaklaşık 2 ml ilave etmek suretiyle ve çanak merkezinin bir metal ızgara konumlandırılmasıyla kültürü için hazır orta-gözenekli organ kültür kapları hazırlayın (Şekil 3A ve 3B). </li><li> Yaklaşık 4 cm paslanmaz çelik hasır levhalar 1,5 cm x şeritler keserek metal ızgaralar hazırlayın. Merkezinde bir delik yapmak ve bükmek için bir delik yumruk kullanınzikzaklı uç oluşturmak için taraf. Izgara çanak (Şekil 3A ve 3B) dibine paralel olarak uzanan merkezi oyuk boyunca düz oturmalıdır. Kullanmadan önce sterilize etmek ızgaraları otoklavlayın. </li><li> Saydam polietilen tereftalat bir parça ızgara deliği kaplayacak kadar geniş (PET) zan (gözenek boyutu 0.4 um) kesin. Seçilen dilim ile çanak içine kesilmiş membran yerleştirin. </li><li> Zarın üzerine dilim yerleştirin ve daha sonra dikkatli bir şekilde merkezinde yassı dilim ile ortam dışında membran kaldırın. </li><li> Merkezindeki dairesel delik boyunca ızgara üzerinde filtre yerleştirin ve zarın seviyesine kadar, iyi kültür ortamı, yaklaşık 1 ml. </li><li> Manipülasyonlar (örneğin, 8) orta proteinler ya da küçük molekül inhibitörleri eklemek için. </li><li> Kültür 0. günde morfolojisinin bir rekor için dilim fotoğrafını. </li><li> % 5 CO nemli bir atmosferde bulaşıkları yerleştirin <sBir inkübatör içerisinde 37 ° C &#39;de&gt; 2 ub. </li><li> Ortalama 7 gün boyunca düzenli aralıklarla kültürleri Fotoğraf. Kültür ortamı, her 48-72 saat değiştirin. Fotoğrafçılık için altında (Şekil 2C-E) bir ışık kaynağı ile dilimleri görmek. </li></ol> 5. Lineage İzleme Soy izleme gerekli ise, bu tür DII veya dio gibi lipofilik boyalar aşama 4, dilim kültür önce diş mikrop içine enjekte edilebilir. <ol><li> Bir iğne çektirmenin kullanarak cam kılcal iğneler çekin. </li><li> Forseps kullanılarak iğne ucu kırmak ve aşağı boya çözeltisi içine ucu ile. Boya kılcal hareket ile ucuna doldurur süre birkaç dakika bekletin. </li><li> Bir tutucu içine doldurulur iğne yerleştirin ve bir enjektör ya da ağız aspiratörüne boru yoluyla eklemek. </li><li> Etiketlenecek nedeniyle dilimin dokunmaktan kültür ortamı içinde iğne ucu yerleştirin. Iğne, bir dışarı boya küçük bir miktar yerinden hava basıncı uygulayındoku üzerine d. </li><li> İğneyi çıkarın ve floresan altında etiketleme için kontrol edin. </li><li> Başarıyla etiketli dilimleri filtrelerine aktarılmış ve aşama 4&#39;te tarif edildiği gibi kültüre edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+dental+mesenchyme:+dynamic+development+of+the+dental+papilla+and+follicle.">Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle.</a> Developmental biology. 366, 244-254 (2012).</li><li>Ferguson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+an+essential+early+mesenchymal+signal+in+tooth+development+that+is+required+for+patterning+of+the+murine+dentition.">Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition.</a> Genes &amp; development. 12, 2636-2649 (1998).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).</li><li>Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+primary+and+secondary+enamel+knots.">Cell lineage of primary and secondary enamel knots.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).</li><li>Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+relationship+between+Tbx1+and+FGF+signaling+during+tooth+morphogenesis+and+ameloblast+lineage+determination.">A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination.</a> Developmental biology. 320, 39-48 (2008).</li><li>Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+tooth+bud+mesenchyme+to+alveolar+bone.">Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone.</a> Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).</li><li>Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mesoderm+to+the+developing+dental+papilla.">Contribution of mesoderm to the developing dental papilla.</a> The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).</li><li>Buchtova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+patterning+of+the+snake+dentition+are+dependent+on+Sonic+hedgehog+signaling.">Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling.</a> Developmental biology. 319, 132-145 (2008).</li><li>Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+regression+of+the+dental+lamina+underlies+the+development+of+diphyodont+dentitions.">Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions.</a> Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).</li><li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+enamel+knot+determines+the+position+of+the+first+buccal+cusp+in+developing+mice+molars.">The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars.</a> Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).</li><li>Sakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+in+cervical+loop+epithelium+during+transition+from+crown+to+root:+implications+for+Hertwig's+epithelial+root+sheath+formation.">Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation.</a> Journal of periodontal research. , (2012).</li><li>Fisher, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+in+vitro+of+the+whole+and+halved+lower+molar+tooth+germ+of+the+mouse.">Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse.</a> Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).</li><li>Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars:+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells,+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units,+the+cusps.">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li><li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development.">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li><li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme:+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction.">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Diş kültürün Bu yöntem diş mikrop erişim avantajı doğru soy epiteli veya mezenşimin içinde izleme ve boncuk yerleştirme sağlayan, mükemmel vardır. Gelişmekte diş mikrop Tanımlı bölgeler dolayısıyla özellikle hedef alınabilir. Kültür sırasında diş mikrop değişen morfoloji takip edilebilir, ve manipülasyonlar etkisi hızlı bir şekilde değerlendirilmiştir. Bu doğru kıyılmış olamaz gibi bir yöntem olup, bununla birlikte, bu tür dentin ve emaye gibi sert...

Deneyler bir dizi için bu kültür dokusu ex vivo gelişimini takip edebilmek için önemlidir. Doku geliştirme Kültür gelişiminin tanımlanmış dönemlerinde erişim sağlayan ve kültür ortamına faktörlerin eklenmesiyle genlerin manipülasyon ya da yüklü boncuklar üzerine ve transfeksiyon ve elektroporasyon 1 kullanılmasıyla sağlar. Birçok deneyleri için o büyüdükçe doku morfolojilerinden maruz soy olarak etiketlenmiş hücrelerin kaderini takip etmek, örneğin, doku görselleştirmek edebilmek için önemlidir. Bu embriyo bir doku bloğu kültürlenir zaman açık değildir derin embriyo içinde geliştirmek dokular, özellikle sorunlu olabilir. Onlar mandibula, maksilla ve frontal burun süreç içinde geliştirmek gibi Dişler, bu iyi örneklerdir. Bütün çene kültive edildiğinde sabit doku kesit sonra dişin yüzeysel yapıları izlenebilir ancak morfolojisindeki değişiklikler sadece analiz edilebilir <skadar&gt; 2. Biz, bize diş mikrop gelişimini takip etmesine ve geliştirme sırasında dişin farklı bölgelerine erişim sağlayan canlı bir dilim kültür tekniği adapte var. Değiştirilmiş Trowell Yöntem 3 kullanılarak, gaz-sıvı arayüzünde teknik kültürler diş mikrop dilimleri,. Bu dilim kültürler doğrudan dişin morfolojilerinden ardından ve bu emaye düğüm ve diş papilla ve folikül 1,4-7 gibi farklı bileşenleri, soy izleme sağlayan çok yararlı olmuştur. Bu teknik, fare embriyoları ile sınırlı değildir ve başarılı bir domuz kültür canlı dilimleri ve yılan dental doku 8,9 etmek için kullanılmıştır. Diş gelişimi görselleştirmek olmanın yararına ilave olarak, dilim yöntemi de doku ince dilim inkübatörden orta ve havadan besin erişim artmıştır avantajına sahiptir. Bu in vivo gelişme neticesinde diş mikrop, ve gösteri invas geliştirilmiş büyümesiyle sonuçlanırpapilla 7 içine endotel hücre iyon. Buna karşılık, bütün alt çene kültürlerde diş mikrop vivo olarak daha yavaş geliştirmek ve kültürün orta uzun süreli kültürlerde nekrotik genellikle. Dilim kültüründe, diş çene bir dilim içinde gelişir ve çevresindeki gelişen kemik ve diğer dokuları ile etkileşimi izlenebilir. Bizim yöntemde doku düz bir destek ortamında 10,11 gömmek için gerek ve kesme blok için doku eklemek için herhangi bir sistem için gerek diseksiyon sonra doğranır. Yöntem birçok altçeneler tek oturumda kesitli izin veren, bu nedenle noninvaziv ve hızlıdır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101077Y</td>
			<td>100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Advanced Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>Cell-labeling solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Cell tracker CM-DiI, C-7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geminator 500</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>Thomas No. 3885A20</td>
			<td>Dry-heat sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Standard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 &#956;m pore size)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>PET track-etched membrane, 6-well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>FE228710</td>
			<td>(Fe/Cr18/Ni10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td>Intracel Ltd</td>
			<td>051-0500-900 0-100 psi</td>
			<td>Single channel picospritzer III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary with filament 1 mm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.1 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.38 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>Used for mouth aspiration lineage tracers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the slice culture method for following development of tooth germs in explant culture

Eksplant kültür belirli zaman noktalarında organ geliştirmeyi ve manipülasyon, bu nedenle gelişimsel biyolog için önemli bir yöntemdir sağlar. Birçok organ için bu ex vivo kültür sırasında izleme sağlamak için gelişmekte olan doku ulaşmak zordur. Dilim kültür yöntemi sağlar dokusu erişim böylece morfogenetik hareketleri takip edilebilir ve belirli bir hücre popülasyonları manipülasyon veya soy izleme için hedef olabilir. Bu yazıda tür bir dizi diş mikrop kültürü için çok başarılı olmuştur dilim kültürü için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, diğer çene dokular tarafından çevrili in vivo gözlenene benzer bir oranda, en geliştirmek diş mikrop, mükemmel erişim sağlar. Bu, diş ve çevreleyen doku arasında doku etkileşimleri takip edilmesine olanak sağlamaktadır. Bu kağıt mikropların diş üzerinde yoğunlaşmaktadır de, aynı protokolü bir dizi gelişme takip uygulanabilirBöyle tükürük bezleri, Meckel kıkırdağı, burun bezleri, dil ve kulak gibi diğer organlara,.

İlk molar diş kökü hareketini takip etmek amacıyla, 250 um frontal kesitler, yukarıda tarif edilen yöntemi kullanılarak alt çeneye ile alınmıştır. Diş kökü, gelişmekte olan dişin dış emaye epitel (OEE) çevreleyen mezenşimin tabakası olan ve daha önce periodonsiyum 6 dokusu oluşumuna katılmak için gösterilmiştir. Altçeneler E14.5, diş gelişimi kapak aşamasında disseke edildi. Dilim ise diş epitelyumun anahat açıktı ve yoğuşmalı dental mezenşimin diş epitel (Ş...

Watch this Scientific Journal Video about The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture at JoVE.com

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Burada detay doku helikopter kullanarak mandibul dilimler kültür diş mikroplar için bir yöntemi biz. Bu yöntem, daha geleneksel kültürü yöntemleri kullanılarak mevcut manipülasyon ve soy izleme, değil mükemmel bir fırsat sağlayarak, gelişimi sırasında dişe eşsiz erişim sağlar.

Eksplantasyon Kültüründe Diş mikropların Geliştirme takiben için Dilim Kültür Yöntemi

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

the-slice-culture-method-for-following-development-tooth-germs

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Görüntüleme.  King's College London.  Burada detay doku helikopter kullanarak mandibul dilimler kültür diş mikroplar için bir yöntemi biz. Bu yöntem, daha geleneksel kültürü yöntemleri kullanılarak mevcut manipülasyon ve soy izleme, değil mükemmel bir fırsat sağlayarak, gelişimi sırasında dişe eşsiz erişim sağlar. 

Video: The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Biyoloji

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Gen Tabancası İşaretleri ve Dilim Kültür Nöronlar Biyolistik Transfeksiyon hazırlanması

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

İnsan bağırsak mukozasının eksplantlar Kültür ve Polarize Uyarım için Yeni Bir Yöntem

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.