Bu çalışma, Agence Nationale de la Recherche (proje ANR-2010-BLAN-1535) tarafından ve Bölge Ile-de-France (DIM-Malinf 110058) bir hibe ile desteklenmiştir.

1.. Protein Üretimi ve Saflaştırılması <ol><li> Mexa, Pseudomonas aeruginosa&#39;dan MexB <ol><li> , Bir E. Mexa ve MexB genleri barındıran plasmidleri Transform coli üretim suşu (örneğin C43 DE3). LB agar levhalar ortam, uygun antibiyotik ile takviye edilmiştir. O / N Önlüktür aşılamak için tek bir koloni seçin. Ertesi sabah, LB 1 L ön kültür aşılamak ve çalkalanarak (240 rpm) 37 ° C&#39;de büyür. </li><li> Hücreler üstel faz ulaştığında (OD 600 = 0.6-0.8) 1 mM IPTG ile neden. Ajitasyon altında 30 ° C&#39;de 2-3 saat boyunca indüksiyon yapın. </li><li> Santrifüj hücreleri (20 dakika boyunca 9,000 x g) ve 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCI 150 mM olarak tekrar süspansiyon. </li><li> Bir Fransız basını (10,000 psi, 4 geçişi) kullanarak hücreleri bozar. 20 dakika boyunca 9,000 x g de santrifüj ile bozulmamış hücreler ve cisimciği atın. </li><li> 100.000 xg ve r Pelet membranlar 1 saat30 ml Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 20 gliserol (a / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl, her pelet esuspend. </li><li> BCA kolorimetrik deneyi kullanılarak toplam membran protein konsantrasyonu belirlenir ve bu, deterjan şekilde belirlenen bir son hacim içinde% 2 dodesil maltoside (DDM) ile zarları O / N çözündürülmesi: protein (a / a) 1:1.5. </li><li> Non çözündürülmüş ve toplanmış malzemenin atmak için 1 saat boyunca 100,000 x g&#39;de Ultrasantrifüj. </li><li> Bir nikel reçinesi (Mexa saflaştırma) ya da Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 5 gliserol ile dengelenmiş bir kobalt reçinesi (MexB saflaştırma) ile 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe supernatant (ağ / h), 10 mM imidazol, NaCl 500 mM, DDM% 0.2. </li><li> Boş bir sütunun içindeki reçineyi dökün. Sayesinde Akışı toplayın. </li><li> Daha sonra Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 20 gliserol (a / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 DDM, Bis-Tris 10 mM, pH 6, gliserol, 25 ml ile 50 ml reçine yıkayın % 5 (ağ / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 DDM. </li><li> P Zehir20 mi Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 5 gliserol (ağ / h), 300 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 ile DDM K&#39;e. </li><li> Bir imidazol içermeyen tampon maddesi ile dengelenmiş bir tuz giderme kolonu üzerinde 3 ml ve yüke göre aşağı bir ultrafiltrasyon cihazı ile protein konsantre edilir. Sadece daha önce sulandırma (aşağıya bakınız), çözünür proteinler lipid ve çözülmeyen proteinlerin kurtulmak için (20 dakika boyunca 100,000 xg) Ultrasantrifüj. Daha sonra 0.3 ml yeniden protein konsantre edin. </li></ol></li><li> Halobacter salinarium dan bacteriorhodopsin <ol><li> 4 M NaCl, MgSO 4 150 mM, 10 mM sitrat, 30 mM KCl, maya özütü 5 g / L, pepton ve 5 g / L ihtiva eden bir likit büyüme ortamı içinde 10 gün boyunca 37 ° C&#39;de aydınlatma altında Halobacter salinarium hücrelerin büyümesine </li><li> Iyonu giderilmiş suya karşı diyaliz hücreleri bozabilir. </li><li> Bir% 30-40 üzerinde mor membran (ağ / hac) sakroz gradyanı (17 saat boyunca 100,000 x g) saflaştırılır. </li><li> % 2 octylgluc ile zar süspansiyonu çözünürleştirilir37 ° C (: protein oranı, 2:01 (a / a) deterjan de membran tekrar süspansiyon için çözündürme için hacim) 24 saat boyunca oside. Ε (570 nm) = 54000 M-1cm-1 ile çözündürülmüş BR konsantrasyonunu tahmin. Sadece daha önce sulandırma (aşağıya bakınız), lipidler ve çözülmeyen proteinlerin kurtulmak için çözündürülmüş BR (20 dakika boyunca 100,000 xg) Ultrasantrifüj. Not: yerel Zarlar doğal çok daha fazla saflaştırma gerekli br zenginleştirilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. Proteoliposomes hazırlanması <ol><li> Lipozom sistemi: bir cam beher içinde kloroform ile (25 mg / ml) içinde çözülmüş DOPC 400 ul koyun ve bir toz olarak saklanır kolesterol 1,5 mg ekleyin. Bir cam kap içinde, en az 1 saat boyunca azot ya da sadece bir vakum buhar altında manipülasyon önce onları kurutun. DOPC: kolesterol mol oranının 3.3:1 olduğunu. <ol><li> Bu kuruduktan sonra, 25 mM HEPES pH 7, 1 ml ile lipitleri hidratK 2 SO 4 100 mM, 2 mM MgCl2, 2 mM pyranine. Süspansiyon bu aşamada bulanık görünmelidir. </li><li> 37 ° C&#39;de 10 dakika için çözüm ısıtın 30 saniye darbe, oda sıcaklığında 30 saniye aralık döngüsü ile 40 W da 10 dakika için sonikasyon. Süspansiyon bu aşamada net görünmelidir. </li><li> Lipozomların bir tek dağılımlı popülasyonu elde etmek için, ekstrüzyon, iki döngü yapabilir ve her bir döngü için, en az 11x filtreden lipozom süspansiyonu geçmektedir. İlk çevrim için, 200 nm&#39;lik bir zar gözenek boyutuna kullanımı ve ikinci çevrim için, 100 nm&#39;lik bir zar gözenek boyutu kullanın. Dinamik ışık saçılım ölçümleri, süspansiyonun homojenliğini kontrol etmek için bu aşamada gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> Protein şirketleşme İlke: zar proteinleri deterjanların çözündürücü etkisi sayesinde Lipozomlar içinde yeniden edilebilir. Deterjan-çözünebilir lipozomlar p-çözünür deterjan zar proteini ve oluşumu ile kuluçkalanırroteoliposomes polistiren boncuklar 9 deterjan hızla ortadan kaldırılması ile tetiklenir. <ol><li> Triton X-100 (son% 0.56) içinde 28 mg eklenir ve 4 ° C (çözünürleştirme sıcaklık, protein çalışılmaktadır adapte edilebilir) de O / N inkübe edin. </li><li> Çözündürülmüş lipozomlara deterjan-çözünür protein (BR, MexB ve Mexa) ilave edin ve 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe Lipidler / MexB = 20, MexB / Mexa = 2.5 ve lipidler / BR = 30: Aşağıdaki oranlarda (ağırlık / ağırlık) seviyesinde çözündürülmüş lipozom süspansiyonuna proteinleri ekleyin. </li><li> (Saflaştırılmış protein ile eklenmiştir deterjan içeren deterjan toplam ağırlığı göz önüne alındığında w / w,) deterjan oranı ve yumuşak altında oda sıcaklığında (nedeniyle BR) karanlıkta 5 saat, inkübe edilir: a 30:1 boncuk polistiren boncuk ekleyin karıştırıldıktan. Bundan önce prosedüre, metanol ve etanol inkübasyon ile Biobeads etkinleştirmek ve yaygın olarak, su ile yıkayın. </li><li> , Bir PD-10 kullanılarak proteoliposomes protein ve serbest alt tabakaları arındırınHEPES, 25 mM pH 7, K 2 ile dengelenmiş tuz alıcı sütun SO 4 100 mM ve 2 mM MgCI2. </li><li> Kadar 2-3 hafta boyunca karanlıkta 18 ° C &#39;de proteoliposomes saklayın. </li></ol></li><li> Sükroz gradyanı üzerinde yeniden oluşturma etkinliğinin değerlendirilmesi. MexB ve BR hem lipozomlarda yeniden olup olmadığını kontrol etmek için, bir süreksiz sukroz gradient proteoliposome süspansiyon arındırmak. <ol><li> Yavaşça sakaroz beş tabakalı bir gradyanı üzerinde proteoliposomes yerleşmek (% 60,% 20,% 10,% 5 ve% 2.5 ağ / h). </li><li> (Minimal hızlanma ve yavaşlama oranları ile) 100,000 xg&#39;de 17 saat Ultrasantrifüj. </li><li> Dikkatlice çeşitli gradyan fraksiyonları (sükroz her katman arasında özellikle arayüzler) toplamak ve Coomassie boyama ya da Batı lekeleme ile SDS-PAGE (% 10) üzerinde analiz. Katılmayan, deterjan-çözünür proteinler en üstünde bulunan ise kümelenen proteinlerin, tüpün alt kısmında bulunantüpü. Proteoliposomes ve lipozomlar, kendi iç yoğunluğuna karşılık gelen sükroz arabirimleri bulunur. Boş lipozomlar proteoliposomes daha Degradede öteye kurtarıldı. </li></ol></li></ol> 3. Floresan ölçümü <ol><li> Dual dalga boyu ölçümleri için izin veren bir spektrofotometreyi (Xe lambası, 150 W) ile 25.0 ° C &#39;de flüoresan ölçümlerini gerçekleştirir. Alternatif aydınlatma dönemleri (550 Nm / 550 nm uyarma / emisyon dalga boyları ile BR etkinleştirmek için) ve pyranine floresan ölçmek için 2 saniye boyunca 455 nm / 509 nm uyarma / emisyon dalga boylarında floresans ölçümleri. 5 nm uyarma ve emisyon bant genişlikleri ayarlayın. Bir ters zar potansiyeli ΔΨ oluşumunu önlemek için 50 nM valinomycin mevcudiyetinde ölçümleri yapın. Not: Aslında, BR proton pompalar, çünkü dışarıda daha lipozom içinde daha olumlu ücretleri vardır. Bu ücretgradyan bir K + iyonofor seçici olan, valinomycin ile iptal edilebilir. Bir kez lipozomlar, süspansiyon valinomycin ilave bir hidrofobik molekül olarak, lipozom zarı içine yerleştirin pasif olarak K + taşıma ve bu nedenle, membran potansiyeli ΔΨ buharlaşır. </li></ol>

<ol>
	<li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us?+(Review).">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+bacteria.">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li><li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump.">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li><li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism.">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li><li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism.">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li><li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).</li><li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli.">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li><li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps.">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li><li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli.">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li><li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes:+caveats+and+keys.">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li><li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis,+edited+by+iConcept+Press.">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li><li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps.">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Bu membran proteini taşıma test etmek için tasarlanmış bir yeniden oluşturma işlemi tarif eder. Bir kez kurulan, protein sulandırıldıktan prosedürü çok tekrarlanabilir ölçümlere yol açar. Bununla birlikte, protein yeniden yapılandırmak için tam koşullar, bir proteinin diğerine değişecektir. Kadar bakım aşağıdaki parametrelerini optimize alınmalıdır: arıtma (saflık ve toplanan malzemenin yokluğu) i) kalitesi, deterjan eritici aşama (mümkünse ii) verimlilik, düşük cmc deterjan tercih edilmelidir onlar için daha kolay çünkü ) kurtulmak, deterjanın iii) desorpsiyon (bir diyaliz aşaması ile polistiren boncukların kullanımını birleştirmek için ancak bu desorpsiyon oranını, proteinin daha sonraki aktivitesi için kritik bir parametre etkileyebilir Örneğin mümkündür, ref [bakınız 9]), iv) lipid sulandırma (lipid kimyasal doğası, protein oranı, ilave amphiph varlığına lipidiles) çeşitli ve optimize edilmesi gereken kritik parametreler vardır. Ilavesi sıcaklık ve inkübasyon zaman içinde tüm bu sorunları etkiler. Kalite kontrol yeniden oluşturma prosedürü her adımında böylece ilkel olduğu. Bu, hızlı bir geri dönüşlü ve sadece mikromolar arasındaki bir konsantrasyonda örnek 20 ul gerektirdiğinden Bu açıdan bakıldığında, ışık dağılımı çok uygun bir yöntemdir. Nitel (protein gerçekten lipozom zarı içine gömülü) yanı sıra, kantitatif (kaç protein bir lipozom içinde): proteoliposomes oluşturulmaktadır kez sulandırma sistematik doğrulama doğru yol açar, çünkü, sukroz gradyanlı çok yardımcı aynı zamanda. İkincisi tam protein ve lipid konsantrasyonlarının ölçülmesi ile ele alınacaktır. Bizim deney alt-tabakanın kendisinin titre bağlı değildir ve bu olası suni pasif difüzyon ile ilgili rahatsızlık hususlar önler<html> nedeniyle zarlarında hidrofobik bölümleme için molekülü. Tahlil izleme pH değişiklikleri için güvenilir ve kantitatif prob olarak pyranine özelliklerini kullanır. Bizim sonuçlar proton degrade oluşumu 10 valinomycin kullanılarak gerçekleştirildi başka bir prosedür ile elde edilen sonuçlar ile uyum içindedir, ama daha sağlam ve tekrarlanabilir gradyan 11 verir. Buna ek olarak, sadece hassas proton gradyan (daha fazla detay için Verchere et al. 12) tamponun konsantrasyonu değiştirilerek, ayarlanabilir. Bir kontrol ölçümü birinci alt madde yokluğunda gerçekleştirilir prosedürde (bu proteinin aktivitesi pasif erişim sağlar). Alt-tabaka, aynı küvet içinde eklendikten sonra gerçek zar proteini taşıyıcı aktivitesi ölçülür. Deney gerçek olmayan, belirsiz, yüzey kaynaklı bir sonuç olarak kabul edilebilir, çünkü bu gerçekten bir varlıktır. örnek aydınlatıcı reaksiyon. Otomasyon ve paralelizasyon proteoliposome büyük bir parti hazırlarken oluşacak tetikler çünkü ent &quot;&gt; protokol, yüksek-orta verim (örneğin 96-kuyu ölçümleri) automatization adapte olabilir, ve bir 96 yılında hacimde dağıtma -kuyu plaka. Substratlar (ve aynı zamanda muhtemel inhibitörler) ilave edilir ve 45 dakika süreyle karanlıkta inkübe edildikten sonra plaka, bir mikroplaka okuyucusu üzerinde aydınlatma / pyranine floresan ölçüm döngüsüne tabi olacaktır. Protokolü hakkında ek bilgi için, okuyucular Verchere ark okumaya davet ediyoruz. 12,13

Yekpare zar proteinleri, ökaryotik genomlarında kodlanan genlerin kadar% 30 temsil eder. Bunlar kapı tutma (reseptörler), besin, iyonlar ya da zararlı bileşikler (taşıyıcılar) taşıma veya tüm canlı hücreleri 1 arasında membran bilayers (kanal) karşısında geçirgenliği korumak gibi çok önemli rolleri paylaşın. Akış antibiyotik tedavisinin 2 karşı direnç ve merkezi bir role sahip pompalar. Gram-negatif bakteriler ise bir dış zar ile korunmaktadır Pseudomonas aeruginosa, akış taşıyıcıları MexB, iç zar bulunan akış pompa, Mexa, periplazmik protein ve öprm ile birlikte çalışır üçlü sistemler, bir olarak düzenlenir dış zar kanalı. Sitoplazmik iç zar proteini geniş substrat spesifikliği olan bir enerji-bağımlı bir pompa görevi görür. Üçüncü bir periplazmik boşlukta bulunan ve bütün kompleksi stabilize düşünülmektedir ise dış zar protein porini gibi davranır <skadar&gt; 3. Aşağıda, Mexa MexB montajı için bir işlevsel tahlili tasarımına odaklanır. Yapısal bilgi Escherichia coli 4-7 homolog protein AcrB X-ışını tayin son 5 yıldır sayesinde üzerinde birikmiş. Açıkça bu taşıyıcı için işlevsel bir test tasarımı, dinamik ve kinetik verileri ile çift bu tür bilgilerin, önemli olmasına rağmen gerçek bir meydan okuma 8&#39;dir. Gerçekte, bu zar proteinleri, bir zar ortamda muhafaza edilmesi ve kapalı bir bölme elde edilecek alt-tabakanın bir vektörel taşınması için muhafaza edilmelidir. Proteoliposomes içine membran proteinlerinin Sulandırılması yoğun (Rigaud ve Levy 9) sunulan ve gözden geçirilmiştir. Bu protokoller lipozom zarı boyunca tabakaları izleyerek, örneğin zar proteinleri aktivitesinin izlenmesi için izin verir. Bu durumda sınırlamalar a kaynaklanantitrasyon substratların vailability (floresan radyoaktif, vb.) ve çoğu zaman alt-tabakalar, bu hidrofobik olan ve ne olursa olsun taşıyıcı varlığı zarlarını geçme eğilimi gerçeğinden. Bir alternatif olarak, bir ulaşım bir sonucu olarak meydana gelen kimyasal değişikliklere duyarlı bir raporlama boya spektroskopik varyasyonları takip edebilirsiniz. Yukarıda belirtildiği gibi, protonlar MexB ile taşıma enerji. Bu nedenle, uygun bir seçenek proton güdümlü alt-tabaka taşıma nedeniyle pH değişimleri izlemek için bir pH-duyarlı bir raporlama boyanın spektroskopik varyasyonları izlemektir. Bir flüoresan boyanın seçimi alt-tabakanın hidrofobik doğası nedeniyle herhangi bir suni önler. Ek bir zorluk, bir proton degrade kuşaktır. Birçok protokol literatürde bulunabilir. Bunlar arasında, valinomycin tekniğinin kullanımı yaygın ama biz 10-11 gerçekleştirmek için sıkıcı olduğunu göstermiştir. Üstelik olduğutekrarlanabilir değil ve geri dönüşümlü değildir. Biz, bakteriyorodopsin (BR), Halobacter salinarium bir ışık ile aktive olan proton pompası, halofilik deniz Gram-negatif aerobik zorunlu arke kullanımına başvurmuştur. Bu protein aydınlatma üzerine, BR lipozomların içine proton pompaları ve bu nedenle, alt tabakanın 12-13 taşımak için ihtiyaç duyulan proteini ile (iç asidik) ΔpH oluşturur MexB ile lipozomlara coreconstituted ve kapanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">850375C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">B2261</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">93427</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Valinomycin</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">V-1644</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">H-348</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DDM (n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside)</td>
			<td style="width:344px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:344px;">D310LA</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">610000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Biobeads SM-2 Adsorbents</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Econo-Pac Chromatography empty column</td>
			<td style="width:344px;">Biorad</td>
			<td style="width:344px;">732-1010</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Desalting columns</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">54805</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Dynamic light scattering instrument</td>
			<td style="width:344px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:344px;">DynaPro NanoStar</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Fluorometer JASCO FP-6200</td>
			<td style="width:344px;">JASCO</td>
			<td style="width:344px;">6816-J002A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro investigation of the mexab efflux pump from pseudomonas aeruginosa

Membran protein taşınmasını izlemek için güvenilir araçlar için gelişmekte olan bir bilimsel ihtiyaç vardır. Bu taşıma onların aktivitenin kesin bir inceleme sağlayan bir biyo-taklit ortamında Gram-negatif bakteriler Pseudomonas aeruginosa&#39;dan akış pompaların yeniden oluşturulması için gelen bir yöntem sunuyoruz. Üç önkoşulları yerine getirilmesi: bir lipidik çevre, ulaşım için uygun bir dizin kullanımı, ve bir proton degrade nesil bölmeleştirme. Membran protein taşıyıcı birlikte bakteriyorodopsin, sağlam hem de ters çevrilebilir ve ayarlanabilir bir proton derecesi üreten bir ışık ile aktive olan proton pompası ile lipozomlara sulandırılır. Proteinin etkinliği pyranin, pH değerine bağımlı bir floresan sonda kullanarak, lipozom içinde meydana gelen pH varyasyonlarından çıkarılır. Bir adım adım prosedür zar proteini saflaştırılması, lipozom formasyonu, protein yeniden oluşturulması, ve bir taşıma tanımlamaknalysis ele alınmaktadır. Onlar özellikle, bir taşıyıcı RND için tasarlanmış olmakla birlikte, tarif edilen yöntemler, potansiyel olarak proton gradyanı ile enerji başka bir membran protein taşıyıcı ile kullanım için adapte edilebilir.

Bu analiz, bir proton gradyan oluşturulur sırasında zamanın bir fonksiyonu olarak floresans izleme pyranine oluşur. Bu amaç için, numuneler (tetiklenir BR tarafından nedenle proton pompalama) aydınlatma alternatif tabi tutulur ve daha sonra uyarma ve emisyon dalga boyları kullanılarak pyranine ölçümü floresan (ex λ = 455 nm ve 509 nm λ em =). Şekil 1, bu BR tarafından üretilen proton gradyan geri doğrulayarak, Mexa / MexB yokluğunda, yöntemle elde edilen bir temsili kontrol göstermektedir. Asidifikasyon bir devir sonra proteoliposomes protonlar (proton konsantrasyon gradyanı aşağıdaki lipid çift tabakaları üzerinde yavaşça ve pasif olarak yaygın) pompalama durdurmak için BR için sırayla 45 dakika boyunca karanlıkta tutulur. Bu geri kazanım süresinden sonra, BR aktivasyonu sadece yine aynı süspansiyon aydınlatarak, mümkündür. Şekil 2,gerçek bir nakil ölçüme karşılık gelir. Protein içermeyen lipozomlar ile bir negatif kontrol, beklendiği gibi, pH (Şekil 2A ve 2B, portakal halkaları) aydınlatma üzerine sabit olduğunu göstermektedir. Ancak, membranlarda br içeren proteoliposomes, bu nedenle lipozom içinde azalır ve dengeli bir pH gradyanı inşa edilmiştir (Şekil 2A ve 2B, mor kareler) bir proton pompa yok. Gri üçgenler ve kırmızı elmas (Şekil 2A), sırasıyla, varlığında, Hoechst 33342 veya yokluğunda, BR ve MexB içeren proteoliposomes içinde pH değerini temsil eder. Biz proton degrade sadece kısmen MexB karşı-ulaşım tarafından harcanmış bir tabaka bağımsız aktivitesini gözlemlemek. Biz MexB bir bazal etkinlik için bu gözlem bağlıyor. MexB aktivitesine Mexa etkisini test etmek için, Mexa (ilk olarak bir alt-tabakanın yokluğunda, sulandırma ilave edildi <stRong&gt; Şekil 2B, mavi elmas). Yine, BR tarafından oluşturulan proton gradyanı sadece kısmen yayılır. Gerçek transport ölçümü aynı numune üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bundan önce, proton gradyan yeniden gerekir ve alt tabaka, protein içinde bağlama sitesi ulaşmak amacıyla süspansiyon içindeki eklenmelidir. Bu amaç için, süspansiyon 45 dakika için alt-tabakanın mevcudiyetinde karanlıkta inkübe edilir. Daha sonra aydınlatma üzerine, bir pompa ile alt-tabaka bir ulaşım sonucu olarak, BR tarafından oluşturulan proton gradyanı hemen tamamen MexAB (Şekil 2B, yeşil üçgen) tarafından yayılan olduğunu görebilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . BR aydınlatma tarafından inşa proton degrade Şekil 1 Tersinirlik: Pyranine flzamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür BR proteoliposomes of uorescence. 0-15 dakika kaynaktan, BR ışık aktivasyonunun bir sonucu olarak protonları pompalar. 15-60 dk, proteoliposomes karanlıkta bekletilir; entravsekiler pH ve vezikül pH eşit olana kadar bu süre boyunca, protonlar pasif lipozomlann dışarı hareket ettirin. 60-75 dak, BR hala işlevsel ve aydınlatma üzerine proton pompalar. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> .. Şekil 2, nakliye deneyi: pyranine floresan, zamanın bir fonksiyonu kontrol lipozomlar (turuncu daireler) içindeki A) pH gibi, karşılık gelen pH değişimlerine dönüştürülür, zarda BR (mor kareler) ihtiva eden proteoliposomes içinde pH, pH içinde Hoechst 33342 (kırmızı d olmadan zardaki Br ve MexB içeren proteoliposomes bölgesinin. iamonds), Hoechst 33342 (gri üçgenler) B kontrol lipozomlar (turuncu daireler) içinde) pH ile membran içinde BR ve MexB içeren proteoliposomes içinde pH, zarın (mor kareler) BR ihtiva proteoliposomes içinde pH, pH içinde Hoechst 33342 (mavi karo) olmadan zardaki Br MexB ve Mexa içeren proteoliposomes arasında, Hoechst 33342 (yeşil üçgenler) ile membran içinde BR, MexB ve Mexa içeren proteoliposomes içinde pH.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Biz, Pseudomonas aeruginosa&#39;dan akış pompaları in vitro incelenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, lipozom zarı içinde sağlam, tersinir ve ayarlanabilir proton gradyanının oluşturulması için izin verir ve bu nedenle protomotive güç ile enerji herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir olmalıdır.

Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

in-vitro-investigation-mexab-efflux-pump-from-pseudomonas

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

11.8K Görüntüleme.  CNRS & Université Paris Descartes.  Biz, Pseudomonas aeruginosa'dan akış pompaları in vitro incelenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, lipozom zarı içinde sağlam, tersinir ve ayarlanabilir proton gradyanının oluşturulması için izin verir ve bu nedenle protomotive güç ile enerji herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir olmalıdır. 

Video: In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biyoloji

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

Metabolitlerdeki Soruşturma MALDI-Kütle Spektrometrik Görüntüleme<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Kök Nodüller

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Senkronizasyon<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Bakteriyel Hücre Döngüsü Soruşturma

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Farelerde Kardiyak inotropiyi Soruşturma İzole papiller Kaslar kontraktilite Ölçümleri

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Memeli Hücrelerinde Çinko Taşıma Mekanizmasının FluoZin-3 Testi ile İncelenmesi

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Yazar Spotlight: ZnT1 İşlevselliği ile Hücresel Çinko Düzenlemesini Keşfetmek 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

İn Vitro Çinko Taşıma Testi Kullanılarak Memeli Çinko Taşıyıcılarının Karakterize Edilmesi

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...