Bu çalışma Lupus Araştırma Enstitüsü (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 ve NIH UL1-TR00165 tarafından desteklenmektedir. Biz onun sürekli destek için Dr Robert P. Kimberly teşekkür ederim.

Bu çalışma için alınan tüm donörler yazılı bilgilendirilmiş onam verdi ve çalışma Birmingham Kurumsal Değerlendirme Kurulu Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1.. HUVEC İlk Kültür ve alt kültür <ol><li> Endotel hücre bazal ortamda oluşan tam bir büyüme ortamı içinde in vitro kültür insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC), endotel hücre büyüme faktörleri ile takviye edilmiş (Malzemelerin listesine bakınız). Not: Bu çalışmada kullanılan büyüme faktörleri şunları içerir: 5 ng / ml insan rekombinan epidermal büyüme faktörü (hEGF), 1.0 mg / ml hidrokortizon, 50 mg / ml gentamisin ve 50 ng / ml amfoterisin B (GA-1000), 2 % Fetal Bovine Serum (FBS), 0.5 ng / ml Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF), 10 ng / ml insan Fibroblast Büyüme heparin (hFGF-B) ile faktör-Basic, 20 ng / ml insan rekombinan insülin-benzeri büyüme faktörü ( R3-IGF-1) / ml askorbik asit 1 ug ve 22.5 ug / ml heparin. Tam ortam37 ° C de ilk olarak hazırlanır ve daha sonra hazırlama 1 ay içinde kullanım için 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Hücreler için bir şişe hazırlamak için, tam büyüme ortamı, 75 cm doku kültür şişesi 2 (1 ml / 5 cm2) ve daha sonra şişe, bir nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C /% 5 CO2 dengelenmeye bırakılır ilave edilir en az 30 dak. İnsan HUVEC / cm 2 2,500-5,000 hücre yoğunluğunda bu dengeye kültür şişesi doğrudan ekildi olacaktır. </li><li> Ortam dengeye olsa da, hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde stok HUVEC cryovial eritin. Vorteks orjinal depolama şişede hücreleri dağıtılır ve daha sonra / cm 2 2,500-5,000 bir hücre yoğunluğu elde etmek için ön-dengelenmiş HUVEC tam büyüme ortamını içeren kültür şişesi doğrudan ekleyin. Yavaşça hücreler eşit olarak, dağıtılması ve daha sonra inkübatör şişeyi geri dönmek için şişeyi sallayın. Bu hücreler artık 1 st geçişini temsil eder. </li> &lt;Hücreler% 70-80 konfluent kadar li&gt; ortam her iki günde bir değiştirilmelidir. </li><li> HUVECler artık tripsin / EDTA ile kültür şişelerinde hasat edilebilir. Kültür ortamı, hücrelerden herhangi bir artık protein ve kalsiyum çıkarmak için PBS ile durulanır ve ardından kültür şişelerinden aspire edilir. A% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ilave edilir ve ışık mikroskopisi ile değerlendirilen 2-6 dakika hücresi ayrılmasıdır içinde belirgin olmalıdır. </li><li> Hücrelerin% 90&#39;ı plaka kapalı yuvarlanır olduğunda, 2x tripsin inhibitörü eşit hacmi eklenerek trypsinization durdurun. Hücrelerin hasat kolaylaştırmak için, tam büyüme ortamında bir diğer eşit miktarda ekleyin. Steril bir 15 ml santrifüj tüpüne müstakil hücreleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 225 x g de müstakil hücreleri santrifüjleyin. Süpernatanı havalandırın, ve daha sonra tam büyüme ortamı içinde 2-3 ml hücreleri tekrar süspansiyon. , Bir hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak hücre konsantrasyonuna ve canlılığı belirler. </li><li> Th kullanmak içine çalışma için hücreler, yeniden tohum ek olarak 75 cm / cm 2 10,000 hücre yoğunluğunda hücreler hasat edilmiş ve 2 şişe 2,2 adıma geçin. Alternatif olarak, hücreler gelecek çalışmalar için bu noktada dondurulabilir. Hücre dondurma için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 225 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatan aspire ve 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda,% 10 DMSO içeren FBS hücre pelletini. Hücre süspansiyonu daha sonra bir hücre dondurma kap içindeki hücrelerin dondurma sonra cryovials aktarılır ve -80 ° C&#39;de saklanır. </li></ol> 2.. HUVEC Katman Hazırlık <ol><li> Dondurulmuş 2. pasaj HUVEC&#39;lerin Kullanımı: canlanma ve kültür. Aktif büyüyen hücreleri kullanıyorsanız, 2.2 adıma geçin. <ol><li> Bir 37 ° C su banyosu içinde hızla aşama 1.8 &#39;den 2 nci geçiş HUVECler içeren dondurarak saklama viali çözülme. 15 ml steril santrifüj tüpüne dondurarak saklamaya uygun vialler hücreleri aktarın ve 10 mi büyüme medi eklemekum. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri santrifüj ve kalıntı DMSO&#39;yu çıkarmak için süpernatan aspire. </li><li> Tam büyüme ortamı ile hücre pelletini ve bir 75 cm 2 şişeye hücreleri aktarın. Toplam hacim, yaklaşık 20-25 ml büyüme ortamı ilave edin ve 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edilir. </li></ol></li><li> Görsel olarak ortam değişiklikleri her iki günde bir ile her gün birleştiği için hücre kültürü inceleyin. Genellikle 2-4 gün içinde, hücreler akış odası deneyinde kullanıma hazır olacak hangi zaman% 80-90 ulaşacak. </li><li> Akış odasının kullanılacak bir kültür tabağı hazırlamak için (bkz. Bölüm 5) için 10 ug / ml fibronektinin 1 ml ve% 0.05 bir 35 mm doku kültürü çanağı ve pipet (w / v) jelatin birkaç kez eklemek Emin bütün plaka yüzeyi kaplanır. Matris protein oluşumunu optimize etmek için en az 30 dakika boyunca plaka kuru aşırı fibronektin ve jelatin çözeltisi ve hava çıkarın. Fibronectin ve jelatin çözüm 10x&#39;e kadar tekrar edilebilir. </li><li> 1,5-1,7 adımları tarif edildiği gibi tripsin-EDTA kullanılarak aşama 2.2 &#39;den HUVEC hücreleri hasat. Her bir kaplanmış doku kültür kabına 500,000 hücreleri tohum. Her bir tabağın içinde 2 ml büyüme ortamı ilave edin ve 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edilir. </li><li> Hücreler adım 2.2 olarak çoğalmak üzere büyümeye olanak sağlar. Hücreler görsel ortam değişiklikleri her iki günde bir günlük muayene edilmelidir. Önceki akış odası deneyine, yapışma molekülü ekspresyonunu ve teşvik etmek için 4-6 saat boyunca 20 ng / ml insan TNF-α ile HUVEC ana. </li></ol> 3.. Saf Ligand Kaplama <ol><li> Bir 35 mm doku kültürü çanağı merkezinde bir işaretleyici ya da kalem ile 0.5 cm çapında bir daire çizin. </li><li> Işaretli alandaki 20 ug / ml protein A Levha 20 ul. Protein 0.5 cm çaplı bir daire içinde tüm alanı kapsayacak şekilde bir çözeltisi yaymak için pipet kullanın. Bu d yüzeyine dokunmayın veya çizmeyin önemlidirish. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 1 ml PBS (pH 8.0) ile protein-kaplanmış bir tabak 3 kez yıkayın. </li><li> Spesifik olmayan plaka üzerine bağlanmasını bloke etme işaretli alanda plaka 50 ul% 1 BSA. 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe </li><li> Adım 3.3 &#39;de olduğu gibi 1 ml PBS ile bloke plaka 3 kez yıkayın. </li><li> Kaplama için Fc-reseptör ligand yapışma kimerik protein solüsyonları hazırlayın. Bu deneyde, 25 ug / ml &#39;de bir ICAM-1/Fc kimera çözeltisi ve PBS içinde 0.5 ug / ml&#39; de bir P-Selectin/Fc kimera (pH 8.0) kullanıldı. </li><li> Coat alt-tabakanın 50 ul ile işaretli alanı. 4 ° C de bir gece inkübe Çanak iki gün içinde kullanılmalıdır ve kaplanmış alan kurumasına izin verilmemelidir. Plaka üzerinde 50 ul çözelti sağlamak için gerekirse PBS ilave edin. </li></ol> 4. Nötrofil Ayırma (Oda Sıcaklığında Yapılan tüm adımlar) <ol><li> Bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, bir içine flebotomiden tarafından katılımcı kan toplamakn antikoagülan kan toplama tüpü veya vacutainer (EDTA veya heparin). Kan toplandıktan sonra, ayrılmasından önce PBS ile kan 01:01 sulandırmak. </li><li> 50 ml santrifüj tüplerine PBMC ve nötrofilleri ayrılması için iki tabakalı bir Ficoll hazırlayın. Ilk olarak 15 mL ağır Ficoll (Malzeme Listesi, ρ = 1,118-1,120 bakınız) ekleyin ve sonra dikkatlice 10 ml ağır Ficoll&#39;ün üstüne (Malzeme Listesi, ρ = 1,077-1,080 bakınız) Ficoll ışık katmanı. Hafif Ficoll&#39;ün ve ağır Ficoll katmanları arasında keskin bir sınır olmalıdır. Son olarak, dikkatli bir Ficoll tabaka bozmadan ışık Ficoll üstüne seyreltilmiş kan örneğinin 25 ml katman. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüje tüpü. Not: Bu spin santrifüj sonunda rotor yavaşlama sırasında hücre ayırma potansiyel bozulmasını en aza indirmek için santrifüj rotor freni kapalı olmalıdır. Santrifüjlemeden sonra, (yukarıdan aşağıya) aşağıdaki tabakaları mevcuttur: üst tabaka plazma Follo olduğuışık Ficoll tabakanın üzerine PBMC tabakası ile evli, az kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ile nötrofil tabaka tüpün altındaki ağır Ficoll katmanı ve eritrositlerde ardından hafif ve ağır Ficoll arasındadır. </li><li> Hasat ve bir transfer pipeti ile yeni bir 50 ml tüp içine nötrofil tabaka transferi, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 225 x g hızında 50 ml ve santrifüj bir son hacme PBS ekleyin. <ol><li> Santrifüj işleminden sonra hala nötrofiller ile karıştırıldı eritrosit olabilir. Aşağı 10 ml işaretine süpernatant aspire. Tüp (veya kısa bir düşük hız vorteks) yumuşak çalkalama ile, nötrofil-RBC pelletini ve daha sonra PBS, 50 ml ile tekrar yıkanır. </li></ol></li><li> İkinci yıkamadan sonra, süpernatan aspire. , Kirletici eritrositlerde kaldırma çalkalama (veya kısa vorteks) ile artık PBS içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri için, 25 ml H2O ve RBC lize etmek için 10 saniye boyunca nazikçe girdap ekleyin. <ol><li> % 1.8 NaCl, 25 ml eklenir ve karışım hemenOda sıcaklığında 10 dakika boyunca 225 x g&#39;de santrifüj ile. Kirletici RBC artık, beyaz bir nötrofil hücre pelletini terk lize olmalıdır. </li></ol></li><li> PBS ile nötrofil hücre pelletini yıkayın. </li><li> % 10 FBS ile RPMI ortamı içinde yeniden süspanse edin ve izole edilmiş nötrofiller bir hemasitometre ile ışık mikroskobu altında hücre konsantrasyonunu belirler. </li><li> Tam RPMI-% 10 FBS ortamı ile 500,000 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlayın. </li></ol> 5. Akış Odası Yapışma Deneyi <ol><li> Akış odasının birleştirin. Mikroskop masaya birleşik HUVECler ya da saflaştırılmış yapışma reseptörü ligandları ihtiva eden 35 mm tabak yerleştirin. Şırınga pompası, vakum sistemi ile paralel plaka akış odasına bağlayın ve nötrofil girişi için açık bir satır bırakın. Plakanın üst akış odası takın ve akış odası düzeneğini 13 sabitleyin. (Bkz. Şekil 1) </li><li> Bilgisayar bağlı t video kayıt programını başlatınmikroskop o. Tam olarak büyümüş HUVEC hücreleri ile açık alan veya ligand kaplama bölge görünür içinde bir alana dek mikroskop alanını ve odağı ayarlayın. </li><li> Şırınga pompası kullanılarak, RPMI ortam maddesi ile akış odası yıkayın. Odasının içindeki hava kabarcıkları veya nötrofil giriş hattı olmadığından emin olun. </li><li> Eğer arzu edilirse, nötrofiller, 10 dakika boyunca, düşük dozda (10 -8 M) fMLP ile hazırlanmış olabilir. Bu, farklı vericilerden 14 arasında nötrofil aktivasyonunun bazal seviyesi bir eşleşme için izin verir. </li><li> Belirlenen hızlarda akış odasına (Bu çalışmada kullanılan / cm 2 1,5 dynes bir kesme stresi eşittir 350 | il / dk &#39;lık bir hız) nötrofiller enjekte etmek için şırınga pompası kullanın. Video kaydedin. Nötrofil yapışma hızla meydana gelebileceğinden, 4-5 dakikalık bir uzunluğu olan bir görüntü analiz için yapışma olayları miktarını belirlemek için yeterlidir. </li><li> Bir yapışkan hücre az bir hücre çapı hareket eden bir hücre olarak tanımlanmaktadırHUVEC veya ligand kaplı yüzey 15,16 on 5 saniye içinde. Bu kural kullanılarak kaydedilen video alanında mevcut olan yapışkan hücrelerin toplam sayısı. Farklı bağış nötrofil ile benzer uzunlukta video kaydı tarafından, biri farklı bağışçılar arasındaki yapışma özelliklerini karşılaştırmak için yapışık hücre / dk hesaplayabilirsiniz. </li></ol>

<ol>
	<li>Harley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+in+women+with+systemic+lupus+erythematosus+identifies+susceptibility+variants.">Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants.</a> in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+ICAM1-ICAM4-ICAM5+Locus+Is+Associated+with+Systemic+Lupus+Erythematosus+Susceptibility+in+Multiple+Ancestry+Populations.">Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations.</a> Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+leukocyte+recruitment+in+the+inflammatory+process.">Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process.</a> Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).</li><li>Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neutrophil-endothelial+cell+adhesion+in+inflammatory+disorders.">Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders.</a> J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).</li><li>Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+inflammatory+injury.">Adhesion molecules and inflammatory injury.</a> FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).</li><li>Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+of+LFA-1+and+Mac-1+with+intercellular+adhesion+molecule-1+in+facilitating+adherence+and+transendothelial+migration+of+human+neutrophils+in+vitro.">Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro.</a> J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).</li><li>Marlin, S. D., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+intercellular+adhesion+molecule-1+(ICAM-1)+is+a+ligand+for+lymphocyte+function-associated+antigen.">Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen.</a> Cell. 51 (5), 813-819 (1987).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+Distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65 (5), 859-873 (1991).</li><li>Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+steps+involved+in+the+transition+to+stationary+adhesion+of+rolling+neutrophils:+A+brief+review.">Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review.</a> Microcirculation. 7, 385-394 (2000).</li><li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber.">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).</li><li>van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+a+parallel-plate+flow+chamber+for+studying+cellular+adhesion+to+solid+surfaces.">Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).</li><li>Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+flow+in+the+parallel+plate+flow+chamber:+Implications+for+cell+capture+studies.">Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies.</a> Biophys. J. 67, 889-895 (1994).</li><li>Kucik, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Adhesion+Under+Flow+Conditions.">Measurement of Adhesion Under Flow Conditions.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Lupus+Associated+ITGAM+Variants+Alter+Mac-1+Function+on+Neutrophils.">Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils.</a> Arthritis. Rheum. , (2013).</li><li>Bacabac, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shear+stress+in+parallel-plate+flow+chambers.">Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers.</a> J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).</li><li>Kucik, D. F., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., C, A., Zychlinsky, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. 36 (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J Vis Exp. (17), 745 (2008).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variations+in+absolute+wall+shear+stress+levels+within+one+species+and+between+species.">Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species.</a> Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).</li><li>Nagaoka, T., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+evaluation+of+wall+shear+stress+on+retinal+microcirculation+in+humans.">Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, saf, gerilimli şartlar altında, nötrofil yapışmasının ölçümü için dikkatli bir minimal aktifleştirilmiş nötrofillerin ayrılmasını ve izole yönlendirir. Nötrofil yapışma inflamasyonda önemli bir işlemdir. Bu işlemde çok sayıda molekülün genetik varyantları, otoimmün hastalık 1,2 gelişmesi için temel oluşturabilir için gösterilmiştir için, nicel olarak insan nötrofil sağlam yapışmasını değerlendirmek yeteneğine sahip bir test sistemi gereklidir. Bu protokolde tarif edildiği gibi bir yöntem şeffaf stres altında kontrollü bir ortamda in vitro nötrofil firma yapışkan potansiyelinin dikkatli ve kantitatif belirlenmesi için olanak sağlar. Bu nedenle bu yöntem genotyped bireyler arasındaki nicel nötrofil yapışma direkt karşılaştırılması yapışma molekülleri 14 genetik varyasyonun önemini belirlemek için izin verir. Bu yöntemde çeşitli adımlar achiev önemsenmesi hake yüksek kantitatif ve tekrarlanabilir sonuçlar. HUVEC hazırlanmasında, akış odası içinde kullanmadan önce% 100 hücre izdiham elde etmek için kritiktir. Saflaştırılmış ligand ile kaplanmış yüzeyler kullanmak için, alt tabaka kaplama alanı ligandı denatüre önlemek için kurumasına asla izin verilmemeli. Buna ek olarak, insan nötrofilleri hazırlanması Deneyin başarısı için çok önemlidir. Kan nötrofilleri de izole önemli hususlar yavaşça izole edilmesini ve deney, aktivasyonunu önlemek için en aza indirmek vorteks (kan, oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir buz ve santrifüj adımları saklanmamalıdır örneğin), oda sıcaklığında hücreleri tutmak ve tamamlayarak işleme dahil mümkün olduğu zaman en az miktarda. Ayrıca, bu tahliller 17,18 için hücrelerin hazırlanması için kullanılabilen ek nötrofil izolasyon yöntemleri vardır. Taze izole edilmiş insan nötrofil kullanarak pratik bir bakış açısı, yapışma tahlilleri kaynaktan<html> katılımcı phlebotomy sonra 3-6 saat içinde yapılması gerekir. Nötrofiller kullanım için son derece hassas olduğu, kan çizmek ve kullanımı arasında uzun süreli kez tahlil sonuçlarını etkileyebilir. Önce, akış odası tahlile nötrofil hücre konsantrasyonunun belirlenmesi dikkatli doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Akış odası Deney sırasında, bu akım hızı tutarlıdır ve deney uzunluğu boyunca herhangi bir türbülans olduğundan emin olmak için dikkatle video kayıt izlemek için önemlidir. Akış hızları değişimler veya türbülans varlığı deney tekrar edilmesi gerekli olacaktır. Deneyden sonra, o nötrofil topaklanma emin olmak için mikroskobik olarak kalan nötrofiller değerlendirmek için de önemlidir. Bu noktada, topaklanma nötrofiller önemli ölçüde deney sırasında nötrofil yoğunluğu değiştirebilir ki aktif hale gelmiş olduğunu işaret eder. içeriği &quot;&gt; akım odası, bir Q = akış oranı odası içinde homojen yakın dik stres (τ = 6Qμ / (WH 2), μ = dinamik viskozite ve akış odasının W = genişlik &#39;, h = yükseklik yaratır ) haznesi 15 akar. Çalışmalarımızda olarak, / cm 2 1,5 dynes dik bir stres yaratır nötrofil yapışması için 350 ul / dk &#39;lık bir akış hızı, kullanılan (w = 0.25 cm, h = 0.01 inç su, viskozite 37 ° C&#39;de (0.007 poise)) Kan numuneleri ortamın viskozitesinin bir yaklaşım olarak kullanılmıştır. özel bir akış odası için, bir başka fizyolojik koşulları taklit etmek için saf stres seviyelerinin elde edilmesi için farklı akış hızını değiştirebilir. tipik fizyolojik kesme stresi İnsan kan damarlarında 0.5-5.0 din / cm 13,16 arasında değişmektedir. diğer kan damarlarında stres Kayma ve diğer hayvanlar Tablo 1 113,16,19 20&#39;de listelenmiştir. Bizim yöntem, insan neutrophi yapışmasının çalışmaya odaklanmış olsa dals, bu yöntem, nötrofiller ile sınırlı değildir ve kolay bir şekilde yapışması ya da basit değişikliklerle, başka hücre tipleri haddeleme çalışmalarında uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntemde, alt-tabakalar, farklı amaçlar için değiştirilebilir. Bu protokol, farklı çalışmalarda kolayca adapte olmasına rağmen, bazı sınırlamalar vardır. Burada uygulandığı gibi protokol analizi için, birincil hücre sayıda gerektirir. Bu küçük hayvanlardan birincil hücre analizi engelleyebilir. Buna ek olarak, uygun bir / etken konformasyonda saflaştırılmış yapışma ligandlar hareketsiz hale getirmek için ihtiyaç ligandların aralığı sınırlayabilir. Fc-füzyon proteinlerinin kullanımı büyük ölçüde plaka yüzeyi üzerinde uygun bir ligand konformasyon elde etme şansını arttırır. Bununla birlikte, bizim yöntem yapışma olayların kantitatif analiz izin önemli esnekliğe sahiptir. Bu çalışmalar büyük ölçüde yapışma reseptör-ligand çiftleri anlayış ve genetik varyantlar potansiyel fonksiyonu önemini artıracakBu protein, insan hastalıklarının patojenezinde.

Her iki β 2 integrins ve ICAM ligandlardaki genetik varyantlar şimdi otoimmün hastalık 1,2 gelişimi ile ilişkili olduğu kabul edilmektedir. Bu varyantların olan bireylerden türetilen hücrelerde, bu varyantların işlevsel sonuçları belirlenmesi, bu varyantlar, otoimmün hastalık patojenezine katkıda kadar daha iyi anlaşılması için gereklidir. Bu gibi fonksiyonel çalışmalar, doğal olarak oluşan genetik varyantları sağlık ve hastalık hem de bağışıklık tepkisini şekillendiren hangi mekanizmaların belirlenmesine izin verir. SLE Spesifik bir örnek olarak, şimdi bu ITGAM (CD11b) varyantları bilmek ve ligand, ICAM-1, 1,2 güçlü bir hastalığın gelişimi ile ilişkilendirir. Nötrofiller inflamatuvar yanıtları kritik olduğundan, nötrofil yapışma kantitatif çalışma ITGAM / ICAM genetik varyantlar iltihabı nasıl değiştirdiğini içine mekanistik anlayışlar sağlayabilir. Neutrophücreleri (EC) endotelial sıkı bir yapışmaya hIL oldukça düzenli bir süreçtir ve enflamatuar yanıtları 3,4 in önemli bir rol oynar. Nötrofil sağlam yapışma EC ilk nötrofil haddeleme ve ele geçirmesi ve sonuçta in vivo göçüne neden olabilir. Bu işlemler, ICAM-1 de dahil olmak üzere yapışma moleküllerinin çok farklı, ICAM-2, P-selektin, E-selektin, endotel hücrelerinde ve nötrofil 5-9 2 integrinler β içerir. Bu nedenle, yapışma moleküllerinin farklı alelik varyantları olan donörlerden nötrofil yapışmasının dikkatli bir miktar, bu genetik varyantları fonksiyonel ve patolojik sonuçlara yol anlaşılması için önemli olacaktır. Bir akış odasının Deneysel in vivo kullanımı 10-12 kan damarı ortamda gözlenene benzer akışkan kesme stresi ile in vitro bir ortam oluşturabilir. Gerçekten de, bir akım odası deney insan umbili ile birleştiğindecal damarı endotel hücre (HUVEC) bir kan damarının in vivo ortamı taklit edebilir. Bu yöntemi kullanarak, bir endotel hücreye doğru genel hücresel yapıştırıcı özelliklerini incelemek olabilir. Buna ek olarak, akış odacığının son derece kontrollü bir ortam da hücrenin değerlendirilmesi örneğin ICAM-1 spesifik reseptör-ligand etkileşiminin çalışma kolaylaştıracak şekilde saflaştırılmış yapışma ligandlarına bağlanmasını sağlar. Burada HUVEC ve saflaştırılmış ligand alt-tabakalar için, insan periferik kan nötrofillerinin yapışkan özelliklerini incelemek için bir akış odası yapışma deneyi sistemi kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı yapışma molekülü alelik varyantlarını eksprese eden vericiden hücreler ile bu yöntemi kullanarak, bize bu genetik varyant insan nötrofil sıkı bir yapışmaya değiştirebilir nasıl tayin edilmesine olanak sağlamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

Endotel hücrelerine nötrofil sağlam yapışma sağlık ve hastalık hem enflamasyonda önemli bir rol oynar. Nötrofil sağlam yapışma süreci β 2 integrin ailesinin üyeleri ve ICAM ailesinin kontra reseptörleri de dahil olmak üzere birçok farklı yapışma moleküllerini içerir. Son zamanlarda, hem de doğal olarak oluşan genetik varyantları 2 integrinler β ICAMlann ve oto-bağışıklık hastalığı ile ilişkili olduğu bildirilmektedir. Bu nedenle, bu yapışma moleküllerinin değişik alelik formları ile bireylerden alınan nötrofil kantitatif yapışkan otoimmün kapasite gelişimi altında yatan mekanizmaları ile ilgili olarak çalışma için önemlidir. Akış bölme sistemlerinde Yapışma çalışmalar in vivo olarak kan damarı ortamda gözlenene benzer akışkan kesme stresi ile bir ortam oluşturabilir. Burada, insan periferal kan nötrofil kantitatif yapışkan özelliklerini incelemek için bir akış odası deney sistemi kullanılarak bir yöntem mevcuts insan göbek damarı endotel hücre (HUVEC) ve saflaştırılmış ligand substratlara. Bu yöntem ile, yapışma reseptörlerinin farklı alelik varyantları ile vericilerden, nötrofil yapışkan kapasitelerinin değerlendirilmesi ve karşılaştırılabilir. Bu yöntem, aynı zamanda birincil hücre tipleri veya hücre hatları yapışmasını değerlendirmek için modifiye edilebilir.

Nötrofil örnekleri arasında saflaştırılmış bir ligand (ICAM-1/P-Selectin) kaplanmış akım odası (Şekil 2) ya da bir HUVEC kaplanmış akım odası analizi (Şekil 3) bağlanabilen nötrofil bağlanmasını gösterilmiştir. Şekillerde gösterildiği gibi, nötrofiller sürekli akış koşulları altında kaplanmış yüzey veya HUVEC uyması / birikmeye devam etmektedir. Bizim tipik deney koşulları altında, sıkıca dört dakikalık bir kayıt dönemi sırasında, kaplanmış yüzey veya HUVEC yapışan 50-70 insan nötrofil gözlemleyebiliriz. Bununla birlikte, nötrofil yapışma molekülleri ya da alt-tabaka (saflaştırılmıştır ligand veya HUVEC) allelik varyantları alelik varyantlar, esas olarak nicel nötrofil yapışmasını 14 değiştirebilir. Biz de bizim çalışmalarda gözlenen nötrofil yapışma olayların zaman bağımlılığını değerlendirdik. Biz sabit akış koşulları muhafaza ederken, bu hücrelerin yapışkan özellikleri zamanla değişebilir mümkündür. However, bizim çalışmalarda nispeten kısa zamanlı kurslar içinde, biz zamanla yapışma oranı herhangi tutarlı farklılıkları gözlemek değil. Örneğin, 3-4 dakikalık bir zaman noktaları arasında gözlemlenen yapışma göre 1-2 dakika zaman noktalarında yapışmasını değerlendirmek sürekli olarak farklı değildir. Hücrelerin yapışma deney sırasında uyarılır ediliyor Tabii ki, o zamanla yapışkan özelliklerinde değişiklikler beklenebilir. Çalışmalarımızda olarak, kasıtlı olarak çalışma öncesinde, 10 dakika boyunca düşük doz fMLP (10 8 M) ile hücrelerin priming ile izolasyon neden olduğu nötrofil aktivasyonu için kontrol edilir. Endotel hücreleri (Çalışmalarımızda HUVEC), aynı zamanda en iyi şekilde yapışması için sağlam bir lökosit yapışma molekülü ekspresyonunu öncesinde aktivasyon gerektirir. Ön-muamele yokluğunda, endotel hücreleri (HUVECler) çok az, nötrofil yapışmasını destekleyecektir. Çalışmalarımızda olarak, 10 ng / ml, kullanımdan önce 4-6 saat boyunca TNFa tedavisinde kullanılır. IL-1β (10 ng / ml) ve<html> LPS (0.5-1 ug / ml), aynı zamanda endotel hücrelerinin ön-aktive etmek için kullanılabilir. Önemli bir şekilde, muamele edilmemiş HUVEC hücre yapışma spesifik (alıcı aracılı) nötrofil-endotel hücre etkileşimleri neden olduğundan emin olmak için negatif bir kontrol olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, anti-reseptör antikorlar yapışma özelliğinin değerlendirilmesi özgü reseptörleri bloke etmek için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Mikroskop sahnede Şekil 1.. Akış odası yapılandırma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; 0 zaman noktası, B: 1 dakika zaman noktası, C: 2 dk zaman noktası, ve D. Farklı zaman noktalarında (A kaplanacak yüzey ICAM-1/P-Selectin yapışan nötrofillerin örnek bir videodan Şekil 2 ekran görüntüleri: 4 dk zaman noktası). ICAM-1 konsantrasyonu 25 ug / ml &#39;dir ve P-Selektin 0.5 ug / ml&#39; dir. Nötrofil akış hızı 500,000 hücre / ml &#39;de nötrofil yoğunluğa sahip 350 ml / dk&#39; dır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> . Farklı zaman noktalarında (: 0 zaman noktası, B: 1 dakika zaman noktası, C: 2 dk zaman noktası, ve D: 4 dk zaman noktası A) HUVEC kaplanmış yüzeyine yapışan nötrofillerin örnek bir videodan Şekil 3 ekran görüntüleri.Nötrofil akış hızı 500,000 hücre / ml &#39;de nötrofil yoğunluğa sahip 350 ml ul / olup. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Tür </td><td > Yer </td><td > Kesme gerilmesi (din / cm 2) </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Brankiyal arter </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Femoral arter </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Böbreküstü aorta </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Supraceliac aorta </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Yüzeysel fermoral arter </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Venüller </td><td> 0.5-5.0 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Retina ilk arteriyoller </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Retina ikinci arteriyoller </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Retina ilk venüller </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Retina ikinci venüller </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> Köpek </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> Tavşan </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> Sıçan </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 46.6 </td></tr><tr ><td> Fare </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> Köpek </td><td> Femoral arter </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> Tavşan </td><td> Femoral arter </td><td> 156.8 </td></tr><tr ><td> Sıçan </td><td> Femoral arter </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> Farklı organ ve farklı türler Tablo 1.. Numune kesme gerilmesi. * Referanslar 13, 16, 19, ve 20 özetlenmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay at JoVE.com

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham.  Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması. 

Video: Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...