著者らは、ウルフ・ディーター・スターツ博士、アルノー・レミー博士、アントン・ポッシュ博士、パトリシア・ピアッティ博士、トム・デイヴィス、クリス・シモニー、ジェフ・ダーバンがこの原稿の批判的なレビューと編集に感謝しています。著者らはまた、アリソン・シュワルツの技術サポートに感謝しています。

1. タンパク質サンプルの準備
(細胞培養からタンパク質を抽出する一般的な手順について説明します)
<ol><li>氷の中にHeLa細胞培養皿を置き、氷冷トリス緩衝生理食酒(TBS;20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl)で細胞を洗います。</li>
	<li>TBSを吸引し、100mm皿の氷冷RIPAバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS)にホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を加えます。</li>
	<li>冷たいプラスチックセルスクレーパーを使用して、皿から接着細胞を削り取ります。細胞懸濁液を予冷したマイクロ遠心チューブにそっと移します。</li>
	<li>回転器の4°Cで30分間一定の撹拌を維持する。</li>
	<li>4°Cの予冷遠心分離機で20分間16,000 x gでスピンします。</li>
	<li>遠心分離機からチューブをそっと取り出し、氷の上に置きます。上清を氷の上に置いた新鮮なチューブに移し、ペレットを捨てます。</li>
	<li>タンパク質アッセイを行うために、少量のリセート(10~20 μl)を除去します。RC DCアッセイキットを用いて、各サンプルのタンパク質濃度を決定します。</li>
	<li>必要に応じて、タンパク質サンプルを-20°Cで長期保存する。 凍結と解凍サイクルを繰り返すとタンパク質の分解を引き起こし、避けるべきです。</li>
	<li>各サンプルの約20 μgを取り、2xレムミリサンプルバッファー(4%SDS、10%2メルカプトエタノール、20%グリセロール、0.004%ブロモフェノールブルー、125 mM Tris-HCl、pH 6.8)の等量を加えます。</li>
	<li>各細胞のライセートを95°Cのサンプルバッファーで5分間加熱します。</li>
	<li>マイクロ遠心分離機で16,000 x gの遠心分離機を1分間用いた。</li>
</ol>2. 染色フリーゲルを用いたゲル電気泳動(30分)
<ol><li>基準TGX任意のKD染色フリープレキャストゲル(ミディフォーマットゲル)を取り、カセットの底から櫛とテープを取り外します。</li>
	<li>カセットを基準セルに入れ、統合された上部バッファーチャンバーに60 mlのランニングバッファ(25 mMトリス、190 mMグリシン、0.1%SDS、pH 8.3)を充填します。ランニングバッファで井戸をすすいします。</li>
	<li>400 ml のランニングバッファを備えた下のバッファータンクの半分を、マークされた充填ラインに充填します。</li>
	<li>タンパク質サンプルと適切なタンパク質マーカーをロードします。</li>
	<li>タンクに蓋を置き、色分けされたバナナプラグを蓋の上の対応するジャックと位置合わせします。</li>
	<li>ゲルを200Vで~30分間、300Vで20分間動かします。</li>
</ol>3. ケミドックMPシステムを用いた染色を含まないゲルイメージングでタンパク質分離品質を確認(~5分)
<ol><li>ゲルカセットを細胞から取り出します。基準セル蓋のゲルカセット開口ツールを使用してカセットを開け、ゲルを放出します。</li>
	<li>ChemiDoc MPイメージャーのUVサンプルトレイの中心に水のカップルを適用します。慎重にカセットからゲルを持ち上げ、トレイの上に置きます。</li>
	<li>イメージラボソフトウェアを起動し、次の設定で、染色のないゲルイメージ(図1A)をキャプチャします。 用途:無染色ゲル ゲル活性化時間:1分 イメージング領域:基準ゲル 画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化</li>
	<li>サンプルトレイからゲルを取り出し、すぐに転送ステップに進みます。</li>
</ol>4. トランスブロットターボシステムによるタンパク質の移動(10分)
<ol><li>トランスブロットターボミディPVDF転送パックを開きます。転写カセットの基部に底面の積み重ね(膜を含む)を置きます。</li>
	<li>ゲルを膜の上に置き、上部のスタックをゲルの上に置き、泡をロールアウトします。</li>
	<li>カセットベースに蓋を置き、ダイヤルを回してロックします。</li>
	<li>カセットをブロッターベイに挿入します。</li>
	<li>プリセットターボプログラムを選択し、基準ゲルサイズ(MIDI)を選択して転送を開始し、RUNキーを押します。典型的な走行時間はわずか7分です。</li>
	<li>転写が終わったら、ブロッティングサンドイッチを分解し、ブロットとゲルの両方を脱イオン水で容器に入れます。</li>
</ol>5. ケミドックMPシステムを用いた染色不要ゲルおよびブロットイメージングによるタンパク質転写効率と品質の確認(~5分)
<ol><li>トランスファー後ゲルをケミドック MP イメージャーのサンプルトレイに置きます。</li>
	<li>Image Labソフトウェアを起動し、次の設定で転写後ゲルの染色のないイメージ(図1B)をキャプチャします。 用途:無染色ゲル ゲル活性化時間:なし イメージング領域:基準ゲル 画像露光時間:予写ゲル画像の露光時間と同じ</li>
	<li>サンプルトレイからゲルを取り出し、次の設定でブロット(図1C)をイメージします。イメージング時に水またはTBSTの数滴で濡れたブロットを保ちます。 アプリケーション:汚れのないブロット イメージング領域:基準ゲル 画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化</li>
	<li>サンプルトレイからブロッティング膜を取り出し、TBST(TBSで0.1%Tween 20)の容器に入れます。</li>
</ol>6. 抗体インキュベーション
<ol><li>ブロックは、1時間の部屋温度でTBSTで3%ウシ血清アルブミン(BSA)の溶液にブロットを配置することによって。</li>
	<li>第1の標的タンパク質に対して上げられたマウス一次抗体およびウサギ一次抗体に対して第2の標的タンパク質に対して上昇したマウス一次抗体を含む溶液中の4°Cで一晩ブロットをインキュベートする。</li>
	<li>一次抗体を含む溶液を注ぎ出す。次に、20mlのTBSTで5分間撹拌してブロットを洗います。合計 5 回の操作で 4 倍の操作を繰り返します。</li>
	<li>Dylight 650コンジュゲートヤギ抗マウス抗体とDylight 549共役ヤギ抗ウサギ抗体を含む二次抗体溶液中の室温で1時間インキュベート。</li>
	<li>一次抗体を含む溶液を注ぎ出す。次に、20mlのTBSTで5分間撹拌してブロットを洗います。合計 5 回の操作で 4 倍の操作を繰り返します。</li>
</ol>7. 画像実験ソフトウェアによるイメージングとデータ解析- 全タンパク質正規化(~5分)
<ol><li>新しいマルチチャンネルプロトコルを開いてブロットの蛍光画像(図1E)を多重化して取得し、3つの蛍光チャネルを設定してプロトコルを実行します。 チャンネル1: アプリケーション:ブロットダイライト650 イメージング領域:基準ゲル 画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化 チャンネル2: アプリケーション:ブロットダイライト549 イメージング領域:基準ゲル 画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化 チャンネル3: アプリケーション:汚れのないブロット イメージング領域:基準ゲル画像露光時間:最も強いバンドに対して自動的に最適化</li>
	<li>[解析] ツール ボックスの [正規化] アイコンをクリックし、[はい] をクリックして車線とバンドを検出します。</li>
	<li>必要に応じて「レーンとバンド」を選択して、レーンとバンドを調整します。</li>
	<li>正規化チャネルとして、染色のない画像を選択します。</li>
	<li>MW 解析ツールを選択し、MW 標準レーンの下にあるチェックボックスをオンにして、MW 標準レーンを割り当てます。</li>
	<li>正規化されたボリュームを表示するには、ツールバーの[解析テーブル]をクリックします。すべての計算は、正規化係数と正規化されたボリュームを含むソフトウェアによって自動的に実行されます。ターゲットタンパク質バンド強度値は、タンパク質負荷の変動に合わせて調整されるようになりました。これにより、サンプル間の標的タンパク質の正確な比較が可能になります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2++signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle.">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li><li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li><li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+human+skeletal+muscle+fibers.">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li><li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney.">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+proteins:+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies.">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+genes;+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells.">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li><li>G&#252;rtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis.">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li><li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis.">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li><li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage.">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li><li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta:+general+protein+stains+are+the+benchmark.">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li><li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+temperature,+oxidative+stress,+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers.">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li><li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY&#913;A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian.">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRY&#913;A Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li><li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting.">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats.">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li><li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+of+troponin+I+(fast)+increases+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans.">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li><li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li><li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+Data+are+not+created+Equal.">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li><li>P&#233;rez-P&#233;rez, R., L&#243;pez, J. A., Garc&#237;a-Santos, E., Camafeita, E., G&#243;mez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fern&#225;ndez-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity.">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls:+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development.">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Romero-Calvo, I., Oc&#243;n, B., Mart&#237;nez-Moya, P., Su&#225;rez, M. D., Zarzuelo, A., Mart&#237;nez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots.">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li><li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro.">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li><li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li><li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins:+application+to+corneal+disease.">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li></ol>

著者のアントン・ポッシュ、ジョナサン・コーン、ケネス・オー、マット・ハモンド、寧劉はバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社の従業員です。

上記のV3染色フリープロトコルは、蛍光ウェスタンブロッティングを多重化するためのものである。また、化学発光検出を用いたウェスタンブロッティングにも適用できる。多重蛍光ウェスタンブロットプロトコルでは、染色のないブロット画像は、2つの時点で取得されます:1)タンパク質の転写直後。2)抗体インキュベーション後の多重蛍光イメージング工程で。第1の染色自由画像は、転写効率を計算するために使用され、第2の染色自由画像は、負荷制御として使用される。化学発光法を適用すると、染色無発光シグナルも染色フリーチャネルに現れるため、染色フリーおよびターゲットタンパク質シグナルの多重化画像を撮ることは不可能です。この場合、タンパク質転写工程直後に撮影した染色のない画像を、ローディング制御および正規化解析に使用することを推奨します。
V3 western ワークフローは、ロード制御としてハウスキーピングタンパク質を使用する従来のウェスタン ブロット ワークフローと比較して、次のような独自の利点を提供します。
まず、V3ワークフローは、実用的で便利で信頼性の高いローディング制御を提供し、目的のタンパク質のレベルの変化を検証します。V3プロトコルは、各サンプルで測定された対象タンパク質のレベルを正規化するために、総タンパク質負荷制御を使用します。これは、ローディングコントロールとしてハウスキーピングタンパク質を使用する2つの落とし穴を回避します: 飽和免疫検出と特定の実験条件下でのサンプル間の一貫性のないハウスキーピングタンパク質の発現レベル。ハウスキーピングに対する抗体を用いたストリッピングとリプロブステップは不要になりました。染色フリー技術を使用すると、タンパク質の全測定にクーマシーやシプロルビーなどの汚れでブロットを汚して脱染色する必要はありません。イメージラボソフトウェアを使用して全タンパク質の正規化を行うには、ブロット画像を取得するのにわずか数秒、約5分かかります。
第二に、V3ワークフローは、手順をより透明にし、品質管理のためのいくつかのチェックポイントを導入するので、科学者が西洋の手順のより良い制御を取ることを可能にします。染色フリー技術の助けを借りて、研究者はゲルとブロットの両方でタンパク質サンプルを視覚化することができます。科学者は、タンパク質サンプルの完全性(分解されたかどうか)、分離品質(沈殿または沈殿しない)、伝達効率と転送品質(転送または転送しない)を評価することができます。これらのチェックポイントは、研究がプロセスに大きな欠陥を見たときに実験を終了し、貧弱なサンプルやブロットに時間を無駄にしないようにするのに役立ちます。この技術はまた、科学者が膜剥離後にかなりの量のタンパク質損失があるかどうか、およびブロットが別の標的 4を再探査するのに適しているかどうかを評価するのに役立ちます。
ここでは、V3 Western ワークフローを使用して優れたエクスペリエンスと品質データを確保するためのヒントをいくつか紹介します。
<ol><li>ゲルを実行した直後にゲルをイメージします。汚れ化合物を洗い流す可能性があるため、手順の最初のイメージングの前にゲルを任意のバッファーに浸漬しないでください。</li>
	<li>同じイメージング領域を使用して、プロトコル内のすべてのイメージを取得します。これにより、ソフトウェアは、総タンパク質正規化などのデータ分析のための画像をオーバーレイすることができます。</li>
	<li>事前転写ゲルと転写後ゲルを撮像する際の露光時間を一貫して保ちます。これにより、ソフトウェアは転送効率を定量的に測定できます。</li>
	<li>ブロット画像を取得する際には、数滴の水またはTBSTで膜を濡らしてください。これにより、標的タンパク質検出に関する汚れた背景の問題を回避できます。</li>
	<li>蛍光性ウェスタンブロッティングの多重化には低蛍光PVDF膜を使用してください。</li>
</ol>UV活性化後の染色を含まない分子はトリプトファン残基に不可逆的に結合することに注意することが重要である。この不可逆的な修飾は、エピトープにトリプトファンが含まれている場合、モノクローナル抗体を使用する場合に抗原認識に影響を与える可能性があります。ポリクローナル抗体は、抗原上の複数のエピトープを認識するため、影響を受ける可能性は低い。結合されていない染色を含まない分子は、ゲルや膜から容易に洗い流されるため、抗体と抗原の相互作用を妨げない。
結論として、V3 Westernワークフローは、ウェスタンブロットプロセスをより速く、より透明で、定量的で信頼性が高くなります。研究者は、ウェスタンブロット実験で総タンパク質負荷制御を簡単に適用して、データをより信頼できるようにすることができます。V3染色フリーのワークフローは、多くのラボで採用されており、その出版物は、ジャーナルがウェスタンブロット22,17,7,8,5,23,18,15のローディング制御として汚れのないデータを受け入れることを実証しています。

ウェスタンブロットは非常に便利な技術9ですが、ウェスタンブロッティングには長くて労働集約的なプロセスとデータの質という2つの大きな課題があります。従来のプロトコルは約2日を要します。サンプル調製、ゲルキャスティング、タンパク質電気泳動および転写、膜遮断、抗体インキュベーション、イメージング、そして非常に頻繁に剥離、再探査、および最後のデータ分析を含む多くのステップが含まれます。このプロセスを通して、プロセス制御のための信頼性と柔軟性のあるツールはありません。そのため、各ステップでエラーが発生する可能性があり、これらのエラーはデータアーティファクトを生成する可能性があります。したがって、ローディングコントロールは、エラーを識別して修正するために、ウェスタンブロッティングで不可欠です。ローディング制御は通常、各サンプルの参照タンパク質のタンパク質レベルをチェックして、それが等しく提示されているかどうかを確認することによって行われます。人々はしばしば、β-アクチン、β-tubulin、GAPDHなどのハウスキーピングタンパク質をローディングコントロールとして使用します。 
ウェスタンブロットデータの品質は、信頼性の高いローディング制御に依存します。しかし、ローディングコントロールにハウスキーピングタンパク質を使用する場合には、2つの正当な懸念があります:1)ハウスキーピングタンパク質バンドの抗体ベースの免疫検出はしばしば飽和しているため、サンプル30の間の負荷の違いを区別することはできません。2)ハウスキーピングタンパク質発現量は、ある特定の実験条件下でサンプル中で変化し得るが、例えば、siRNA処理、細胞死、細胞分化、11、28、3、6、10、21などである。これらの懸念から、科学雑誌は「定量的比較のために、適切な試薬、制御および線形信号範囲を用いるイメージング法を使用すべきである」(Natureガイドライン)を要求している。同様に、臨床調査のジャーナルからの編集者は、より信頼性の高いローディングコントロール24を求めています。これらの理由から、ローディングコントロールとして使用するためにハウスキーピングタンパク質を検証する必要があります。まず、免疫検出方法14,29の線形ダイナミックレンジで測定されていることを確認する必要がある。第二に、すべてのサンプル26,31,25,19,20で一貫して表現されていることを確認する必要があります。
信頼性の高いローディング制御に代わる解決策は、ブロットからの総タンパク質測定を使用することです。一部の研究者は、クーマシー、フラミンゴピンク、シプロルビー、アミドブラック、ポンソーS、および汚れのない技術などの総タンパク質汚れでブロットを染色し、各レーンの総タンパク質シグナルをローディングコントロール16,20,13,27,1,4,12として測定しています。総タンパク質ローディング制御は、ハウスキーピングタンパク質に関連する落とし穴を回避します。まず、各サンプルに対してロードされるタンパク質の量を真に反映したものである。第2に、全タンパク質染色は、ウェスタンブロット分析のための共通のローディング範囲(複雑な細胞ライセートの10〜50μgタンパク質)において優れた線形ダイナミックレンジを示し、サンプル12間の負荷差を正確に区別する。
染色フリー技術は、アクリルアミドゲル溶液にユニークな化合物を混合し、キャストされたゲルに均等に分布する新規の全タンパク質染色法です。電気泳動が完了した後、ゲルは最低1分間UV光にさらされ、染色化合物がタンパク質中のトリプトファン残基と反応するようになる。タンパク質はUV光下で興奮し、ChemiDoc MPシステムのような染色を含まないイメージャーで視覚化および定量することができる強力な蛍光シグナルを与えます。しかし、染色を含まない化合物自体はUV光を吸収せず、ゲル画像の背景が低くなる。トリプトファン残基の修飾は不可逆的であり、タンパク質はゲルだけでなく、タンパク質の転写後いつでもブロット上で視覚化することができます。
この染色を含まない技術は、V3 Western ワークフロー (図 1)に適用され、従来のワークフローに関する主な不満、特にローディング コントロールとしてのハウスキーピングタンパク質の使用に関する懸念事項に対処します。このワークフローを使用すると、1)約20〜30分でゲルを実行し、2)ゲルラン後5分でサンプルの完全性とタンパク質分離品質をチェックすることができます。3)3-10分でタンパク質を移動します。4)転送効率を定量的に確認してください。そして5)最も重要なことは、総タンパク質負荷制御を使用して、目的のタンパク質のレベルの変化を検証する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>&lt;strong&gt;567-8093&lt;/strong&gt;</td><td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td><td>Bio-Rad</td><td>&lt;strong&gt;170-4157&lt;/strong&gt;</td><td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Criterion Cell </td><td>Bio-Rad</td><td>165-6100</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-4155</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-8280</td><td></td></tr></tbody></table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

ウェスタンブロットは非常に有用で広く採用されているラボ技術ですが、その実行は困難です。実験者は、それがいくつかのステップの最後まで正常に実行されたかどうかを知らないので、ワークフローはしばしば「ブラックボックス」として特徴付けられます。さらに、ウェスタンブロットのデータの品質は、ウェスタンブロッティングプロセス全体で効果的な品質管理ツールが不足しているため、時には挑戦されます。ここでは、従来のウェスタンブロットプロトコルに関連する主要な懸念事項に対処するために、汚れのない技術を適用するV3 westernワークフローについて説明します。このワークフローは研究者を可能にする:1)約20〜30分でゲルを実行する。2)ゲルの実行後5分以内にサンプル分離品質を可視化する。3)3-10分でタンパク質を移す。4)転送効率を定量的に検証する。そして最も重要な5)総タンパク質負荷制御を使用して関心のあるタンパク質のレベルの変化を検証する。この新しいアプローチは、βアクチン、βチューブリン、GAPDHなどのハウスキーピングタンパク質のブロットを除去して再探査する必要 を排除しますV3 染色フリーワークフローは、ウェスタンブロットプロセスをより速く、透明、より定量的で信頼性の高いものにします。

1. 染色を含まないゲル画像を用いたサンプルの完全性、タンパク質分離品質、および転写効率の評価。
HeLa細胞からのタンパク質抽出物を、18ウェル基準AnyKD TGX染色フリーゲルで20分間300Vで分離した。タンパク質サンプルは、4つの異なる量(レーン1-3、40 μg)で3倍にロードされました。レーン 4-6, 30 μg;レーン7-9、20 μg;レーン10-12、10 μg)。このゲルを1分間UV光下で活性化した 図2A は、タンパク質分離直後に取得したゲル画像を示す。タンパク質サンプルの完全性(例えば 分解)および分離品質(例えば タンパク質沈殿)は、このゲル画像で視覚的に評価することができる。その後、トランスブロットターボを用いてニトロセルロース膜に7分間タンパク質を移した。 図2B は転写後ゲルの染色を含まない画像を示す。両方の画像は、同じ露光時間(6.8秒)で取得されました。レーン3および12は、転写効率を測定するために選択した。イメージ ラボ ソフトウェアのボリューム ツールを使用して、両方のゲル イメージのレーン 3 と 12 をカバーするために長方形のボックス (青) を描きました。これらのボックスからの体積値に基づく計算は、両方の車線の転送効率が80%であることを示した(図2C)。この実験では、中小の標的タンパク質を研究するためにAnyKD TGXゲルを選択し、大きなタンパク質の転写に最適化されませんでした。転写効率を最適化するには、より低いパーセントゲル(例えば 4-20%)の使用が必要です大きなタンパク質の転写を容易にする転送時間の調整および/または調整。2.染色フリーの全タンパク質ローディングコントロールは、対象タンパク質のレベルの小さな変化を定量化するために、ウェスタンブロッティングにおけるハウスキーピングローディングコントロールに代わる信頼性の高い代替手段です。
MCM-7は、照射処理後のリンパ芽球細胞株(LCL)で20〜50%減少するレベルのDNAライセンス複製因子である。この実験では、4つの対照および照射処理されたリンパ芽球細胞株(LCL)培養液のライセート(それぞれ30μg)を、12ウェル基準AnyKD TGX染色フリーゲルで分離した。このゲルをUV光下で1分間活性化し、トランスブロットターボでPVDF膜に移して免疫ブロッティングを行った。ハウスキーピングタンパク質GAPDH(緑色)をウサギ抗体(米国細胞シグナリング技術、1:2,500)とダイライト549コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体(ロックランド、米国、1:20,000)でプローブしました。目的のMCM-7(赤)のタンパク質をマウス抗体(米国、1:1000)およびダイライト649共役ヤギ抗マウス抗体(ロックランド、1:10,000)を用いてプローブした。
図3A は、LCLサンプルの4つの制御および照射処理で検出された総タンパク質(青色)、MCM-7(赤)およびGAPDH(緑色)の多重蛍光像を示す。 図3B は、各試料(30μg)における全タンパク質パターンを示す同じブロットの染色を含まない画像である。画像ラボソフトウェアは、各レーンのMCM-7、GAPDH、および総タンパク質量を測定するためにサンプルレーン(青いボックス)を選択しました。MCM-7レベルを、染色を含まない全タンパク質測定またはGAPDHに対して正規化した。正規化されたMCM-7タンパク質レベルを統計的に分析し、MCM-7タンパク質バンドの平均容量と標準偏差(n=4)をチャートに示した(図3C)。両方の正規化方法は、小さな減少を明らかにしました (約 25%)照射処理後のMCM-7タンパク質レベルで。総タンパク質正規化を有するデータは、負荷制御としてGAPDHを用いたデータよりも標準偏差が小さくなった。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> 図 1.V3ウェスタンワークフロー。 V3 ワークフローは、4 つの手順の左側の列に示されています。ワークフローで使用される主要な計測器と試薬は、各ステップで示されています。各ステップの推定時間も含まれます。右の列は、V3 ワークフローで最低 4 つのイメージを生成できることを示しています。各データの使用について説明します。前転写ゲル、転写後ゲル、およびブロット(A、B、C)の染色を含まない画像は、従来のウェスタンブロッティング技術では容易に生成できません。これらの画像とデータは、科学者のコントロールとウェスタンブロットワークフローの再現性を向上させるための手順に沿った重要な情報とチェックポイントを提供します。この標的タンパク質シグナルは、検出にHRP結合二次抗体を適用した場合は化学発光ブロット画像(D)、または蛍光ブロット画像(E)に多重化蛍光性ウェスタンブロット法を実施し、同じブロット上で同時に複数の標的タンパク質を検出した場合に、いずれも捕捉することができる。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> 図 2.V3 Western ワークフローの前移送ゲルおよび転写後ゲルの染色を含まない画像で、サンプルの完全性、分離品質、および転送効率を評価します。(A)事前転写ゲル染色フリー画像。(B)転写後ゲル染色不要画像。(C)タンパク質の移動効率測定。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> 図 3.対象タンパク質のレベルを正常化するための負荷制御として、GAPDH免疫検出との染色を含まない全タンパク質測定を比較する。(A)蛍光ウェスタンブロット画像。(B)汚れのないブロット画像。(C) 正規化 MCM-7 タンパク質レベル.
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V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

V3ワークフローは、染色フリーゲルを使用したウェスタンブロット手順です。この染色フリー技術により、研究者はタンパク質分離の質を可視化し、転写効率を検証し、最も重要なのは、信頼性の高いローディングコントロールとしてタンパク質の総定量を使用して目的のタンパク質の変化を検証することが可能です。

ウェスタンブロッティングにおける実用的で便利で信頼性の高い全タンパク質ローディング制御のためのV3染色不要のワークフロー

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

22.5K ビュー.  Bio-Rad Laboratories. V3ワークフローは、染色フリーゲルを使用したウェスタンブロット手順です。この染色フリー技術により、研究者はタンパク質分離の質を可視化し、転写効率を検証し、最も重要なのは、信頼性の高いローディングコントロールとしてタンパク質の総定量を使用して目的のタンパク質の変化を検証することが可能です。

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Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

西洋は、Invitrogen NuPage NOVEXビストリスミニゲルを用いたウェスタンブロット

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

生物学

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

生化学

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1 
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunoprecipitation (IP, also known as a &#39;pull-down&#39; assay) is a widely used technique that has applications in a variety of fields. First conceived in 1984, it was refined in 1988 (1, 2). The fundamental goal of IP is purification and isolation of a specific protein using an antibody against that protein. The word &#34;immuno&#34; refers to the use of an antibody while the word &#34;precipitation&#34; refers to pulling down a specific substance from a solution. The target protein might be endogenous or recombinant. Most recombinant proteins have an epitope tag (i.e. myc or flag) attached to them to simplify subsequent purification. Typically, it is easier to optimize recombinant protein IP because the antibodies against recombinant epitope tags are very strong and effective. Antibodies against endogenous proteins have extremely variable efficacy - making it much more difficult to optimize these IPs. A necessary step after immunoprecipitation is verification of purification. The isolated protein is resolved using SDS-PAGE and subsequently probed for purity by western blots (Figure 1). An important control is the use of a different antibody during the Western blot to verify pull down of the correct protein. The combination of IP with subsequent techniques is a powerful analysis tool. The goal after purification may be characterization of the protein itself by NMR, mass spectrometry, and in vitro assays, or analysis of the protein&#39;s interacting partners (i.e. protein, DNA, RNA) (3, 4, 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10502/10502fig1.jpg" /> 
Figure 1: Overview of Immunoprecipitation Procedure. Immunoprecipitation is the isolation of a specific protein using an antibody. After production of lysate from cells, there are two major steps- pre-clearing and pull down. During pre-clearing step, the cell-lysates are pre-cleared of proteins that bind to antibodies non-specifically using an isotype control antibody. In pull down step, the target protein is pulled down using a protein-specific antibody. The isolated protein is then analyzed by Western blot. Isotype antibodies and protein specific antibodies have the same constant domain, but different antigen binding domains. A key component of this protocol is Protein A/G agarose beads that bind the constant domain of antibodies- allowing immunoprecipitation of the target protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10502/10502fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Antibodies are the key component of an immunoprecipitation that differentiate it from other forms of protein purification (i.e. nickel affinity column purification). Antibodies are molecules made by B cells that can recognize specific protein epitopes. Antibodies have two domains: constant (Fc) and antigen binding (Fab) (Figure 1). The constant domain identifies the type of antibody and dictates function in vivo. Usually, the constant domains of antibodies used for IP are mouse, rat, or rabbit IgG. The antigen binding portion of the antibody recognizes a specific epitope of a specific protein. Antibodies can recognize epitopes on folded proteins that may not exist when the protein is denatured and vice versa. Therefore, the availability of the epitope depends on protein folding - identifying an important factor to consider when choosing antibodies and conditions for IP.
Both prokaryotic and eukaryotic systems have antibody-binding proteins. In eukaryotic systems, the purpose is immune protection from bacteria while in prokaryotic systems, the purpose is protection from the immune system. Antibody-binding proteins affect IP methodology in two ways. First, there is a necessary pre-clearing step (Figure 1) to rid the lysate of proteins that bind antibodies - thereby reducing non-specific binding in the final product. This step uses an isotype antibody that has the same constant domain as but a different antibody binding domain than your protein-specific antibody. Bacterial antibody-binding proteins are the second key component of this method. After the protein-specific antibody binds the target protein, the antibody: protein complex must be pulled down (Figure 1). Proteins A, G, and L are bacterial proteins that bind the constant domain of antibodies. While bacteria use this to subvert the immune system, researchers have co-opted this system for easy antibody purification, and it is used during both the pre-clearing and pull-down steps. These proteins have different binding affinities for different species and different constant domain subtypes - another factor to consider when choosing conditions for IP. Many companies sell Protein A/G labeled agarose beads (Figure 1), pre-made spin columns, or resins to make columns. In general, beads and spin columns are used for smaller sample sizes while resins are used for bulk purification.
In this lab exercise, we demonstrate how to purify the endogenous protein c-myc, from primary murine thymocytes, using Protein A/G Plus agarose beads based basic immunoprecipitation technique. The protocol starts from cell lysate preparation and ends with the with verification of successful protein pull down using Western blot analysis.

Immunoprecipitation Techniques: Purification of Proteins

免疫沈殿ベースの技術:アガロースビーズを用いた内因性タンパク質の精製

Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunoprecipitation ...

Education

JoVE Science Education

高等生物学

免疫学

The Western Blot

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples. Following separation by a technique known as sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE, western transfer is used to move proteins from a polyacrylamide gel onto a piece of membrane which traps the proteins in their respective locations. Next, the membranes are probed with antibodies in a process called immunboblotting. Immunoblotting uses antibody-protein and antibody-antibody binding through specific recognition sites, providing the high specificity required for identifying a single protein. The detection of antibodies takes place using reporter systems which includes the use of enzymes. Enzymes can be attached to the end of an antibody and react with substrates to produce changes in color or light. These signals can then be imaged and quantified using a process called densitometry.
This video-article presents an overview of the western blot technique by describing western transfer, the use of antibody detection, and image analysis. The steps involved with western transfer such as the assembly of the transfer sandwich and transfer conditions are discussed in detail as well as the theory behind antibody binding and detection of those antibodies. The broad applications of this technique are described through several examples including the detection of protein-protein interactions and identification of individual proteins within protein complexes.

Western Blotting: Western Transfer, Antibody Detection, and Image Analysis

ウエスタンブロット法

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

基礎生物学

細胞および分子生物学の基本的方法

Quantitative Western Blotting to Estimate Protein Expression Levels

Source: Huang, Y. T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59438">Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting.</a> J. Vis. Exp. (2019).
The video demonstrates a total protein normalization-based western blotting technique for quantifying the target protein expression in a sample. By utilizing the total protein staining of the sample, a ratiometric analysis is performed to determine the relative expression level of the target protein.