המחברים מודים לד"ר וולף-דיטר סטאלס, ד"ר ארנו רמי, ד"ר אנטון פוש, ד"ר פטרישיה פיאטי, טום דייויס, קריס סימוני וג'ף דרבן על הביקורת והעריכה של כתב היד. המחברים מודים גם לאליסון שוורץ על התמיכה הטכנית.

1. הכנת דגימת חלבון
(מתואר הליך אופייני להפקת חלבונים מתרבית התאים)
<ol><li>מניחים את צלחת תרבות התא HeLa בקרח ולשטוף את התאים עם מלח קר כקרח Tris-אגירה (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>לשאוף את TBS, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר לכל 100 מ"מ צלחת קר כקרח מאגר RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% SDS) בתוספת מעכבי פוספטאז ופרוטה.</li>
	<li>לגרד תאים חסידים את המנה באמצעות מגרד תא פלסטיק קר; מעבירים בעדינות את השעיית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה מקולק מראש.</li>
	<li>לשמור על תסיסה מתמדת במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס על מסובב.</li>
	<li>ספין ב 16,000 x גרם במשך 20 דקות בצנטריפוגה 4 °C (60 °F).</li>
	<li>מוציאים בעדינות את הצינור מהצנטריפוגה ומניחים על הקרח. מעבירים את הסופרנט לצינור טרי שנשמרו על קרח, וזורקים את הכדור.</li>
	<li>הסר נפח קטן (10-20 μl) של lysate לבצע בדיקה חלבון. קבעו את ריכוז החלבון עבור כל דגימה באמצעות ערכת מבחני RC DC.</li>
	<li>במידת הצורך, יש לאסוף את דגימות החלבון לאחסון לטווח ארוך ב-20°C(20°C). מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים גורמים להשפלת חלבונים ויש להימנע מהם.</li>
	<li>קח בערך 20 מיקרוגרם של כל מדגם, להוסיף נפח שווה של 2x Laemmli מאגר מדגם (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% גליצרול, 0.004% כחול ברומופנול, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8).</li>
	<li>מחממים כל תא lysate במאגר מדגם ב 95 °C (70 °F) במשך 5 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 16,000 x g במיקרוצנטריפוגה במשך דקה.</li>
</ol>2. ג'ל אלקטרופורזה עם ג'לים ללא כתמים (~ 30 דקות)
<ol><li>קח קריטריון TGX כל ג'ל precast ללא כתמים KD (ג'ל בפורמט midi), להסיר את המסרק ואת הקלטת מתחתית הקלטת.</li>
	<li>הנח את הקלטת בתא הקריטריון ומלא את תא החיץ העליון המשולב במאגר פועל של 60 מ"ל (25 מטר טריס, גליצין 190 מ"מ, 0.1% SDS, pH 8.3). יש לשטוף את הבארות באמצעות חיץ פועל.</li>
	<li>מלא כל מחצית ממיכל החיץ התחתון במאגר פועל של 400 מ"ל לקו המילוי המסומן.</li>
	<li>טען את דגימות החלבון ואת סמני החלבון המתאימים.</li>
	<li>מניחים את המכסה על המיכל, מיישרים את תקעי הבננה המקודדים בצבע עם שקעים מתאימים על המכסה.</li>
	<li>הפעל את הג'ל במשך ~ 30 דקות ב 200 V או 20 דקות ב 300 V.</li>
</ol>3. הדמיית ג'ל ללא כתמים באמצעות מערכת MP Chemidoc לבדיקת איכות הפרדת חלבונים (~ 5 דקות)
<ol><li>הסר את קלטת הג'ל מהתא. השתמש בכלי פתיחת קלטת הג'ל במכסה תא הקריטריון כדי לפצח את הקלטת ולשחרר את הג'ל.</li>
	<li>החל כמה מיליליטרים של מים למרכז מגש מדגם UV של הדמיה MP ChemiDoc. בזהירות להרים את הג'ל מהקלטת ומניחים אותו על המגש.</li>
	<li>הפעל את תוכנת Image Lab ולכוד את תמונת הג'ל נטולת הכתמים (איור 1A) עם ההגדרות הבאות: יישום: ג'ל ללא כתמים זמן הפעלת ג'ל: דקה אחת אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר</li>
	<li>מוציאים את הג'ל מהמגש לדוגמה וממשיכים מיד לשלב ההעברה.</li>
</ol>4. העברת חלבון עם מערכת טורבו טרנס-כתם (~ 10 דקות)
<ol><li>פתח חבילת העברה טרנס-כתם טורבו מידי PVDF; מניחים את הערימה התחתונה (הכוללת את הממברנה) על בסיס קלטת ההעברה.</li>
	<li>מניחים את הג'ל על גבי הממברנה, מניחים את הערימה העליונה על הג'ל, ומרדים בועות.</li>
	<li>הנח את המכסה על בסיס הקלטת וסובב את החוגה כדי לנעול אותה.</li>
	<li>הכנס את הקלטת לתא הגוש.</li>
	<li>התחל את ההעברה על-ידי בחירת תוכנית טורבו מוגדרת מראש ובחירת גודל ג'ל הקריטריון (midi) ולאחר מכן הקש RUN. ריצה טיפוסית אורכת רק 7 דקות.</li>
	<li>כאשר ההעברה נגמרת, לפרק את כריך סופג ומניחים הן את הכתם ואת הג'ל במיכל עם מים deionized.</li>
</ol>5. ג'ל ללא כתמים והדמיית כתמים באמצעות מערכת MP Chemidoc לבדיקת יעילות ואיכות העברת חלבונים (~ 5 דקות)
<ol><li>מניחים את הג'ל שלאחר ההעברה על מגש הדגימה של הדמיה ChemiDoc MP.</li>
	<li>הפעל את תוכנת Image Lab ולכוד את התמונה נטולת הכתמים של הג'ל שלאחר ההעברה (איור 1B) עם ההגדרות הבאות: יישום: ג'ל ללא כתמים זמן הפעלת ג'ל: ללא אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: זהה לזמן החשיפה לתמונת הג'ל שלפני ההזעה</li>
	<li>הסר את הג'ל מהמגש לדוגמה ולאחר מכן תמונה של הכתם (איור 1C) עם ההגדרות הבאות. שמור על הכתם רטוב עם כמה טיפות מים או TBST בעת הדמיה. יישום: כתם ללא כתמים אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר</li>
	<li>הסר את קרום סופג ממגש המדגם ומניחים אותו במיכל עם TBST (0.1% Tween 20 ב- TBS).</li>
</ol>6. דגירת נוגדנים
<ol><li>חסום על ידי הצבת הכתם בתמיסה של 3% אלבומין סרום שור (BSA) ב TBST בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה.</li>
	<li>דגירה הכתם לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתמיסה המכילה נוגדן ראשוני העכבר הרים נגד חלבון היעד הראשון נוגדן ראשי ארנב הרים נגד חלבון היעד השני.</li>
	<li>יוצקים את הפתרון המכיל את הנוגדן העיקרי. לאחר מכן, לשטוף את הכתם על ידי נסער ב 20 מ"ל של TBST במשך 5 דקות. חזור על 4x עבור סך של 5 שוטף.</li>
	<li>דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר בתמיסת הנוגדנים המשנית המכילה נוגדן עז נגד עכבר Dylight 650 מצומד ונוגדן עז נגד עכבר Dylight 549 מצומד עז נגד ארנב.</li>
	<li>יוצקים את הפתרון המכיל את הנוגדן העיקרי. לאחר מכן, לשטוף את הכתם על ידי נסער ב 20 מ"ל של TBST במשך 5 דקות. חזור על 4x עבור סך של 5 שוטף.</li>
</ol>7. הדמיה וניתוח נתונים על ידי תוכנת מעבדת תמונה- נורמליזציה כוללת של חלבונים (~ 5 דקות)
<ol><li>השג תמונה פלואורסצנטית מרובת ערכים של הכתם (איור 1E) על-ידי פתיחת פרוטוקול רב-ערוצי חדש, קביעת תצורה של שלושה ערוצי פלואורסצנט והפעלת הפרוטוקול. ערוץ 1: יישום: כתמים Dylight 650 אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר ערוץ 2: יישום: כתם דילייט 549 אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר ערוץ 3: יישום: כתם ללא כתמים אזור הדמיה: זמן חשיפה לתמונת ג'ל קריטריון: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר</li>
	<li>לחץ על סמל נורמליזציה מתיבת כלי הניתוח ולחץ על כן כדי לזהות נתיבים ורצועות.</li>
	<li>בחר והשתמש ב"כלים של נתיבים ולהקות" כדי לבצע התאמות לנתיבים וללהקות במידת הצורך.</li>
	<li>בחרו תמונה נטולת כתמים כערוץ הנורמליזציה.</li>
	<li>בחר כלי ניתוח MW והקצה את הנתיבים הסטנדרטיים של MW על-ידי סימון התיבות שמתחתיהם.</li>
	<li>כדי להציג את אמצעי האחסון המנורמלים, לחץ על טבלת הניתוח בסרגל הכלים. כל החישובים יבוצעו באופן אוטומטי על-ידי התוכנה, כולל פקטור הנורמליזציה ואמצעי אחסון מנורמלים. ערכי עוצמת רצועת החלבון המשמשים כיעד מותאמים כעת לשינויים בעומס החלבון. זה יאפשר השוואות מדויקות של חלבוני היעד בין הדגימות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2++signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle.">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li><li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li><li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+human+skeletal+muscle+fibers.">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li><li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney.">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+proteins:+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies.">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+genes;+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells.">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li><li>G&#252;rtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis.">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li><li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis.">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li><li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage.">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li><li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta:+general+protein+stains+are+the+benchmark.">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li><li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+temperature,+oxidative+stress,+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers.">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li><li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY&#913;A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian.">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRY&#913;A Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li><li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting.">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats.">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li><li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+of+troponin+I+(fast)+increases+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans.">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li><li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li><li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+Data+are+not+created+Equal.">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li><li>P&#233;rez-P&#233;rez, R., L&#243;pez, J. A., Garc&#237;a-Santos, E., Camafeita, E., G&#243;mez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fern&#225;ndez-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity.">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls:+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development.">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Romero-Calvo, I., Oc&#243;n, B., Mart&#237;nez-Moya, P., Su&#225;rez, M. D., Zarzuelo, A., Mart&#237;nez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots.">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li><li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro.">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li><li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li><li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins:+application+to+corneal+disease.">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li></ol>

המחברים, אנטון פוש, ג'ונתן קון, קנת הו, מאט האמונד ונינג ליו הם עובדים של מעבדות ביו-ראד בע"מ.

פרוטוקול V3 ללא כתמים המתואר לעיל הוא עבור כתמים מערביים פלואורסצנטיים מולטיפלקסים. זה יכול להיות מיושם גם סופג המערבי באמצעות זיהוי chemiluminescent. בפרוטוקול הכתם המערבי הפלואורסצנטי מולטיפלקס, התמונות כתם ללא כתמים נרכשים בשתי נקודות זמן: 1) מיד לאחר העברת חלבון; 2) בשלב הדמיה פלואורסצנטית מולטיפלקס לאחר דגירה נוגדן. התמונה הראשונה ללא כתמים משמשת לחישוב יעילות ההעברה והתמונה השנייה נטולת הכתמים משמשת כבקרת הטעינה. כאשר השיטה chemiluminescent מוחל, לא ניתן לקחת תמונה מולטיפלקס עבור אותות חלבון ללא כתמים ויעד, כי האות chemiluminescent יופיע בערוץ ללא כתמים מדי. במקרה זה, אנו ממליצים להשתמש בתמונה נטולת כתמים שצולמה מיד לאחר שלב העברת החלבון לניתוח בקרת טעינה ונורמליזציה.
זרימת העבודה המערבית V3 מספקת את היתרונות הייחודיים הבאים בהשוואה לזרימת העבודה המסורתית של כתמים מערביים המשתמשת בחלבוני משק בית כפקדי טעינה:
ראשית, זרימת העבודה של V3 מספקת בקרת טעינה מעשית, נוחה ואמינה יותר כדי לאמת את השינויים ברמת החלבון המעניין. פרוטוקול V3 משתמש בבקרת טעינת חלבונים כוללת כדי לנרמל את רמת החלבון המעניין הנמדדת בכל דגימה. היא מונעת שתי מלכודות של שימוש בחלבוני משק הבית כבקרות טעינה: כשל חיסוני רווי ורמות ביטוי חלבון משק בית לא עקביות בין הדגימות בתנאים ניסיוניים מסוימים. צעדי הפשטה ותדלוק עם נוגדנים המכוונים נגד משק בית אינם נחוצים עוד. באמצעות טכנולוגיה נטולת כתמים, אין צורך להכתים ולהכתים כתם עם כתמים כגון קומאסי או Sypro Ruby למדידת חלבון כוללת. זה לוקח רק כמה שניות כדי לרכוש תמונה כתם על 5 דקות לעשות נורמליזציה חלבון הכולל באמצעות תוכנת Image Lab.
שנית, זרימת העבודה V3 מאפשרת למדענים לקחת שליטה טובה יותר על ההליך המערבי כי זה עושה את ההליך שקוף יותר ומציג מספר מחסומים לבקרת איכות. בעזרת טכנולוגיה נטולת כתמים, החוקרים יכולים לדמיין את דגימות החלבון שלהם הן על הג'ל והן על הכתם. מדענים יכולים להעריך את שלמות דגימת החלבון (מושפלת או לא), איכות ההפרדה (מזורזת או לא), יעילות העברה ואיכות העברה (אפילו העברה או לא). נקודות ביקורת אלה מסייעות למחקרים לסיים את הניסוי כאשר רואים פגמים גדולים בתהליך ולהימנע מבזבוז זמן על דגימות וכתמים ירודים. טכנולוגיה זו גם מסייעת למדענים להעריך אם יש כמות משמעותית של אובדן חלבון לאחר הפשטת קרום והאם הכתם מתאים לתוכחת מטרה אחרת 4.
להלן כמה עצות להבטחת ניסיון טוב ונתונים איכותיים באמצעות זרימת עבודה מערבית של V3.
<ol><li>תמונה ג'ל מיד לאחר ריצת ג'ל. אין להשרות את הג'ל בכל חיץ לפני ההדמיה הראשונה בהליך מכיוון שהוא עלול לשטוף את תרכובת הכתם.</li>
	<li>השתמש באותו אזור דימות כדי להשיג את כל התמונות בפרוטוקול. זה יאפשר לתוכנה לכסות תמונות לניתוח נתונים כגון נורמליזציה מוחלטת של חלבונים.</li>
	<li>שמור על זמן החשיפה עקבי בעת הדמיה של ג'לים לפני טרנזיור ולאחר העברה. פעולה זו תאפשר לתוכנה למדוד כמותית את יעילות ההעברה.</li>
	<li>שמור על הממברנה רטובה עם כמה טיפות מים או TBST בעת רכישת התמונה כתם. זה ימנע בעיות רקע מלוכלכות אפשריות לגילוי חלבון היעד.</li>
	<li>השתמש קרום PVDF פלואורסצנטי נמוך עבור כתמים פלואורסצנטיים פלואורסצנטיים מרובים.</li>
</ol>חשוב לציין כי מולקולה ללא כתמים לאחר הפעלת UV קשורה באופן בלתי הפיך לשאריות טריפטופן. שינוי בלתי הפיך זה עלול להשפיע על זיהוי אנטיגן בעת שימוש בנוגדנים חד שבטיים אם האפיטופ מכיל טריפטופן. נוגדנים פוליקלונליים לא צפויים להיות מושפעים כי הם מזהים אפיטופים מרובים על האנטיגן. מולקולות נטולות כתמים לא מאוגדות נשטפות בקלות מהג'ל והממברנה ולכן לא יפריעו לאינטראקציות נוגדנים-אנטיגן.
לסיכום, זרימת העבודה המערבית V3 הופכת את תהליך הכתם המערבי למהיר יותר, שקוף יותר, כמותי ואמין יותר. חוקרים יכולים כעת ליישם בקלות בקרת טעינת חלבון מוחלטת בניסוי כתם מערבי כדי להפוך את הנתונים שלהם למהימנים יותר. זרימת העבודה ללא כתמים V3 אומצה על ידי מספר מעבדות, ופרסומיהם הוכיחו כי כתבי עת מקבלים נתונים ללא כתמים כבקרת טעינה בכתם המערבי22,17,7,8,5,23,18,15.

כתם מערבי הוא טכניקה שימושית מאוד9, עם זאת, ישנם שני אתגרים עיקריים עם סופג המערבי: תהליך ארוך עבודה אינטנסיבי ואיכות הנתונים. פרוטוקול מסורתי דורש בערך יומיים. זה כרוך בצעדים רבים כולל הכנת מדגם, יציקת ג'ל, אלקטרופורזה חלבון והעברה, חסימת קרום ואחריו דגירה נוגדנים, הדמיה, ולעתים קרובות למדי הפשטה, תוכחה, ולבסוף ניתוח נתונים. לאורך כל התהליך הזה, אין כלים אמינים וגמישים לבקרת תהליכים. ככזה, שגיאות ניתן להציג בכל שלב, ושגיאות אלה יש פוטנציאל ליצור חפצי נתונים; לכן, טעינת פקדים חיוניים בנפח המערבי כדי לזהות ולתקן את השגיאות. בקרת הטעינה נעשית בדרך כלל על ידי בדיקת רמת החלבון של חלבון ייחוס בכל מדגם כדי לראות אם הוא מוצג באותה מידה. אנשים משתמשים לעתים קרובות בחלבונים של משק בית, כגון β-אקטין, β-טובולין, GAPDH, כבקרת טעינה.
איכות נתוני הכתמים המערביים תלויה בבקרת טעינה אמינה. אבל יש שני חששות לגיטימיים בעת שימוש בחלבונים משק בית לטעינת פקדים: 1) immunodetection מבוסס נוגדנים של להקות חלבון משק הבית הם לעתים קרובות רווי ולכן אי אפשר להבחין את הבדלי הטעינה בין הדגימות30; 2) רמת ביטוי חלבון משק הבית עשויה להשתנות בדגימות בתנאים ניסיוניים מסוימים , למשל, טיפול siRNA, מוות תאי, בידול תאים וכו'11,28,3,6,10,21. בשל חששות אלה, כתבי עת מדעיים דורשים כעת כי "להשוואות כמותיות, ריאגנטים מתאימים, פקדים ושיטות הדמיה עם טווחי אותות ליניאריים יש להשתמש" (הנחיות הטבע). באופן דומה, עורכי כתב העת של חקירה קלינית מבקשים פקדי טעינה אמינים יותר24. מסיבות אלה, חלבון משק בית צריך להיות מאומת על מנת לשמש בקרת טעינה. ראשית, יש לוודא שהוא נמדד בטווח הדינמי הליניארי של שיטת האימונודטיקציה14,29. שנית, יש לוודא שזה בא לידי ביטוי באופן עקבי בכל הדגימות26,31,25,19,20.
פתרון חלופי לבקרת טעינה אמינה הוא להשתמש במדידת חלבון כוללת מהכתם. כמה חוקרים הכתימו את הכתמים בכתמי חלבון כוללים, כגון קומאסי, פלמינגו פינק, סיפרו רובי, אמידו בלאק, פונסאו S וטכנולוגיה נטולת כתמים, כדי למדוד את אות החלבון הכולל בכל נתיב כבקרת טעינה16,20,13,27,1,4,12. בקרת טעינת החלבון הכוללת מונעת את החסרונות הקשורים לחלבוני משק בית. ראשית, זוהי השתקפות אמיתית של כמות החלבון טעון עבור כל מדגם. שנית, כתם החלבון הכולל מציג טווח דינמי ליניארי מעולה בטווח הטעינה המשותף לניתוח כתם מערבי (10-50 מיקרוגרם חלבון של ליזלת תא מורכבת) ומבדיל במדויק את הפרש הטעינה בין הדגימות12.
טכנולוגיה נטולת כתמים היא שיטת כתמי חלבון כוללת חדשנית שבה תרכובת ייחודית מעורבבת בתמיסת ג'ל אקרילאמיד ומופצת באופן שווה בג'ל יצוק. לאחר השלמת האלקטרופורזה, הג'ל נחשף לאור UV למשך דקה לפחות, כך שתרכובת הכתם מגיבה עם שאריות הטריפטופן בחלבון. החלבונים הופכים נרגשים תחת אור UV כדי לתת אות פלואורסצנטי חזק שניתן לדמיין ולכמת בתמונה מופעלת ללא כתמים כגון מערכת MP ChemiDoc. המתחם ללא כתמים עצמו, לעומת זאת, אינו סופג אור UV, וכתוצאה מכך רקע נמוך של תמונת הג'ל. השינוי של שאריות טריפטופן הוא בלתי הפיך וחלבונים ניתן לדמיין לא רק בג'ל, אלא גם על הכתם בכל עת לאחר העברת חלבון.
הטכנולוגיה נטולת הכתמים מיושמת בזרימת העבודה המערבית V3 (איור 1) כדי לטפל בתלונות העיקריות על זרימת העבודה המסורתית, במיוחד החששות משימוש בחלבוני משק בית כבקרות טעינה. באמצעות זרימת עבודה זו, אפשר: 1) להפעיל ג'ל בערך 20-30 דקות, 2) לבדוק את שלמות הדגימה ואת איכות הפרדת החלבון ב 5 דקות לאחר ריצת ג'ל; 3) להעביר חלבונים ב 3-10 דקות; 4) לבדוק את יעילות ההעברה כמותית; ו -5) והכי חשוב, לאמת שינויים ברמת החלבון של עניין באמצעות בקרת טעינת חלבון הכוללת.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>567-8093 </td>
 <td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4157 </td>
 <td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-5061</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Criterion Cell </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>165-6100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4155</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChemiDoc MP System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-8280</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

הכתם המערבי הוא טכניקת מעבדה שימושית מאוד מאומצת נרחב, אבל הביצוע שלה הוא מאתגר. זרימת העבודה מאופיינת לעתים קרובות כ"קופסה שחורה "מכיוון שניסוי אינו יודע אם היא בוצעה בהצלחה עד האחרון מבין מספר שלבים. יתר על כן, איכות הנתונים כתם המערבי הוא לפעמים מאותגר בשל היעדר כלי בקרת איכות יעילים במקום לאורך כל תהליך סופג המערבי. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה המערבית V3, אשר מיישמת טכנולוגיה ללא כתמים כדי לטפל בדאגות העיקריות הקשורות לפרוטוקול הכתם המערבי המסורתי. זרימת עבודה זו מאפשרת לחוקרים: 1) להפעיל ג'ל בכ 20-30 דקות; 2) כדי לדמיין את איכות ההפרדה מדגם בתוך 5 דקות לאחר ריצת הג'ל; 3) להעביר חלבונים ב 3-10 דקות; 4) כדי לאמת את יעילות ההעברה כמותית; והכי חשוב 5) כדי לאמת שינויים ברמת החלבון של עניין באמצעות בקרת טעינת חלבון הכוללת. גישה חדשנית זו מבטלת את הצורך בהפשטה ובשכפול של הכתם עבור חלבונים לניקיון הבית כגון β-אקטין, β-טובולין, GAPDH וכו 'זרימת העבודה נטולת הכתמים V3 הופכת את תהליך הכתם המערבי למהיר יותר, שקוף, כמותי ואמין יותר.

1. הערכת שלמות הדגימה, איכות הפרדת החלבון והעברת היעילות עם תמונות ג'ל ללא כתמים.
תמצית חלבון מתאי HeLa הופרדו ב 300 V במשך 20 דקות על קריטריון 18-well AnyKD TGX ג'ל ללא כתמים. דגימות החלבון היו טעון 3x בארבע כמויות שונות (נתיבים 1-3, 40 מיקרוגרם; נתיבים 4-6, 30 מיקרוגרם; נתיבים 7-9, 20 מיקרוגרם; נתיבים 10-12, 10 מיקרוגרם). הג'ל הופעל תחת אור UV במשך דקה. איור 2A מציג את תמונת הג'ל שנרכשה מיד לאחר הפרדת החלבון. תקינות דגימת חלבון(למשל השפלה) ואיכות ההפרדה(למשל משקעים בחלבון) ניתנות להערכה ויזואלית עם תמונת ג'ל זו. חלבונים הועברו לאחר מכן במשך 7 דקות לקרום nitrocellulose באמצעות טרנס-כתם טורבו. איור 2B מציג את התמונה נטולת הכתמים של הג'ל שלאחר ההעברה. שתי התמונות נרכשו באותו זמן חשיפה (6.8 שניות). נתיב 3 ו-12 נבחרו כדי למדוד את יעילות ההעברה. באמצעות כלי עוצמת הקול בתוכנת Image Lab, קופסה מלבנית (כחולה) נמשכה כדי לכסות את נתיב 3 ו -12 בשתי תמונות הג'ל. החישוב המבוסס על ערכי הנפח מתיבות אלה הצביע על כך שהיעילות בהעברה של שני הנתיבים הייתה 80%(איור 2C). בניסוי זה, ג'ל AnyKD TGX נבחר לחקור חלבוני יעד קטנים עד בינוניים והוא לא היה ממוטב להעברת חלבונים גדולים. אופטימיזציה של יעילות ההעברה תחייב שימוש בג'ל באחוזים נמוכים יותר(למשל 4-20%) ו/או התאמה של זמן ההעברה כדי להקל על העברת חלבונים גדולים. 2. בקרת טעינת חלבון כוללת נטולת כתמים היא חלופה אמינה לבקרת טעינת משק בית בכתימה המערבית כדי לכמת שינוי קטן ברמת החלבון המעניין.
MCM-7 הוא גורם שכפול רישוי DNA שרמתו יורדת ב -20-50% בקווי תאים לימפובלסטואידים (LCL) לאחר טיפול הקרנה. בניסוי זה, lysates (30 מיקרוגרם כל אחד) של ארבעה תרביות קו תאים לימפובלסטואידים שטופלו בקרה (LCL) הופרדו על 12-well קריטריון AnyKD TGX ללא כתמים ג'ל. הג'ל הופעל במשך דקה תחת אור UV והועבר על ידי טרנס-בלוט טורבו לקרום PVDF לכשל חיסוני. חלבון משק הבית GAPDH (ירוק) נבדק עם נוגדן ארנב (טכנולוגיית איתות תאים, ארה"ב, 1:2,500) ונוגדן עז נגד ארנב 549 מצומד (רוקלנד, ארה"ב, 1:20,000). החלבון של עניין MCM-7 (אדום) נבדק באמצעות נוגדן עכבר (Abcam, ארה"ב, 1:1,000) ו Dylight 649 מצומד עז נגד עכבר נוגדן (רוקלנד, 1:10,000).
איור 3A מציג תמונה פלואורסצנטית מרובת ערכים של סך כל החלבונים (כחול), MCM-7 (אדום) ו- GAPDH (ירוק) שזוהו בארבע דגימות LCL שטופלו בבקרה ובהקרנה. איור 3B הוא תמונה נטולת כתמים של אותו כתם המציגה את סך תבניות החלבון בכל דגימה (30 מיקרוגרם). תוכנת מעבדת תמונות בחרה את הנתיבים לדוגמה (תיבות כחולות) כדי למדוד MCM-7, GAPDH, ואת נפח החלבון הכולל בכל נתיב. רמות MCM-7 היו מנורמל או נגד מדידת חלבון הכולל ללא כתמים או נגד GAPDH. רמות החלבון המנורמלות של MCM-7 נותחו סטטיסטית ונפח רצועת החלבון הממוצעת MCM-7 וסטיית התקן (n=4) מוצגים בתרשים (איור 3C). שתי שיטות הנורמליזציה חשפו ירידה קטנה (כ-25%) ברמות החלבון MCM-7 לאחר טיפול הקרנה. הנתונים עם נורמליזציית החלבון הכוללת הציגו סטיית תקן קטנה יותר מזו עם GAPDH כבקרת הטעינה.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> איור 1. זרימת עבודה מערבית V3. זרימת העבודה של V3 מתוארת בעמודה הימנית ב- 4 שלבים. המכשירים העיקריים והריאגנטים המשמשים בזרימת העבודה מוצגים בכל שלב. הזמן המשוער עבור כל שלב כלול גם הוא. העמודה השמאלית מראה שניתן להפיק לפחות 4 תמונות בזרימת העבודה של V3. השימוש בכל פיסת נתונים מתואר. התמונות ללא כתמים של ג'ל pretransfer, ג'ל לאחר ההעברה, ואת הכתם (A, B, C) לא ניתן ליצור בקלות עם טכניקות סופג המערבי המסורתי; תמונות ונתונים אלה מספקים מידע חשוב ומחסומים לאורך ההליך כדי לשפר את השליטה של המדען ואת הרבייה של זרימת העבודה כתם המערבי. אותות חלבון היעד ניתן ללכוד או על תמונה כתם chemiluminescent (D) אם נוגדן משני HRP מצומד הוחל בזיהוי או על תמונה כתם פלואורסצנטי (E) אם כתמים פלואורסצנטיים פלואורסצנטיים מרובים בוצעו כדי לזהות יותר מחלבון יעד אחד בו זמנית על אותו כתם. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> איור 2. תמונות ללא כתמים של ג'לים לפני טרנזיור ולאחר העברה בזרימת העבודה המערבית V3 כדי להעריך את שלמות הדגימה, איכות ההפרדה ויעילות ההעברה. (A)תמונה נטולת כתמים של ג'ל טרום טרנזינר. (B)תמונה נטולת כתמים לאחר ההעברה. (C)מדידת יעילות העברת חלבונים.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> איור 3. השוואת מדידת חלבון כוללת נטולת כתמים ל- GAPDH כשליטת טעינה כדי לנרמל את רמת החלבון המעניין. (A) תמונת כתם מערבי פלואורסצנטי. (B)תמונה כתם ללא כתמים. (C)רמות חלבון מנורמלות MCM-7. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting at JoVE.com

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

זרימת עבודה V3 היא הליך כתם מערבי באמצעות ג'לים ללא כתמים. הטכנולוגיה נטולת הכתמים מאפשרת לחוקרים לדמיין את איכות הפרדת החלבון, לאמת את יעילות ההעברה, והכי חשוב, לאמת את השינוי בחלבון המעניין באמצעות כימות חלבונים כולל כבקרת טעינה אמינה.

זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K Views.  Bio-Rad Laboratories. זרימת עבודה V3 היא הליך כתם מערבי באמצעות ג'לים ללא כתמים. הטכנולוגיה נטולת הכתמים מאפשרת לחוקרים לדמיין את איכות הפרדת החלבון, לאמת את יעילות ההעברה, והכי חשוב, לאמת את השינוי בחלבון המעניין באמצעות כימות חלבונים כולל כבקרת טעינה אמינה.

Video: V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to elaborate distinct aspects of motor function and to determine even subtle loss of movement capacity. To enhance efficacy and resolution of testing, tests should permit qualitative and quantitative measures of motor function and be sensitive to changes in performance during recovery periods. The present study describes a new task to assess skilled walking in the rat to measure both forelimb and hindlimb function at the same time. Animals are required to walk along a horizontal ladder on which the spacing of the rungs is variable and is periodically changed. Changes in rung spacing prevent animals from learning the absolute and relative location of the rungs and so minimize the ability of the animals to compensate for impairments through learning. In addition, changing the spacing between the rungs allows the test to be used repeatedly in long-term studies. Methods are described for both quantitative and qualitative description of both fore- and hindlimb performance, including limb placing, stepping, co-ordination. Furthermore, use of compensatory strategies is indicated by missteps or compensatory steps in response to another limb&#x2019;s misplacement. 

The ladder rung walking task is a new test to assess skilled walking and measure both forelimb and hindlimb placing, stepping, and inter-limb co-ordination.

שלב בסולם הליכה משימה: שיטת הניקוד ואת היישום המעשי שלה.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

טיפול קבוע ותחזוקה של דג זברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) מעבדה: מבוא

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

מדריך מעשי לphylogenetics לNonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...