המחברים מודים לד"ר וולף-דיטר סטאלס, ד"ר ארנו רמי, ד"ר אנטון פוש, ד"ר פטרישיה פיאטי, טום דייויס, קריס סימוני וג'ף דרבן על הביקורת והעריכה של כתב היד. המחברים מודים גם לאליסון שוורץ על התמיכה הטכנית.

1. הכנת דגימת חלבון
(מתואר הליך אופייני להפקת חלבונים מתרבית התאים)
<ol><li>מניחים את צלחת תרבות התא HeLa בקרח ולשטוף את התאים עם מלח קר כקרח Tris-אגירה (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>לשאוף את TBS, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר לכל 100 מ"מ צלחת קר כקרח מאגר RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% SDS) בתוספת מעכבי פוספטאז ופרוטה.</li>
	<li>לגרד תאים חסידים את המנה באמצעות מגרד תא פלסטיק קר; מעבירים בעדינות את השעיית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה מקולק מראש.</li>
	<li>לשמור על תסיסה מתמדת במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס על מסובב.</li>
	<li>ספין ב 16,000 x גרם במשך 20 דקות בצנטריפוגה 4 °C (60 °F).</li>
	<li>מוציאים בעדינות את הצינור מהצנטריפוגה ומניחים על הקרח. מעבירים את הסופרנט לצינור טרי שנשמרו על קרח, וזורקים את הכדור.</li>
	<li>הסר נפח קטן (10-20 μl) של lysate לבצע בדיקה חלבון. קבעו את ריכוז החלבון עבור כל דגימה באמצעות ערכת מבחני RC DC.</li>
	<li>במידת הצורך, יש לאסוף את דגימות החלבון לאחסון לטווח ארוך ב-20°C(20°C). מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים גורמים להשפלת חלבונים ויש להימנע מהם.</li>
	<li>קח בערך 20 מיקרוגרם של כל מדגם, להוסיף נפח שווה של 2x Laemmli מאגר מדגם (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% גליצרול, 0.004% כחול ברומופנול, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8).</li>
	<li>מחממים כל תא lysate במאגר מדגם ב 95 °C (70 °F) במשך 5 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 16,000 x g במיקרוצנטריפוגה במשך דקה.</li>
</ol>2. ג'ל אלקטרופורזה עם ג'לים ללא כתמים (~ 30 דקות)
<ol><li>קח קריטריון TGX כל ג'ל precast ללא כתמים KD (ג'ל בפורמט midi), להסיר את המסרק ואת הקלטת מתחתית הקלטת.</li>
	<li>הנח את הקלטת בתא הקריטריון ומלא את תא החיץ העליון המשולב במאגר פועל של 60 מ"ל (25 מטר טריס, גליצין 190 מ"מ, 0.1% SDS, pH 8.3). יש לשטוף את הבארות באמצעות חיץ פועל.</li>
	<li>מלא כל מחצית ממיכל החיץ התחתון במאגר פועל של 400 מ"ל לקו המילוי המסומן.</li>
	<li>טען את דגימות החלבון ואת סמני החלבון המתאימים.</li>
	<li>מניחים את המכסה על המיכל, מיישרים את תקעי הבננה המקודדים בצבע עם שקעים מתאימים על המכסה.</li>
	<li>הפעל את הג'ל במשך ~ 30 דקות ב 200 V או 20 דקות ב 300 V.</li>
</ol>3. הדמיית ג'ל ללא כתמים באמצעות מערכת MP Chemidoc לבדיקת איכות הפרדת חלבונים (~ 5 דקות)
<ol><li>הסר את קלטת הג'ל מהתא. השתמש בכלי פתיחת קלטת הג'ל במכסה תא הקריטריון כדי לפצח את הקלטת ולשחרר את הג'ל.</li>
	<li>החל כמה מיליליטרים של מים למרכז מגש מדגם UV של הדמיה MP ChemiDoc. בזהירות להרים את הג'ל מהקלטת ומניחים אותו על המגש.</li>
	<li>הפעל את תוכנת Image Lab ולכוד את תמונת הג'ל נטולת הכתמים (איור 1A) עם ההגדרות הבאות: יישום: ג'ל ללא כתמים זמן הפעלת ג'ל: דקה אחת אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר</li>
	<li>מוציאים את הג'ל מהמגש לדוגמה וממשיכים מיד לשלב ההעברה.</li>
</ol>4. העברת חלבון עם מערכת טורבו טרנס-כתם (~ 10 דקות)
<ol><li>פתח חבילת העברה טרנס-כתם טורבו מידי PVDF; מניחים את הערימה התחתונה (הכוללת את הממברנה) על בסיס קלטת ההעברה.</li>
	<li>מניחים את הג'ל על גבי הממברנה, מניחים את הערימה העליונה על הג'ל, ומרדים בועות.</li>
	<li>הנח את המכסה על בסיס הקלטת וסובב את החוגה כדי לנעול אותה.</li>
	<li>הכנס את הקלטת לתא הגוש.</li>
	<li>התחל את ההעברה על-ידי בחירת תוכנית טורבו מוגדרת מראש ובחירת גודל ג'ל הקריטריון (midi) ולאחר מכן הקש RUN. ריצה טיפוסית אורכת רק 7 דקות.</li>
	<li>כאשר ההעברה נגמרת, לפרק את כריך סופג ומניחים הן את הכתם ואת הג'ל במיכל עם מים deionized.</li>
</ol>5. ג'ל ללא כתמים והדמיית כתמים באמצעות מערכת MP Chemidoc לבדיקת יעילות ואיכות העברת חלבונים (~ 5 דקות)
<ol><li>מניחים את הג'ל שלאחר ההעברה על מגש הדגימה של הדמיה ChemiDoc MP.</li>
	<li>הפעל את תוכנת Image Lab ולכוד את התמונה נטולת הכתמים של הג'ל שלאחר ההעברה (איור 1B) עם ההגדרות הבאות: יישום: ג'ל ללא כתמים זמן הפעלת ג'ל: ללא אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: זהה לזמן החשיפה לתמונת הג'ל שלפני ההזעה</li>
	<li>הסר את הג'ל מהמגש לדוגמה ולאחר מכן תמונה של הכתם (איור 1C) עם ההגדרות הבאות. שמור על הכתם רטוב עם כמה טיפות מים או TBST בעת הדמיה. יישום: כתם ללא כתמים אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר</li>
	<li>הסר את קרום סופג ממגש המדגם ומניחים אותו במיכל עם TBST (0.1% Tween 20 ב- TBS).</li>
</ol>6. דגירת נוגדנים
<ol><li>חסום על ידי הצבת הכתם בתמיסה של 3% אלבומין סרום שור (BSA) ב TBST בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה.</li>
	<li>דגירה הכתם לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתמיסה המכילה נוגדן ראשוני העכבר הרים נגד חלבון היעד הראשון נוגדן ראשי ארנב הרים נגד חלבון היעד השני.</li>
	<li>יוצקים את הפתרון המכיל את הנוגדן העיקרי. לאחר מכן, לשטוף את הכתם על ידי נסער ב 20 מ"ל של TBST במשך 5 דקות. חזור על 4x עבור סך של 5 שוטף.</li>
	<li>דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר בתמיסת הנוגדנים המשנית המכילה נוגדן עז נגד עכבר Dylight 650 מצומד ונוגדן עז נגד עכבר Dylight 549 מצומד עז נגד ארנב.</li>
	<li>יוצקים את הפתרון המכיל את הנוגדן העיקרי. לאחר מכן, לשטוף את הכתם על ידי נסער ב 20 מ"ל של TBST במשך 5 דקות. חזור על 4x עבור סך של 5 שוטף.</li>
</ol>7. הדמיה וניתוח נתונים על ידי תוכנת מעבדת תמונה- נורמליזציה כוללת של חלבונים (~ 5 דקות)
<ol><li>השג תמונה פלואורסצנטית מרובת ערכים של הכתם (איור 1E) על-ידי פתיחת פרוטוקול רב-ערוצי חדש, קביעת תצורה של שלושה ערוצי פלואורסצנט והפעלת הפרוטוקול. ערוץ 1: יישום: כתמים Dylight 650 אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר ערוץ 2: יישום: כתם דילייט 549 אזור הדמיה: ג'ל קריטריון זמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר ערוץ 3: יישום: כתם ללא כתמים אזור הדמיה: זמן חשיפה לתמונת ג'ל קריטריון: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר</li>
	<li>לחץ על סמל נורמליזציה מתיבת כלי הניתוח ולחץ על כן כדי לזהות נתיבים ורצועות.</li>
	<li>בחר והשתמש ב"כלים של נתיבים ולהקות" כדי לבצע התאמות לנתיבים וללהקות במידת הצורך.</li>
	<li>בחרו תמונה נטולת כתמים כערוץ הנורמליזציה.</li>
	<li>בחר כלי ניתוח MW והקצה את הנתיבים הסטנדרטיים של MW על-ידי סימון התיבות שמתחתיהם.</li>
	<li>כדי להציג את אמצעי האחסון המנורמלים, לחץ על טבלת הניתוח בסרגל הכלים. כל החישובים יבוצעו באופן אוטומטי על-ידי התוכנה, כולל פקטור הנורמליזציה ואמצעי אחסון מנורמלים. ערכי עוצמת רצועת החלבון המשמשים כיעד מותאמים כעת לשינויים בעומס החלבון. זה יאפשר השוואות מדויקות של חלבוני היעד בין הדגימות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2++signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle.">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li><li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li><li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+human+skeletal+muscle+fibers.">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li><li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney.">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+proteins:+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies.">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+genes;+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells.">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li><li>G&#252;rtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis.">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li><li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis.">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li><li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage.">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li><li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta:+general+protein+stains+are+the+benchmark.">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li><li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+temperature,+oxidative+stress,+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers.">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li><li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY&#913;A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian.">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRY&#913;A Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li><li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting.">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats.">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li><li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+of+troponin+I+(fast)+increases+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans.">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li><li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li><li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+Data+are+not+created+Equal.">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li><li>P&#233;rez-P&#233;rez, R., L&#243;pez, J. A., Garc&#237;a-Santos, E., Camafeita, E., G&#243;mez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fern&#225;ndez-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity.">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls:+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development.">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Romero-Calvo, I., Oc&#243;n, B., Mart&#237;nez-Moya, P., Su&#225;rez, M. D., Zarzuelo, A., Mart&#237;nez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots.">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li><li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro.">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li><li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li><li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins:+application+to+corneal+disease.">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li></ol>

המחברים, אנטון פוש, ג'ונתן קון, קנת הו, מאט האמונד ונינג ליו הם עובדים של מעבדות ביו-ראד בע"מ.

פרוטוקול V3 ללא כתמים המתואר לעיל הוא עבור כתמים מערביים פלואורסצנטיים מולטיפלקסים. זה יכול להיות מיושם גם סופג המערבי באמצעות זיהוי chemiluminescent. בפרוטוקול הכתם המערבי הפלואורסצנטי מולטיפלקס, התמונות כתם ללא כתמים נרכשים בשתי נקודות זמן: 1) מיד לאחר העברת חלבון; 2) בשלב הדמיה פלואורסצנטית מולטיפלקס לאחר דגירה נוגדן. התמונה הראשונה ללא כתמים משמשת לחישוב יעילות ההעברה והתמונה השנייה נטולת הכתמים משמשת כבקרת הטעינה. כאשר השיטה chemiluminescent מוחל, לא ניתן לקחת תמונה מולטיפלקס עבור אותות חלבון ללא כתמים ויעד, כי האות chemiluminescent יופיע בערוץ ללא כתמים מדי. במקרה זה, אנו ממליצים להשתמש בתמונה נטולת כתמים שצולמה מיד לאחר שלב העברת החלבון לניתוח בקרת טעינה ונורמליזציה.
זרימת העבודה המערבית V3 מספקת את היתרונות הייחודיים הבאים בהשוואה לזרימת העבודה המסורתית של כתמים מערביים המשתמשת בחלבוני משק בית כפקדי טעינה:
ראשית, זרימת העבודה של V3 מספקת בקרת טעינה מעשית, נוחה ואמינה יותר כדי לאמת את השינויים ברמת החלבון המעניין. פרוטוקול V3 משתמש בבקרת טעינת חלבונים כוללת כדי לנרמל את רמת החלבון המעניין הנמדדת בכל דגימה. היא מונעת שתי מלכודות של שימוש בחלבוני משק הבית כבקרות טעינה: כשל חיסוני רווי ורמות ביטוי חלבון משק בית לא עקביות בין הדגימות בתנאים ניסיוניים מסוימים. צעדי הפשטה ותדלוק עם נוגדנים המכוונים נגד משק בית אינם נחוצים עוד. באמצעות טכנולוגיה נטולת כתמים, אין צורך להכתים ולהכתים כתם עם כתמים כגון קומאסי או Sypro Ruby למדידת חלבון כוללת. זה לוקח רק כמה שניות כדי לרכוש תמונה כתם על 5 דקות לעשות נורמליזציה חלבון הכולל באמצעות תוכנת Image Lab.
שנית, זרימת העבודה V3 מאפשרת למדענים לקחת שליטה טובה יותר על ההליך המערבי כי זה עושה את ההליך שקוף יותר ומציג מספר מחסומים לבקרת איכות. בעזרת טכנולוגיה נטולת כתמים, החוקרים יכולים לדמיין את דגימות החלבון שלהם הן על הג'ל והן על הכתם. מדענים יכולים להעריך את שלמות דגימת החלבון (מושפלת או לא), איכות ההפרדה (מזורזת או לא), יעילות העברה ואיכות העברה (אפילו העברה או לא). נקודות ביקורת אלה מסייעות למחקרים לסיים את הניסוי כאשר רואים פגמים גדולים בתהליך ולהימנע מבזבוז זמן על דגימות וכתמים ירודים. טכנולוגיה זו גם מסייעת למדענים להעריך אם יש כמות משמעותית של אובדן חלבון לאחר הפשטת קרום והאם הכתם מתאים לתוכחת מטרה אחרת 4.
להלן כמה עצות להבטחת ניסיון טוב ונתונים איכותיים באמצעות זרימת עבודה מערבית של V3.
<ol><li>תמונה ג'ל מיד לאחר ריצת ג'ל. אין להשרות את הג'ל בכל חיץ לפני ההדמיה הראשונה בהליך מכיוון שהוא עלול לשטוף את תרכובת הכתם.</li>
	<li>השתמש באותו אזור דימות כדי להשיג את כל התמונות בפרוטוקול. זה יאפשר לתוכנה לכסות תמונות לניתוח נתונים כגון נורמליזציה מוחלטת של חלבונים.</li>
	<li>שמור על זמן החשיפה עקבי בעת הדמיה של ג'לים לפני טרנזיור ולאחר העברה. פעולה זו תאפשר לתוכנה למדוד כמותית את יעילות ההעברה.</li>
	<li>שמור על הממברנה רטובה עם כמה טיפות מים או TBST בעת רכישת התמונה כתם. זה ימנע בעיות רקע מלוכלכות אפשריות לגילוי חלבון היעד.</li>
	<li>השתמש קרום PVDF פלואורסצנטי נמוך עבור כתמים פלואורסצנטיים פלואורסצנטיים מרובים.</li>
</ol>חשוב לציין כי מולקולה ללא כתמים לאחר הפעלת UV קשורה באופן בלתי הפיך לשאריות טריפטופן. שינוי בלתי הפיך זה עלול להשפיע על זיהוי אנטיגן בעת שימוש בנוגדנים חד שבטיים אם האפיטופ מכיל טריפטופן. נוגדנים פוליקלונליים לא צפויים להיות מושפעים כי הם מזהים אפיטופים מרובים על האנטיגן. מולקולות נטולות כתמים לא מאוגדות נשטפות בקלות מהג'ל והממברנה ולכן לא יפריעו לאינטראקציות נוגדנים-אנטיגן.
לסיכום, זרימת העבודה המערבית V3 הופכת את תהליך הכתם המערבי למהיר יותר, שקוף יותר, כמותי ואמין יותר. חוקרים יכולים כעת ליישם בקלות בקרת טעינת חלבון מוחלטת בניסוי כתם מערבי כדי להפוך את הנתונים שלהם למהימנים יותר. זרימת העבודה ללא כתמים V3 אומצה על ידי מספר מעבדות, ופרסומיהם הוכיחו כי כתבי עת מקבלים נתונים ללא כתמים כבקרת טעינה בכתם המערבי22,17,7,8,5,23,18,15.

כתם מערבי הוא טכניקה שימושית מאוד9, עם זאת, ישנם שני אתגרים עיקריים עם סופג המערבי: תהליך ארוך עבודה אינטנסיבי ואיכות הנתונים. פרוטוקול מסורתי דורש בערך יומיים. זה כרוך בצעדים רבים כולל הכנת מדגם, יציקת ג'ל, אלקטרופורזה חלבון והעברה, חסימת קרום ואחריו דגירה נוגדנים, הדמיה, ולעתים קרובות למדי הפשטה, תוכחה, ולבסוף ניתוח נתונים. לאורך כל התהליך הזה, אין כלים אמינים וגמישים לבקרת תהליכים. ככזה, שגיאות ניתן להציג בכל שלב, ושגיאות אלה יש פוטנציאל ליצור חפצי נתונים; לכן, טעינת פקדים חיוניים בנפח המערבי כדי לזהות ולתקן את השגיאות. בקרת הטעינה נעשית בדרך כלל על ידי בדיקת רמת החלבון של חלבון ייחוס בכל מדגם כדי לראות אם הוא מוצג באותה מידה. אנשים משתמשים לעתים קרובות בחלבונים של משק בית, כגון β-אקטין, β-טובולין, GAPDH, כבקרת טעינה.
איכות נתוני הכתמים המערביים תלויה בבקרת טעינה אמינה. אבל יש שני חששות לגיטימיים בעת שימוש בחלבונים משק בית לטעינת פקדים: 1) immunodetection מבוסס נוגדנים של להקות חלבון משק הבית הם לעתים קרובות רווי ולכן אי אפשר להבחין את הבדלי הטעינה בין הדגימות30; 2) רמת ביטוי חלבון משק הבית עשויה להשתנות בדגימות בתנאים ניסיוניים מסוימים , למשל, טיפול siRNA, מוות תאי, בידול תאים וכו'11,28,3,6,10,21. בשל חששות אלה, כתבי עת מדעיים דורשים כעת כי "להשוואות כמותיות, ריאגנטים מתאימים, פקדים ושיטות הדמיה עם טווחי אותות ליניאריים יש להשתמש" (הנחיות הטבע). באופן דומה, עורכי כתב העת של חקירה קלינית מבקשים פקדי טעינה אמינים יותר24. מסיבות אלה, חלבון משק בית צריך להיות מאומת על מנת לשמש בקרת טעינה. ראשית, יש לוודא שהוא נמדד בטווח הדינמי הליניארי של שיטת האימונודטיקציה14,29. שנית, יש לוודא שזה בא לידי ביטוי באופן עקבי בכל הדגימות26,31,25,19,20.
פתרון חלופי לבקרת טעינה אמינה הוא להשתמש במדידת חלבון כוללת מהכתם. כמה חוקרים הכתימו את הכתמים בכתמי חלבון כוללים, כגון קומאסי, פלמינגו פינק, סיפרו רובי, אמידו בלאק, פונסאו S וטכנולוגיה נטולת כתמים, כדי למדוד את אות החלבון הכולל בכל נתיב כבקרת טעינה16,20,13,27,1,4,12. בקרת טעינת החלבון הכוללת מונעת את החסרונות הקשורים לחלבוני משק בית. ראשית, זוהי השתקפות אמיתית של כמות החלבון טעון עבור כל מדגם. שנית, כתם החלבון הכולל מציג טווח דינמי ליניארי מעולה בטווח הטעינה המשותף לניתוח כתם מערבי (10-50 מיקרוגרם חלבון של ליזלת תא מורכבת) ומבדיל במדויק את הפרש הטעינה בין הדגימות12.
טכנולוגיה נטולת כתמים היא שיטת כתמי חלבון כוללת חדשנית שבה תרכובת ייחודית מעורבבת בתמיסת ג'ל אקרילאמיד ומופצת באופן שווה בג'ל יצוק. לאחר השלמת האלקטרופורזה, הג'ל נחשף לאור UV למשך דקה לפחות, כך שתרכובת הכתם מגיבה עם שאריות הטריפטופן בחלבון. החלבונים הופכים נרגשים תחת אור UV כדי לתת אות פלואורסצנטי חזק שניתן לדמיין ולכמת בתמונה מופעלת ללא כתמים כגון מערכת MP ChemiDoc. המתחם ללא כתמים עצמו, לעומת זאת, אינו סופג אור UV, וכתוצאה מכך רקע נמוך של תמונת הג'ל. השינוי של שאריות טריפטופן הוא בלתי הפיך וחלבונים ניתן לדמיין לא רק בג'ל, אלא גם על הכתם בכל עת לאחר העברת חלבון.
הטכנולוגיה נטולת הכתמים מיושמת בזרימת העבודה המערבית V3 (איור 1) כדי לטפל בתלונות העיקריות על זרימת העבודה המסורתית, במיוחד החששות משימוש בחלבוני משק בית כבקרות טעינה. באמצעות זרימת עבודה זו, אפשר: 1) להפעיל ג'ל בערך 20-30 דקות, 2) לבדוק את שלמות הדגימה ואת איכות הפרדת החלבון ב 5 דקות לאחר ריצת ג'ל; 3) להעביר חלבונים ב 3-10 דקות; 4) לבדוק את יעילות ההעברה כמותית; ו -5) והכי חשוב, לאמת שינויים ברמת החלבון של עניין באמצעות בקרת טעינת חלבון הכוללת.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>&lt;strong&gt;567-8093&lt;/strong&gt;</td><td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td><td>Bio-Rad</td><td>&lt;strong&gt;170-4157&lt;/strong&gt;</td><td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Criterion Cell </td><td>Bio-Rad</td><td>165-6100</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-4155</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-8280</td><td></td></tr></tbody></table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

הכתם המערבי הוא טכניקת מעבדה שימושית מאוד מאומצת נרחב, אבל הביצוע שלה הוא מאתגר. זרימת העבודה מאופיינת לעתים קרובות כ"קופסה שחורה "מכיוון שניסוי אינו יודע אם היא בוצעה בהצלחה עד האחרון מבין מספר שלבים. יתר על כן, איכות הנתונים כתם המערבי הוא לפעמים מאותגר בשל היעדר כלי בקרת איכות יעילים במקום לאורך כל תהליך סופג המערבי. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה המערבית V3, אשר מיישמת טכנולוגיה ללא כתמים כדי לטפל בדאגות העיקריות הקשורות לפרוטוקול הכתם המערבי המסורתי. זרימת עבודה זו מאפשרת לחוקרים: 1) להפעיל ג'ל בכ 20-30 דקות; 2) כדי לדמיין את איכות ההפרדה מדגם בתוך 5 דקות לאחר ריצת הג'ל; 3) להעביר חלבונים ב 3-10 דקות; 4) כדי לאמת את יעילות ההעברה כמותית; והכי חשוב 5) כדי לאמת שינויים ברמת החלבון של עניין באמצעות בקרת טעינת חלבון הכוללת. גישה חדשנית זו מבטלת את הצורך בהפשטה ובשכפול של הכתם עבור חלבונים לניקיון הבית כגון β-אקטין, β-טובולין, GAPDH וכו 'זרימת העבודה נטולת הכתמים V3 הופכת את תהליך הכתם המערבי למהיר יותר, שקוף, כמותי ואמין יותר.

1. הערכת שלמות הדגימה, איכות הפרדת החלבון והעברת היעילות עם תמונות ג'ל ללא כתמים.
תמצית חלבון מתאי HeLa הופרדו ב 300 V במשך 20 דקות על קריטריון 18-well AnyKD TGX ג'ל ללא כתמים. דגימות החלבון היו טעון 3x בארבע כמויות שונות (נתיבים 1-3, 40 מיקרוגרם; נתיבים 4-6, 30 מיקרוגרם; נתיבים 7-9, 20 מיקרוגרם; נתיבים 10-12, 10 מיקרוגרם). הג'ל הופעל תחת אור UV במשך דקה. איור 2A מציג את תמונת הג'ל שנרכשה מיד לאחר הפרדת החלבון. תקינות דגימת חלבון(למשל השפלה) ואיכות ההפרדה(למשל משקעים בחלבון) ניתנות להערכה ויזואלית עם תמונת ג'ל זו. חלבונים הועברו לאחר מכן במשך 7 דקות לקרום nitrocellulose באמצעות טרנס-כתם טורבו. איור 2B מציג את התמונה נטולת הכתמים של הג'ל שלאחר ההעברה. שתי התמונות נרכשו באותו זמן חשיפה (6.8 שניות). נתיב 3 ו-12 נבחרו כדי למדוד את יעילות ההעברה. באמצעות כלי עוצמת הקול בתוכנת Image Lab, קופסה מלבנית (כחולה) נמשכה כדי לכסות את נתיב 3 ו -12 בשתי תמונות הג'ל. החישוב המבוסס על ערכי הנפח מתיבות אלה הצביע על כך שהיעילות בהעברה של שני הנתיבים הייתה 80%(איור 2C). בניסוי זה, ג'ל AnyKD TGX נבחר לחקור חלבוני יעד קטנים עד בינוניים והוא לא היה ממוטב להעברת חלבונים גדולים. אופטימיזציה של יעילות ההעברה תחייב שימוש בג'ל באחוזים נמוכים יותר(למשל 4-20%) ו/או התאמה של זמן ההעברה כדי להקל על העברת חלבונים גדולים. 2. בקרת טעינת חלבון כוללת נטולת כתמים היא חלופה אמינה לבקרת טעינת משק בית בכתימה המערבית כדי לכמת שינוי קטן ברמת החלבון המעניין.
MCM-7 הוא גורם שכפול רישוי DNA שרמתו יורדת ב -20-50% בקווי תאים לימפובלסטואידים (LCL) לאחר טיפול הקרנה. בניסוי זה, lysates (30 מיקרוגרם כל אחד) של ארבעה תרביות קו תאים לימפובלסטואידים שטופלו בקרה (LCL) הופרדו על 12-well קריטריון AnyKD TGX ללא כתמים ג'ל. הג'ל הופעל במשך דקה תחת אור UV והועבר על ידי טרנס-בלוט טורבו לקרום PVDF לכשל חיסוני. חלבון משק הבית GAPDH (ירוק) נבדק עם נוגדן ארנב (טכנולוגיית איתות תאים, ארה"ב, 1:2,500) ונוגדן עז נגד ארנב 549 מצומד (רוקלנד, ארה"ב, 1:20,000). החלבון של עניין MCM-7 (אדום) נבדק באמצעות נוגדן עכבר (Abcam, ארה"ב, 1:1,000) ו Dylight 649 מצומד עז נגד עכבר נוגדן (רוקלנד, 1:10,000).
איור 3A מציג תמונה פלואורסצנטית מרובת ערכים של סך כל החלבונים (כחול), MCM-7 (אדום) ו- GAPDH (ירוק) שזוהו בארבע דגימות LCL שטופלו בבקרה ובהקרנה. איור 3B הוא תמונה נטולת כתמים של אותו כתם המציגה את סך תבניות החלבון בכל דגימה (30 מיקרוגרם). תוכנת מעבדת תמונות בחרה את הנתיבים לדוגמה (תיבות כחולות) כדי למדוד MCM-7, GAPDH, ואת נפח החלבון הכולל בכל נתיב. רמות MCM-7 היו מנורמל או נגד מדידת חלבון הכולל ללא כתמים או נגד GAPDH. רמות החלבון המנורמלות של MCM-7 נותחו סטטיסטית ונפח רצועת החלבון הממוצעת MCM-7 וסטיית התקן (n=4) מוצגים בתרשים (איור 3C). שתי שיטות הנורמליזציה חשפו ירידה קטנה (כ-25%) ברמות החלבון MCM-7 לאחר טיפול הקרנה. הנתונים עם נורמליזציית החלבון הכוללת הציגו סטיית תקן קטנה יותר מזו עם GAPDH כבקרת הטעינה.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> איור 1. זרימת עבודה מערבית V3. זרימת העבודה של V3 מתוארת בעמודה הימנית ב- 4 שלבים. המכשירים העיקריים והריאגנטים המשמשים בזרימת העבודה מוצגים בכל שלב. הזמן המשוער עבור כל שלב כלול גם הוא. העמודה השמאלית מראה שניתן להפיק לפחות 4 תמונות בזרימת העבודה של V3. השימוש בכל פיסת נתונים מתואר. התמונות ללא כתמים של ג'ל pretransfer, ג'ל לאחר ההעברה, ואת הכתם (A, B, C) לא ניתן ליצור בקלות עם טכניקות סופג המערבי המסורתי; תמונות ונתונים אלה מספקים מידע חשוב ומחסומים לאורך ההליך כדי לשפר את השליטה של המדען ואת הרבייה של זרימת העבודה כתם המערבי. אותות חלבון היעד ניתן ללכוד או על תמונה כתם chemiluminescent (D) אם נוגדן משני HRP מצומד הוחל בזיהוי או על תמונה כתם פלואורסצנטי (E) אם כתמים פלואורסצנטיים פלואורסצנטיים מרובים בוצעו כדי לזהות יותר מחלבון יעד אחד בו זמנית על אותו כתם. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> איור 2. תמונות ללא כתמים של ג'לים לפני טרנזיור ולאחר העברה בזרימת העבודה המערבית V3 כדי להעריך את שלמות הדגימה, איכות ההפרדה ויעילות ההעברה. (A)תמונה נטולת כתמים של ג'ל טרום טרנזינר. (B)תמונה נטולת כתמים לאחר ההעברה. (C)מדידת יעילות העברת חלבונים.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> איור 3. השוואת מדידת חלבון כוללת נטולת כתמים ל- GAPDH כשליטת טעינה כדי לנרמל את רמת החלבון המעניין. (A) תמונת כתם מערבי פלואורסצנטי. (B)תמונה כתם ללא כתמים. (C)רמות חלבון מנורמלות MCM-7. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting at JoVE.com

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

זרימת עבודה V3 היא הליך כתם מערבי באמצעות ג'לים ללא כתמים. הטכנולוגיה נטולת הכתמים מאפשרת לחוקרים לדמיין את איכות הפרדת החלבון, לאמת את יעילות ההעברה, והכי חשוב, לאמת את השינוי בחלבון המעניין באמצעות כימות חלבונים כולל כבקרת טעינה אמינה.

זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

22.5K Views.  Bio-Rad Laboratories. זרימת עבודה V3 היא הליך כתם מערבי באמצעות ג'לים ללא כתמים. הטכנולוגיה נטולת הכתמים מאפשרת לחוקרים לדמיין את איכות הפרדת החלבון, לאמת את יעילות ההעברה, והכי חשוב, לאמת את השינוי בחלבון המעניין באמצעות כימות חלבונים כולל כבקרת טעינה אמינה.

Video: V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Biochemistry

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1 
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunoprecipitation (IP, also known as a &#39;pull-down&#39; assay) is a widely used technique that has applications in a variety of fields. First conceived in 1984, it was refined in 1988 (1, 2). The fundamental goal of IP is purification and isolation of a specific protein using an antibody against that protein. The word &#34;immuno&#34; refers to the use of an antibody while the word &#34;precipitation&#34; refers to pulling down a specific substance from a solution. The target protein might be endogenous or recombinant. Most recombinant proteins have an epitope tag (i.e. myc or flag) attached to them to simplify subsequent purification. Typically, it is easier to optimize recombinant protein IP because the antibodies against recombinant epitope tags are very strong and effective. Antibodies against endogenous proteins have extremely variable efficacy - making it much more difficult to optimize these IPs. A necessary step after immunoprecipitation is verification of purification. The isolated protein is resolved using SDS-PAGE and subsequently probed for purity by western blots (Figure 1). An important control is the use of a different antibody during the Western blot to verify pull down of the correct protein. The combination of IP with subsequent techniques is a powerful analysis tool. The goal after purification may be characterization of the protein itself by NMR, mass spectrometry, and in vitro assays, or analysis of the protein&#39;s interacting partners (i.e. protein, DNA, RNA) (3, 4, 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10502/10502fig1.jpg" /> 
Figure 1: Overview of Immunoprecipitation Procedure. Immunoprecipitation is the isolation of a specific protein using an antibody. After production of lysate from cells, there are two major steps- pre-clearing and pull down. During pre-clearing step, the cell-lysates are pre-cleared of proteins that bind to antibodies non-specifically using an isotype control antibody. In pull down step, the target protein is pulled down using a protein-specific antibody. The isolated protein is then analyzed by Western blot. Isotype antibodies and protein specific antibodies have the same constant domain, but different antigen binding domains. A key component of this protocol is Protein A/G agarose beads that bind the constant domain of antibodies- allowing immunoprecipitation of the target protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10502/10502fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Antibodies are the key component of an immunoprecipitation that differentiate it from other forms of protein purification (i.e. nickel affinity column purification). Antibodies are molecules made by B cells that can recognize specific protein epitopes. Antibodies have two domains: constant (Fc) and antigen binding (Fab) (Figure 1). The constant domain identifies the type of antibody and dictates function in vivo. Usually, the constant domains of antibodies used for IP are mouse, rat, or rabbit IgG. The antigen binding portion of the antibody recognizes a specific epitope of a specific protein. Antibodies can recognize epitopes on folded proteins that may not exist when the protein is denatured and vice versa. Therefore, the availability of the epitope depends on protein folding - identifying an important factor to consider when choosing antibodies and conditions for IP.
Both prokaryotic and eukaryotic systems have antibody-binding proteins. In eukaryotic systems, the purpose is immune protection from bacteria while in prokaryotic systems, the purpose is protection from the immune system. Antibody-binding proteins affect IP methodology in two ways. First, there is a necessary pre-clearing step (Figure 1) to rid the lysate of proteins that bind antibodies - thereby reducing non-specific binding in the final product. This step uses an isotype antibody that has the same constant domain as but a different antibody binding domain than your protein-specific antibody. Bacterial antibody-binding proteins are the second key component of this method. After the protein-specific antibody binds the target protein, the antibody: protein complex must be pulled down (Figure 1). Proteins A, G, and L are bacterial proteins that bind the constant domain of antibodies. While bacteria use this to subvert the immune system, researchers have co-opted this system for easy antibody purification, and it is used during both the pre-clearing and pull-down steps. These proteins have different binding affinities for different species and different constant domain subtypes - another factor to consider when choosing conditions for IP. Many companies sell Protein A/G labeled agarose beads (Figure 1), pre-made spin columns, or resins to make columns. In general, beads and spin columns are used for smaller sample sizes while resins are used for bulk purification.
In this lab exercise, we demonstrate how to purify the endogenous protein c-myc, from primary murine thymocytes, using Protein A/G Plus agarose beads based basic immunoprecipitation technique. The protocol starts from cell lysate preparation and ends with the with verification of successful protein pull down using Western blot analysis.

Immunoprecipitation Techniques: Purification of Proteins

טכניקות מבוססות אימונופרציפיטציה: טיהור חלבונים אנדוגניים באמצעות חרוזי אגרוז

Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunoprecipitation ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Immunology

The Western Blot

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples. Following separation by a technique known as sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE, western transfer is used to move proteins from a polyacrylamide gel onto a piece of membrane which traps the proteins in their respective locations. Next, the membranes are probed with antibodies in a process called immunboblotting. Immunoblotting uses antibody-protein and antibody-antibody binding through specific recognition sites, providing the high specificity required for identifying a single protein. The detection of antibodies takes place using reporter systems which includes the use of enzymes. Enzymes can be attached to the end of an antibody and react with substrates to produce changes in color or light. These signals can then be imaged and quantified using a process called densitometry.
This video-article presents an overview of the western blot technique by describing western transfer, the use of antibody detection, and image analysis. The steps involved with western transfer such as the assembly of the transfer sandwich and transfer conditions are discussed in detail as well as the theory behind antibody binding and detection of those antibodies. The broad applications of this technique are described through several examples including the detection of protein-protein interactions and identification of individual proteins within protein complexes.

Western Blotting: Western Transfer, Antibody Detection, and Image Analysis

הכתם המערבי

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

Basic Biology

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Quantitative Western Blotting to Estimate Protein Expression Levels

Source: Huang, Y. T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59438">Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting.</a> J. Vis. Exp. (2019).
The video demonstrates a total protein normalization-based western blotting technique for quantifying the target protein expression in a sample. By utilizing the total protein staining of the sample, a ratiometric analysis is performed to determine the relative expression level of the target protein.