Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından finanse edildi (HL105114, HL088391, NS066652 ve yec için HL068878), Amerikan Kalp Derneği (JZ Milli Scientist Kalkınma 0835237N). YEC mali Michigan Tıp Merkezi Üniversitesi (UMMC) Kardiyovasküler Tıp donatılmış Frederick Huetwell Doçent olarak desteklenmektedir. Bu çalışma Translational Bilim ve UMMC de Therapeutics (CAMTraST) Gelişmiş Modelleri için Merkezi tarafından desteklenen Çekirdek Hizmetleri kullanılmaktadır.

Tüm hayvan bakım, bakım ve kullanım prosedürleri Michigan Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı gözden ve Üniversite Komisyonu tarafından kabul edildi. 1.. ZFN Tasarım ve Seçimi <ol><li> Üreticiye, ilgi konusu genin (örneğin tavşan apoCIII) genomik dizi bilgisi kaynağı. ZFN puanlara dayalı deneyler için ZFN set (ler) seçin. </li></ol> 2. Tavşan Embriyo Koleksiyonu <ol><li> Superovulate cinsel (6-18 ay) olgunlaşmış Yeni Zelanda Beyaz (NZW) ilk iki enjeksiyon, sonraki iki enjeksiyonlar ve 6 mg boyunca 5 mg ila 3 mg arasında bir doz ile FSH deri altına (sc) enjeksiyon iki kere / gün dişi tavşan son iki enjeksiyonlar için. </li><li> Ovulasyonu uyarmak için ilk FSH enjeksiyondan sonra 72 saat sonra 200 IU hCG tek bir intravenöz (IV) enjeksiyonu uygulayın. HCG enjeksiyonundan hemen sonra bir erkek tavşan ile süperovulasyonu kadın Mate. </li><li> Euthanize sodyum pentobarbital ile süperovulasyonu donör tavşanlar (150 mg / kg, iv) 16-18 saat sonrası tohumlama (psi). </li><li> Dikkatli tüm Fallop tüpleri ve yumurtalıkların yapısı toplayarak yumurtalığa ampullae kurtarın. </li><li> HEPES, 10 ml manipülasyon ortamı ile yıkayın yumurta kanalının her bir TCM 199 yumurta kanalı ve rahim ucundan orta enjekte edilerek,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş tampon. Petri kabı için yumurta kanalı yumurtalık uç açılışında kızarmış orta toplayın. </li><li> Gözlemlemek ve kızarmış ortamda kurtarıldı embriyolar tespit manipülasyon ortamda embriyolar üç defa yıkamak, havada 38.5 ° C&#39;de manipülasyon ortamda tutmak, ve döllenme oluşumu için bir stereo mikroskop altında onları gözlemlemek. Pronükleer aşamasındaki embryo mikroenjeksiyon için hazırlanın 19-21 saat psi </li></ol> 3. ZFN mRNA hazırlanması <ol><li> RNAse içermeyen 0.1X TE (1 mM Tris-Cl pH içinde tekrar süspansiyona almadan önce elde edilen mRNA arındırın8.0, 0.1 mM EDTA). Konsantrasyonunu ölçmek ve kullanılana kadar -80 ° C &#39;de mRNA saklayın. </li><li> 10 ul şişelere ZFN çift (pH 7.5 &#39;de 1 mM Tris-CI, 0.1 mM EDTA içinde 4-10 ng / ml), bir kısım kodlayan mRNA hazırlayın. Kullanım için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de saklayın. Mikroenjeksiyon önce, RNA flakon (ler) çözülme ve buz üzerinde tutmak. </li></ol> 4. Embriyo Mikroenjeksiyon <ol><li> Uzaklaştırılmıştır ortam bölmesine sahip bir 1-çukurlu slaytı üzerinde manipülasyon aracının bir 5 ul damla yerleştirerek mikroenjeksiyon platformu hazırlayın. Isıtılmış mikroskop sahnede mineral yağ ve yer ile orta damla örtün. </li><li> Mikromanipülatör tutucu kol içine tutarak pipet (120 mikron çapında) yerleştirin ve manipülasyon orta damla içine yerleştirin. </li><li> Bir mikropipet çektirmesi cihazı borosilikat cam kapiller tüplerin ısıtılması ve çekerek enjeksiyon mikropipetler Üretiyor. Enjeksiyon pipet enjekte edilecek olan mRNA yerleştirin. </li><li>Bir mikropüskürtücü bağlı olduğu basınçlı hava kaynağı açın. </li><li> Manipülasyon orta düşüş içine mikromanipulatöre pozisyona onu koydum, enjeksiyon tutucu içine enjeksiyon pipet yerleştirin. </li><li> Kur, aşağıdaki parametreler ile önerilen mikropüskürtücü: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, pl 1-5 arasında bir enjeksiyon hacmi ile sonuçlanır Injtime = 1 sn. </li><li> Nazikçe tutma pipet karşı dokunarak enjeksiyon pipet ucu açın. </li><li> Platformda mikromanipülasyon damlasına embriyolar (30-50) aktarın. Bir embriyo yakalama ve enjeksiyon iğnesi, embriyo ve x-ekseni boyunca tutma pipet hizalamak için tutma pipet kullanın. </li><li> 400X büyütme altında, embriyo yoluyla enjeksiyon pipet önceden. Çekirdeği önlemek için dikkatli olun. Plazma zarı delinir sonra, basın ayak pedalı enjekte etmek. Enjeksiyonundan sonra, iğneyi embriyo bırakın. Kalan tüm em için işlemi tekrarlayınbryos. </li><li> Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), temel amino asitler (EAA), 1 mM L-glutamin, 0.4 mM sodyum piruvat ve% 10 ile takviye edilmiş Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) oluşur embriyo kültür ortamı içinde, enjekte edilen embriyolar üç kez yıkayın FBS. </li><li> Bu cerrahi senkronize bir alıcı NZW dişi tavşan (adım 5.1) de yumurta kanalına aktarılır önce, 1-2 saat boyunca hava içinde% 5 CO2 içinde 38.5 ° C &#39;de embriyolar inkübe edin. In vitro tahliller ya da doğrulama için kullanılan daha önce Alternatif olarak, kültür embriyoları da blastosist aşamasına kadar. </li></ol> 5. Embriyo Transferi <ol><li> Yaklaşık ağırlığında sağlıklı 5-12 ay yaşlı bir kadın NZW tavşan, seçin. Alıcı hayvan olarak 4,0-5,0 kg. Gonadotropin (adım 2.2) verici hayvan (lar) için hCG enjeksiyonu bu aynı zaman noktasında alıcıya Hormon (GnRH) enjeksiyon kas içinden (im, 50 mcg / ml, 0.3 ml / hayvan) Releasing uygulayın. </li&gt; <li> Mikroenjeksiyon tamamlanmasından sonra, embriyo transferi (GnRH, enjeksiyondan sonra normal olarak 16-24 saat) için alıcı tavşan hazırlar. 10-40 mg / kg ketamin (im) ile tavşan uyutmak ve / veya buharlaşmış izofluran (% 2-4), inhalasyon yoluyla. Steril oftalmik merhem uygulama tarafından aşırı kurutma tavşan gözlerini koruyun. O, yani tamamen bilinçsiz kadar hayvan gözlemlemek. ayak pedi, yeterli anestezi bir göstergesidir pedal refleksi eksikliği kontrol etmek için kullanılan sıkma, pedal refleksleri yanıt vermiyor. </li><li> Tavşan karın Tıraş, antiseptik solüsyon, ardından antiseptik fırçalayın ile yıkayın ve steril gazlı bez sünger ile traş bölgeyi silin. </li><li> Steril koşullar altında ameliyat, ameliyat boyunca alıcı tavşan yaklaşık her 15 dk hayati belirtileri kaydedebilirsiniz. </li><li> Embriyoların mevcut sayısına bağlı olarak, bir alıcı hayvana, 10-25 embriyo transfer edin. </li><li> Sonundacerrahi işlemler, kaplamalı emilebilir sütür ile kas tabakası kapatın. Emilebilir sütür kullanarak subkütiküler sütür ile veya nonabsorable dikiş (örn. monofilament naylon veya benzeri) kullanılarak basit bir kesintiye cilt dikişlerle deri dikin. </li><li> Hayvan sıcak tutmak ve sternum yatma ulaşılana kadar onu izlemek. </li><li> Günlük hayvan izleyin. Hayvan bakımı için veteriner yönergeleri izleyin. Ağrı kesici ve / veya veteriner hekim tarafından gerekli saptandığı takdirde ateş günlük sonrası çalışmasını azaltmak için meloksikamı (sc 1.0 mg / kg) yönetmek. </li><li> Yaklaşık 10-14 gün sonrası operasyonda nonabsorable cilt sütür çıkarın. </li></ol> 6. ZFN Bağlı Gene bozulması Saptanması <ol><li> In vitro doğrulama için, in vitro kültürlenmiş embriyolar ile ilgili genotipleme gerçekleştirin. 5 ul NP-40 çözeltisi (1% NP-40 ve 1 ug morula / blastosist aşamalarına geliştirilmiş / ml Taq Tampon Proteinaz K Lyse bireysel embriyolar) 55 ° C de 0.5-1 saat, ve 95 ° C&#39;de 10 dakika boyunca </li><li> Yavruların genotip için, yenidoğan kitleri kulak deri örnekleri toplamak, genomik DNA ayıklamak ve PCR dizileme için şablon olarak kullanabilirsiniz. Kanamayı durdurmak ve rahatsızlığı azaltmak için toplandıktan sonra örnekleme alanına Kwik-Dur uygulayın. </li><li> LA Taq-ve ZFN hedef bölge üst akışında yer alan (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) ve (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3 alt&#39;) vardır PCR primer çifti kullanılarak PCR için bir şablon olarak aşama 6.2 ya da 6.3 &#39;dan erimesine kullanın . </li><li> PCR ürünleri arındırın ve dizileme primeri (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;) ile sırası. </li><li> Hedefleme sitenin etrafında sırası diyagramı çift eğri bakarak mutant örnekleri belirlemek. &quot;Pozitif&quot; olarak çift eğrileri ile olanları etiketleyin. </li><li> , TA klonlama vektörü içine &quot;pozitif&quot; PCR ürünleri Clone 10-20 klon, sekansı insertler almak ve t çevresinde mutasyonları teyitargeting sitesi. </li></ol>

<ol>
	<li>Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III:+understanding+an+emerging+cardiovascular+risk+factor.">Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor.</a> Clinical Science. 114, 611-624 (2008).</li><li>Pollin, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+null+mutation+in+human+APOC3+confers+a+favorable+plasma+lipid+profile+and+apparent+cardioprotection.">A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection.</a> Science. 322, 1702-1705 (2008).</li><li>Ginsberg, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+B+metabolism+in+subjects+with+deficiency+of+apolipoproteins+CIII+and+AI.+Evidence+that+apolipoprotein+CIII+inhibits+catabolism+of+triglyceride-rich+lipoproteins+by+lipoprotein+lipase+in+vivo.">Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo.</a> The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).</li><li>Cohn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+apoC-III+production+is+a+characteristic+feature+of+patients+with+hypertriglyceridemia.">Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia.</a> Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).</li><li>Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+production+of+plasma+and+very-low-density+lipoprotein+(VLDL)+apolipoprotein+C-III+is+strongly+related+to+the+concentration+and+level+of+production+of+VLDL+triglyceride+in+male+subjects+with+different+body+weights+and+levels+of+insulin+sensitivity.">Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).</li><li>Maeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+apolipoprotein+C-III+gene+in+mice+results+in+hypotriglyceridemia+and+protection+from+postprandial+hypertriglyceridemia.">Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).</li><li>Jong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III+deficiency+accelerates+triglyceride+hydrolysis+by+lipoprotein+lipase+in+wild-type+and+apoE+knockout+mice.">Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice.</a> Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).</li><li>James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+in+transgenic+mice.">Cardiac physiology in transgenic mice.</a> Circ. Res. 82, 407-415 (1998).</li><li>Duranthon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+emerging+role+of+rabbit+as+human+disease+model+and+the+instrumental+role+of+novel+transgenic+tools.">On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools.</a> Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).</li><li>Fan, J., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rabbits+as+therapeutic+protein+bioreactors+and+human+disease+models.">Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models.</a> Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).</li><li>Shiomi, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Watanabe+heritable+hyperlipidemic+(WHHL)+rabbit,+its+characteristics+and+history+of+development:+a+tribute+to+the+late+Dr.+Yoshio+Watanabe.">The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe.</a> Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).</li><li>Morehouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CETP+activity+by+torcetrapib+reduces+susceptibility+to+diet-induced+atherosclerosis+in+New+Zealand+White+rabbits.">Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits.</a> Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).</li><li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li><li>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+editing+of+bacterial+genomes+using+CRISPR-Cas+systems.">RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.</a> Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).</li><li>Petersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+'molecular+scissors'+for+transgenic+farm+animal+production.">Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PPARgamma+mono-allelic+knockout+pigs+via+zinc-finger+nucleases+and+nuclear+transfer+cloning.">Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning.</a> Cell Research. 21, 979-982 (1038).</li><li>Flisikowska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+immunoglobulin+gene+disruption+and+targeted+replacement+in+rabbit+using+zinc+finger+nucleases.">Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases.</a> PLoS ONE. 6, e21045 (2011).</li><li>Foley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+zebrafish+using+customized+zinc-finger+nucleases.">Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.</a> Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).</li><li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knockout+rats+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+(X-SCID)+using+zinc-finger+nucleases.">Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases.</a> PLoS ONE. 5, e8870 (2010).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertriglyceridemia+and+delayed+clearance+of+fat+load+in+transgenic+rabbits+expressing+human+apolipoprotein+CIII.">Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII.</a> Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).</li><li>Hauschild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+a+biallelic+knockout+in+pigs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışmada, beş apoCIII KO tavşan ZFN teknolojisi kullanılarak oluşturulmuştur. Daha önce tavşanların GTT üretiminin tek raporu da ZFN teknolojisi 18 kullanılır. Bu çalışma ZFN etkili tavşanlarda genlerin hedef için yararlı olduğunu doğruladı. Bu çalışmada, tavşanlarda önceki ZFN raporda (% 30.8, 16/52) 18 ile karşılaştırılabilir olduğunu ve bu rapor transgenik oranı (pozitif kitleri / toplam doğumlu) is23.8% (5/21), zebra balığı 19, fare 20, 21 sıçan ve domuz 17 dahil olmak üzere diğer hayvan türlerinin içinde ZFN kullanarak. Bu oran normalde% 5-20 aralığında düşüş birçok geleneksel transgenik tavşan üretim çalışmaları, oranları daha yüksek aslında. Örneğin, geleneksel DNA mikroenjeksiyon yoluyla ürün apoCIII transgenik tavşan için bir çaba, Ding ve diğ. (% 5.6) 22 doğumlu 54 yavruların üzerinden 3 pozitif kurucuları elde. Önceki bulguları ile uyumlu olarak, hedef bölgelerde mutasyon (beş KO tavşanlarda 1-21 arasında) bazların farklı sayıda oluşan silmeler veya eklemeler dahil, değişkendir. Kurucu hayvanların spesifik sekans bilgilere göre, bu (Δ1, 1, 1, ya da Δ20 mutasyonlar içerenler, yani.) ApoCIII fonksiyon kaybı olacağını en az dört tahmin edilmektedir. Bu mutasyon yedi amino asitlerin tek nedeni kaybı tahmin, ama bir okuma çerçevesi kayma olmadığı gibi hayvansal R-16 Δ21 ile, fonksiyonel kaybı görünmeyebilir. Sonuç olarak, deneyler, bu fenotip Kurucu hayvan gerçekten apoCIII fonksiyonlarının kaybı göstermek olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Bu çalışmada üretilen beş KO tavşanların hiçbirinde bialelik modifikasyonları içerir. İlginç olarak, bu aynı zamanda önceki ZFN tavşan raporda durumdur. Bunun aksine, ZFNs α1 ,3-galaktosıltransferaz hedeflerken, domuz uygulanmıştırHücreler, 23 knockouts biallelic Tek adım yaratma mutasyonların yaklaşık üçte biri ile, 7-46% arasında değişmekteydi tek bir alel hedefleme frekansı. TALEN domuz fibroblast hücrelerine uygulandığında Buna uygun olarak, bialelik modifikasyonlar toplam pozitif klonların 14 arasında, yaklaşık% 15-40 bulundu. Bu, bu çalışmada bialelik KO tavşan oluşturmak için başarısızlık hedefleme nükleaz göre genin bu kapasite için bir tür fark (yani tavşan genel domuz) gösterebilir mümkündür. O, bu projede üretilen KO tavşanların sayısının nispeten küçük olduğundan bu basitçe olduğunu, ancak daha olasıdır. Biz ZFN ZFN göre GTT tavşan üretiminin bir potansiyel avantaj olarak kabul edilmelidir, tavşanlarda bialleic mutasyonlar, üretme yeteneğine sahip olduğuna inanıyoruz. Diğer deneyler tavşanlarda ZFN böyle kapasitesini doğrulamak için gereklidir. Sonuç olarak, mevcut çalışma gösteriyor ki ZHedefleme yaklaşımı FN dayalı gen KO tavşan üretiminde etkilidir. Özellikle,% 23.8, tatmin edici bir transgenik oranı ile beş apoCIII KO tavşan oluşturulur. Bu hayvanlar gelen fare modellerinde göre insanlarda lipid metabolizması üzerindeki bu proteinin rolü hakkında daha anlamlı bilgi sağlamak inanılmaktadır. Biz ZFN dayalı gen hedefleme, yanı sıra Yeten ve RGEN gibi diğer nukleaz tabanlı teknolojiler tahmin, nonmurine hayvanlarda önemli ölçüde çeşitli insan hastalıklarının incelemek için yeni bir hayvan modellerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Şekil 1. ZFN teknolojisini kullanarak nakavt tavşanların üretim akış şeması. ZFN teknolojisi kullanılarak KO tavşan üretimi ilgi konusu genin seçimi ile başlar. Dizi bilgileri ZFN bebekler tasarlanmıştır, Resim ve subj edilirSeniyye maya içi doğrulama tabanlı. Kontrol noktası (CP) 1 (MP-1) olarak, in-house doğrulama (dahili pozitif kontrolün% 50 ya da daha yüksek) geçirilen yalnızca bebekler seçimi için kullanıcılara sağlanacaktır. Hiçbir setleri CP-1 geçerseniz, ek sırası etkili ZFN setleri tasarımı için gerekli olabilir. Bir in vitro embriyo doğrulama seçilen ZFN set seçilen siteler (CP-2) mutasyonlar neden sağlamak için takip edilir. O (in vitro embriyoların&gt; =% 10 mutasyon oranları) CP-2 geçerse ZFN set (ler) sadece kullanılacaktır. CP-2 de başarısızlık ZFN setleri bir yeniden gerektirir. Embriyo donörler hazırlanacak ve pronükleer sahne embriyolar doğrulanmış ZFN setleri ile microinjected olacak. Bu microinjected embriyolar senkronize embriyo alıcılara transfer edilecektir. Bir aylık gebelik döneminden sonra, yenidoğan (CP-3) genotyped edilecektir. Yenidoğanların hiçbiri pozitif iseniz, ek mikroenjeksiyon yapılacaktır. Bu n varsayarak, CP-2 projesinin başlangıcından itibaren 2-3 ay sürersürecinde o hatası. Bu, CP-3 CP-2 ek 2-3 ay sürer. Bu nedenle ZFN teknolojisini kullanarak bir 4-6 aylık bir zaman dilimi içinde bir nakavt tavşan üretmek mümkündür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> Şekil 2. ZFN tasarımı. Üç ZFN setleri (2 Set 1 ve 3) Exon 1 veya tavşan apoCIII (A) Ekson 2 farklı hedefleme dizileri tasarlanmıştır. Üç set ZFN aktivitelerini belirlemek için maya MEL-1 raportör deneyine tabi tutulmuştur. Üreticinin protokollerine uygun olarak, üreticinin iç pozitif kontrolün&gt;% 50 aktivite gösterdiği ZFNs in vitro ve in vivo deneylerde genom düzenleme için yararlı olarak kabul edilmektedir.ZFN faaliyetleri dolayısıyla 1 Bu çalışmada seçilen Set, Set 1 için 224,2%, Set 2 için 196,9 ve% Set 3 (B) için 177.8% idi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> ZFN Şekil 3.. In vitro embriyo doğrulama. Set 1 &#39;e ait mRNA (5 ug / ml) 35 pronükleer aşama tavşan embriyolar (A) sitoplazmaya ile enjekte edildi. Mikroenjeksiyon tedavisi (n = 31) olmadan temizlendi embriyolar kontrol grubu olarak kullanıldı. BL gelişme oranı kontrol grubunda% 77.4 idi. Mikroenjeksiyon grubunda, BL oranı% 51.4 idi. PCR dizilmesine tabi 16 BLS, 8 (% 50) pozitif olarak tespit edildi, Set 1 belirten TARGE mutasyonlar ikna etmek için etkili bir ZFN kümesidirting sitesi (B, apoc3wt.seq, siyah-kutulu) tavşanlarda apoCIII arasında. Mutasyonları içeren Bls BL # apoC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, ve 17 (B, kırmızı altı çizili). Kalan BLS (# apoC-2, 6, 9, 10, 12, 14 ve 16) hedefleme yerinde mutasyon yok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> Şekil 4. ApoCIII KO tavşanların üretimi. ZFN Set 1 mRNA ile mikroenjeksiyon yüz kırk beş embriyo 7 psödo-gebe tavşan alıcı (A) transfer edildi. ZFN mikroenjeksiyon olmadan taze kızardı embriyolar (n = 75) alıcılara transfer edildi (n = 6) kontrol grubu olarak. Deney grubundaki toplam vadeli kitleri / toplam embriyo olarak hesaplanan dönem faizi 14 olduğunu0,5% (21/145), oranı kontrol grubunda (22/75)% 29.3 ise (A). Mikroenjeksiyon gruptan beşi (R1, R9, R11, R12, ve R16) doğan 21 kitleri dışında dizilemesi PCR (B) sonra, pozitif kitleri KO tespit edilmiştir. Hedefleme yerinde indels iki girmeler (R9 ve R11 hem 1) ve üç silmeleri (sırasıyla Δ1, Δ 20, R1, R12 ve R16 için Δ 21) içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> .

Apolipoprotein (Apo) C-III (apoCIII), karaciğer ve bağırsakta esas olarak sentezlenen küçük bir O-glikosile edilmiş salgılama proteinidir. Bu, plazma şilomikron (CM) yüzeyinde, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL) ve yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) bulunur. ApoCIII kardiyovasküler hastalık 1 için bir risk faktörü olarak kabul edilmiştir. ApoCIII kalıtsal eksikliği olan hastalar, düşük plazma trigliserid (TG) düzeyleri ve azalmış subklinik koroner arter ateroskleroz 2,3 var. Elevated plasma apoCIII seviyesi, diğer taraftan çoğu zaman, insülin direnci, obezite ve hipertrigliseridemi (HTG) 4,5 ile ilişkilidir. Gene nakavt (KO) bir genin işlevini incelemek için güçlü bir araçtır. , Mutasyona uğramış insan popülasyonlarında gözlem ile uyumlu olarak, farelerde apoCIII genin nakavt bir plazma TG indirgenmesi ve yemek sonrası HTG 6 koruma yol açtı. ApoCIII Böyle olumlu bir rol çıktıApoE ve apoCIII hem de eksik farelerde de yemek sonrası hiperlipidemi 7 korunmaktadır gibi, Apolipoprotein E (ApoE) bağımsız olduğu. Bu apoCIII KO fare modelleri insanlarda apoCIII muhtemel işlevleri hakkında değerli bilgiler vermiş olsa da, bu farelerin lipoprotein metabolizması birçok açıdan insanlarda bu farklı olduğuna dikkat edilmelidir. Örneğin, fare plazması, kolesteril ester transfer proteini (CETP), VLDL, LDL taşıma katılan önemli bir enzim, ve HDL 8 yoksundur. Bu nedenle, daha fazla in vivo apoCIII fizyolojik rolünü anlamak için, uygun bir hayvan modeli geliştirmek için gereklidir. Tavşan klasik bir model hayvan türü 9-11. Kısa bir gebelik dönemi (30-31 gün), büyük DKBKS (4-12/litter) sahiptir ve kapalı tesis rahatlıkla muhafaza edilebilir. Fareler ile karşılaştırıldığında, tavşan, insanlarda 10 filogenetik olarak yakındırlar. Önemli bir şekilde, gibi huBir adam ancak fareler aksine, tavşan LDL-zengin memeliler ve CETP&#39;nin 10,12 önemli seviyeleri var. Ayrıca, insan ateroskleroz 13 görülen benzer lezyonlu kolesterol açısından zengin bir diyet ile uyarılan aterosiklerozun duyarlıdır. Bu nedenlerden dolayı, apoCIII KO tavşan insanlarda lipid metabolizması ve ateroskleroz ApoCIIIplay rollerini araştırmak için kendi fare göre daha iyi bir model olarak hizmet edebilir varsayıldı. Gen üretimi (GTT) tavşan bir meydan okuma olmuştur transgenik hedef. Bu embriyonik kök hücrelerin (ESC) iletilmesi tohum çizgisi eksikliği ve tavşanlarda somatik hücre nükleer transferi (SCNT) son derece düşük verimlilik kaynaklanmaktadır. Ve SCNT başarılı bir domuz, koyun ve sığır, ancak tavşan gibi germlin iletilmesi EKH, eksik türlerde KO hayvanlar oluşturmak için uygulanmıştır, oysa ESC, GTT fareler üretmek için birincil araçtır. En son çinko parmak Nükleaz (ZFN), Transcription Activator-Like Efektör Nükleazlar (TALEN) 14, ve RNA Rehberli Endonuclease (RGEN) 15 genom düzenlemek için güçlü araçlar ortaya çıktı. Bu nedenle &quot;moleküler makas&quot; olarak adlandırılan bu nükleazlar, hedef genin bir işlevsel KO yol ya da genomundaki spesifik bir yerdeki bir DNA sekansı entegre etmek için kullanılabilir genomu çift kordonlu kırılmaları (DSB) üreten verimlidir türlerin 16 bir dizi. 2011 yılında, ZFN teknolojiyi adapte ilk arasında, biz SCNT 17 için bu hücreleri kullanarak sonra bu yaklaşım ve başarılı oluşturulan PPARy KO domuzlar aracılığıyla peroksisom proliferatörü aktive reseptör gama (PPARy) KO domuz hücreleri üretilir. Aynı yıl, verimli immunglobulin gen bozulması ve aynı zamanda ZFN kullanarak tavşanlarda hedeflenen yedek 18 bildirilmiştir. (Şekil 1 e bakınız ZFN Set 1 kullanılarak PCR dizileme ile teyit edildiği gibi, bu çalışmada beş apoCIII KO tavşan oluşturulan </strong&gt;. akış şeması gösterim için). Bu hayvanlar lipid metabolizması içinde apoCIII rollerini incelemek için yeni kaynaklar vardır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

Apolipoprotein (Apo) C-III (apoCIII), plazma şilomikron (CM) yüzeyinde, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL) ve yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) bulunur. Bu kabul edildiğini kardiyovasküler hastalıklar için plazma apoCIII oluşturmadığı risk faktörü (CVD) yüksek seviyeleri. Elevated plasma apoCIII düzeyi genellikle insulin direnci, obezite, ve hipertrigliseridemi ile ilişkilidir. Ancak, bu farelerde lipoprotein metabolizma birçok açıdan insanların bu farklı olduğunu kaydetti; ApoCIIIin lipid metabolizması ve CVD rolleri paha biçilmez bilgi apoCIII nakavt (KO) farelerde dahil transgenik fare modelleri elde edilmiştir. Şimdi yüksek plazma apoCIII doğrudan aterojeniktir olmadığı kadar bilinmemektedir. Biz tavşan insan lipid metabolizmasını ve ateroskleroz okuyan bir reasonablemodelfor olarak hizmet verebilir hipotezine dayalı bu çalışmada apoCIII KO tavşan geliştirmek için çalıştı. Çinko parmak nukleaz (ZFN) takımları hedefleme tavşan ApoCIIIgene önce embriyo mikroenjeksiyon için in vitro doğrulama tabi tutuldu. MRNA, 35 tavşan pronükleer aşamasında embriyoların sitoplazmaya enjekte edilir ve blastosist devlet mutasyon hızı değerlendirilmiştir. Tahlil edilmiştir on altı blastosist, hedefleme yerinde tatmin edici bir mutasyon oranı,% 50 (8/16), in vivo deneyler için Set 1 kullanımını destekleyen, elde edildi. Sonra, Set 1 mRNA ile 145 embriyolar microinjected ve 7 alıcı tavşanlarda bu embriyolar transfer. 30 gün doğumdan sonra, 21 kitleri beş PCR dizileme tahlillerin ardından apoCIII KO tavşan olarak teyit edildi dışarı olan, doğdu. KO hayvan oranı (# KO kitleri / toplam doğumlu)% 23,8 idi. Genel üretim verimliliği (5 kits/145 embriyolar transfer)% 3.4. Bu çalışma ZFN KO tavşan üretmek için son derece verimli bir yöntem olduğunu göstermiştir. Bu apoCIII KO tavşan lipid metabolizması içinde apoCIII rollerini incelemek için yeni kaynaklar vardır.

ZFN çiftleri vitro doğrulama konusunda On altı ZFN çifti ilk olarak tasarlanmıştır. Set 1 &#39;e ait hedef sekans bozulması tavşan apoCIII ekson 2 (Şekil 2A) bulunmaktadır. Üç çift (Set 1, 2 ve 3, Şekil 2A) seçilir, ve bunların ZFN aktiviteleri (Şekil 2B) belirlemek için maya MEL-1 raportör deneyine tabi tutulmuştur. 1 Set 2 (196.9%) ve Set 3 (177.8%) daha yüksek ve seçim eşiği (iç pozitif kontrolün yani% 50) daha yüksek 224,2% bir ZFN puan sahiptir ayarlayın. Bu nedenle in vitro Set 1 doğrulama deneyler için seçilmiştir. Belirli bir dizi iç doğrulama kriterlerine göre in vitro embriyo doğrulama, geçmek için% 10 veya daha yüksek embriyolar pozitif oranları neden gerekiyor. Set 1 &#39;e ait mRNA (5 ug / ml) 35 pronükleer aşama tavşan embriyolar (Şekil 3A&#39; sitoplazması ile enjekte edildi/ Strong&gt;). Mikroenjeksiyon tedavisi (n = 31) olmadan temizlendi embriyolar kontrol grubu olarak kullanıldı. Mikroenjeksiyon grubun on sekiz embriyo on altı dizilenmiştir olan, D5 BL evresine kadar gelişti ve sekiz (BL # apoC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, Şekil 3B, kırmızı altı çizili) gösterilir mutasyona uğramış hedefleme sitede (siyah kutulu, Şekil 2B, üst satır, apoC3wt.seq) de diziler. Mikroenjeksiyon grubunda (% 51.4) ve BL oranı microinjected embriyoların biraz bozulmuş gelişimsel yetkinliği gösteren kontrol grubuna (% 77.4), daha düşüktür. Mikroenjeksiyon embriyoların pozitif mutasyon oranı seçimi eşikten daha yüksek% 50.0 (8/16), (örneğin,% 10) &#39;dir. Bu sonuçlar Set 1 tavşan apoCIII hedeflenmesi yerinde mutasyonlar ikna etmek için etkili bir ZFN küme olduğunu ortaya koydu. Bu nedenle Set 1 apoCIII KO tavşan in vivo üretimi için seçildi. ApoCIII KO tavşan üretimi MRNA of ZFN Set 1 tavşan pronükleer evresindeki embriyoların sitoplazmaya mikroenjeksiyon ve 7 psödo-gebe alıcı tavşanlarda (Şekil 4A), 145 mikro-enjekte embriyo transfer edilmiştir. ZFN mikroenjeksiyon olmadan taze kızardı embriyolar (n = 75) alıcılara transfer edildi (n = 6) kontrol grubu olarak. Gebeliğin 30 gün sonra, 21 kitleri microinjected grubunda doğmuştur. PCR pozitif KO dizileme kiti (Şekil 4B) ve beş (apoC3-R1, R9, R11, R12 ve R16) tespit edilmiştir. Oran kontrol grubunda (22/75)% 29.3 iken, toplam vadeli kitleri / toplam embriyo olarak hesaplanan dönem faizi,% 14.5 (21/145) &#39;dir. Toplam KO kitleri / toplam terim olarak hesaplanan KO oranı% 23.8 (5/21). Bir KO kiti (apo-R16) beş gün postpartum (20.0%, 1/5) öldü. Hedefleme yerinde indelsat iki girmeler ve üç silmeleri içerir, bunlar sırasıyla tavşanlar # R1, R9, R11, R12, ve R16, (Şekil 4B) süreyle, 1, 1, Δ20 ve Δ21 areΔ1. Bi17, daha önce tarif edildiği gibi oinformatics analizi, 1 sırasını ayarlamak için, 7 veya daha az eşleşmeme durumuyla birlikte dışı olası hedefleri ZFN tespit etmek için kullanıldı. Sadece bir kromozom 14 üzerinde bulunan, olası hedef dışı sitesi öngörülen, 7 uyumsuz baz puan ile tespit edilmiştir. PCR tahlili Kurucu hayvanların hiçbirinde hedef dışı etkinlik tespit edildi.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases at JoVE.com

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Gen hedefleme araçları son gelişme nakavtla üretimi (KO) tavşan mümkün kılar. Bu çalışmada, biz Çinko Parmak nükleazlardır (ZFN) kullanarak beş Apolipoprotein (Apo) C-III KO tavşan oluşturulur. Bu çalışma ZFN KO tavşan üretmek için son derece verimli bir yöntem olduğunu göstermiştir.

Çinko Finger nükleazlar kullanılması Apolipoprotein C-III Knockout Tavşanlar Üretimi

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K Görüntüleme.  University of Michigan Medical Center.  Gen hedefleme araçları son gelişme nakavtla üretimi (KO) tavşan mümkün kılar. Bu çalışmada, biz Çinko Parmak nükleazlardır (ZFN) kullanarak beş Apolipoprotein (Apo) C-III KO tavşan oluşturulur. Bu çalışma ZFN KO tavşan üretmek için son derece verimli bir yöntem olduğunu göstermiştir. 

Video: Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Bir Biyoassay olarak Sığır Mezenterik Arter ve Ven Bölüm yalıtma ve kullanma İnce Barsak vazoaktiviteye için Test

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Tıp

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Tavşanlarda Subretinal Cerrahi Adım Protokolle Bir Adım

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, dyslipidemia, and diabetes. To date, there is evidence to support a role for circulating aldosterone as a risk factor for the development of cardiovascular disease. Transgenic mouse models have been generated to study cellular and molecular processes leading to atherosclerosis. In this manuscript, we describe a protocol that takes advantage of continuous infusion of aldosterone in ApoE-/- mice and generates atherosclerotic plaques in the aortic root after 4 weeks of treatment. We, therefore, illustrate a method for quantification and characterization of atherosclerotic lesions at the aortic root level. The added value of aldosterone infusion is represented by the generation of atherosclerotic lesions rich in lipid and inflammatory cells after 4 weeks of treatment. We describe in detail the staining procedures to quantify lipid and macrophage content within the plaque. Notably, in this protocol, we perform heart tissue-embedding in OCT in order to preserve the antigenicity of cardiac tissue and facilitate detectability of antigens of interest. Analysis of the plaque phenotype represents a valid approach to study the pathophysiology of atherosclerosis development and to identify novel pharmacological targets for the development of anti-atherogenic drugs.

We describe a protocol to induce atherosclerosis in the aortic root of ApoE-/- mice fed with an atherogenic diet, through a continuous release of aldosterone. Methods to characterize plaque composition are also described.

Apolipoprotein E-eksik farelerde Mineralocorticoid reseptörlerinin etkinleştirmesi üzerinden aterosklerotik plaklar indüksiyon

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

Diyabetik tavşanların arka ekstremite Iskemi preklinik modeli

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Tavşanlarda Komple Dakriyoadenektomi Kullanarak Şiddetli Kuru Göz Modelinin Oluşturulması

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Blind Endotracheal Intubation in Neonatal Rabbits

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical characteristics, which is further complicated in the case of the newborn. Of the different methods of advanced airway management, endotracheal intubation is less aggressive than tracheostomy, and is more feasible than supraglottic management given the lack of supraglottic devices of such a small size. As direct glottis visualization is very difficult in animals this size, this blind intubation model is presented as an effective alternative, especially for experiments requiring prolonged anesthesia. Using this method, we performed blind intubations with a 90% success rate.

We describe a technique of endotracheal intubation in newborn rabbits after esophageal catheterization with a gastric tube.

Yenidoğan Tavşanlarında Kör Endotrakeal Entübasyon

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease and arrhythmias in people with epilepsy (i.e., epileptic heart.) Additionally, cardiac and autonomic disturbances have been reported surrounding seizures. 1:1,000 epilepsy patients/year die of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). The mechanisms for SUDEP remain incompletely understood. Electroencephalograms (EEG) and electrocardiograms (ECG) are two techniques routinely used in the clinical setting to detect and study the substrates/triggers for seizures and arrhythmias. While many studies and descriptions of this methodology are in rodents, their cardiac electrical activity differs significantly from humans. This article provides a description of a non-invasive method for recording simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography in conscious rabbits. As cardiac electrical function is similar in rabbits and humans, rabbits provide an excellent model of translational diagnostic and therapeutic studies. In addition to outlining the methodology for data acquisition, we discuss the analytical approaches for examining neuro-cardiac electrical function and pathology in rabbits. This includes arrhythmia detection, spectral analysis of EEG and a seizure scale developed for restrained rabbits.

Using simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography, we developed a methodology to evaluate the susceptibility of rabbit models to develop provoked arrhythmias and seizures. This novel recording system establishes a platform to test the efficacy and safety of therapeutics and can capture the complex cascade of multi-system events that culminate in sudden death.

Bilinçli Kısıtlanmış Tavşanlarda Nöbet, Aritmi ve Apnelerin Tanımlanması için Çok Sistemli İzleme

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...

Three-Dimensional Finger Motion Tracking during Needling: A Solution for the Kinematic Analysis of Acupuncture Manipulation

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D motion tracking technology to measure the kinematic parameters of the joints of fingers during acupuncture manipulation (AM) and establish three technical indicators "amplitude, velocity and time". This method can reflect the operation characteristics of AM and provide quantitative parameters along three axes of multiple finger joints. The current evidence shows that the method has great potential for future applications such as the study of the dose-effect relationship of acupuncture, teaching, and learning of AM, and the measurement and preservation of famous acupuncturists' AM.

This experimental method describes a solution for the kinematic analysis of acupuncture manipulation with three-dimensional finger motion tracking technology.

Needling Sırasında Üç Boyutlu Parmak Hareketi takibi: Akupunktur Manipülasyonunun Kinematik Analizi için Bir Çözüm

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D ...

A Modified Technique for Arteriovenous Fistula Construction in Rabbits

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury to the veins and arteries during the operation and hemodynamic changes can lead to intimal hyperplasia, leading to juxta-anastomotic stenosis. To reduce injury to the veins and arteries during the operation, this study proposes a new modified no-touch technique (MNTT) for AVF construction that can decrease the rate of juxta-anastomotic stenosis and improve the AVF patency. To unravel the hemodynamic changes and mechanisms of the MNTT, this study presented an AVF procedure using this technique. Although this procedure is technically challenging, 94.4% procedural success was achieved after adequate training. Ultimately, 13 out of 34 rabbits had a functional AVF 4 weeks after the surgery, leading to a 38.2% AVF patency rate. However, at 4 weeks, the survival rate was 86.1%. Ultrasonography showed active blood flow through AVF anastomosis. Furthermore, the spiral laminar flow was observed in the vein and artery near the anastomosis, suggesting that this technique may improve the hemodynamics of the AVF. On histological observation, significant venous intimal hyperplasia was observed at the AVF anastomosis, whereas no significant intimal hyperplasia was observed at the proximal external jugular vein (EJV) of the anastomosis. This technique will improve the understanding of the mechanisms underlying the use of MNTT for AVF construction and provide technical support for the further optimization of the surgical approach in AVF construction.

The present protocol proposes the creation of an arteriovenous fistula in rabbits using a modified no-touch technique. The technique involves the side-to-side anastomosis of the common carotid artery and external jugular vein without the dissection of the perivenous tissues or cutting off the artery.

Tavşanlarda Arteriovenöz Fistül Yapımı için Modifiye Bir Teknik

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury ...