PVX-LIC vektörü sağladığı için Tsinghua Üniversitesi'nden Dr. Yule Liu'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Texas A&M AgriLife Research ve USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü'nden JS'ye TEX0-1-9675 Hatch Projesi'nden bir başlangıç fonu tarafından desteklendi.

1. Patates Bitkileri Yetiştirin.
<ol><li>In vitro patates bitkilerini kültür tüplerinde (25 x 150 mm) Murashige ve Skoog (MS) medyası ve Gamborg vitamini (MS bazal tuz karışımı, Gamborg'un vitamini, 30 g/L sakkaroz, 3,5 g/L agar, pH = 5,7) ile yay. Tüpleri büyüme odasına 20-22 °C, 16 saat ışık/8 saat koyu fotoperiyod ve ışık yoğunluğu 120 μmol/m2⭐s1'in altına yerleştirin. NOT: Yeni sürgünler ve kökler normalde bitkilerden 1-2 hafta içinde gelişir. Bitkileri her ay taze MS/Gamborg vitamin ortamı ile yayın.</li>
	<li>Dört hafta sonra, in vitro bitkileri toprağa nakledin ve 20-22 ° C, 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyod ve ışık yoğunluğu 120 μmol / m2 ⭐ s1 altındaki bir serada yetiştirin. NOT: Yeni geliştirilen kökleri ve yaprakları olan bitkiler ekim için uygundur. Yeni nakledilen bitkiler için nemi ilk 3-4 gün koruyun.</li>
</ol>2. VbMS vektörlerini oluşturun.
<ol><li>Kısa tandem TM moleküllerini tasarlayın ve klonla (STTM, Şekil 1)22,53 ilgi miRNA için. NOT: Deneysel verilere dayalı olarak veya miRbase veritabanından miRNA dizileri alın54,55,56,57,58,59. Bu çalışmada kullanılan miR166 dizisi daha önce 60 olarak tanımlanmıştır.<ol>
<li>MiRNA'nın 10-11. nükleotitlerine karşılık gelen sahadaki miRNA'nın ters tamamlayıcı dizisine normalde 5'-CTA-3' uyumsuzluk dizisi ekleyerek TM modülini tasarlayın. NOT: Örneğin, Stu-miR160 dizisi 5'-UGCCUGGCUCCGUAUGCC-3'61'dir ve burada 10-11. Ters kompleman sırası (deoksinükleotidlerde) 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' ve uyumsuz şişkinlik ekleme bölgesi kalın olarak gösterilir. TM molekül dizisi (deoksinükleotid) 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' olmalıdır.</li>
		<li>STTM parçasını klonlamak için astarlar tasarlayın (Şekil 1). PCR klonlama için şablon olarak 48 nt aralayıcı dizisine sahip DNA oligonükleotidlerini kullanın. İleri astar, bir LIC1 bağlayıcıdan (5'-CgACgACAAGACCgT-3'), yukarıdakilerin TM molekülü için tasarlanan ileri dizilimini ve 48 nt aralayıcının kısmi 5' dizisini (5'-GTTGTTTTGTTATGGT-3') oluşur. Ters astar, bir LIC2 bağlayıcıdan (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), TM molekülünün ters tamamlayıcı dizisinden ve 48 nt aralayıcının (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3') 3' dizisine kısmi bir ters tamamlayıcıdan oluşur. NOT: 48 nt aralayıcı sırası 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATGGTCTAAGAAGAAT-3'dür. Örneğin, STTM-miR160 için ileri astar 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3' olmalıdır; ters astar 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' olmalıdır (Şekil 1).</li>
		<li>Şablon olarak sentezlenmiş evrensel 48 nt aralayıcıyı ve yüksek doğrulukta bir DNA polimerazını kullanarak PCR tarafından 50 μL hacimde STTM parçasını güçlendirin.<ol>
<li>Her astarın 0,5 μL'si (40 μM), 0,5 μL'si 48 nt ara oligo (40 μM), 5 μL'si 10x PCR tamponu karıştırarak PCR reaksiyonunun ayarını ayarlayın, 1 μL dNTP karışımı (her biri 10 mM), 0,1 μL yüksek kaliteli DNA polimeraz (10 U/μL) ve 43 μL ddH2O toplam 50 μL hacme aşağıdaki gibi standart PCR amplifikasyonu gerçekleştirin: 3 dakika için 94 °C, 45 s için 94 °C 32 döngü, 45 s için 60 °C ve 60 s için 72 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>STTM parçasını etanol çökeltme ile arındırın. PCR ürünlerine 2,5 hacim etanol ve 1/10 hacimli 3 M sodyum asetat (pH = 4,0) ekleyin. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da kuvvetlice karıştırın ve santrifüj. Süpernatant çıkarın ve peletin% 70 etanol 1 mL ile durulayın. Peletin kurut ve 20 μL ddH2O'da çözün. NOT: STTM PCR ürünlerinin amplifikasyonlarını kontrol etmek için DNA elektroforezi kullanın.</li>
		<li>2,5 μL saflaştırılmış STTM PCR ürünü, 0,5 μL 10x T4 DNA polimeraz tamponu, 0,05 μL 1 M ditiyothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP karıştırarak buz üzerinde T4 DNA polimeraz reaksiyonu ayarlayın, 0,1 μL T4 DNA polimeraz (3 U/μL) ve 1,6 μL ddH2O toplam 5 μL hacme, karışımı 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır, ve T4 DNA polimerazını devre dışı bırakmak için ürünleri 75 °C'de 20 dakika boyunca tedavi edin.</li>
	</ol></li>
	<li>PVX tabanlı VbMS yapısını hazırlayın.<ol>
<li>100 μL hacimde 2,5 μL SmaI (20 U/μL) ile 5 μg PVX-LIC plazmid38 sindirin.</li>
		<li>Sindirilen PVX-LIC ürünlerine eşit miktarda fenol:kloroform:izopropanol (25:24:1, pH = 6.7/8.0) ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Eşit miktarda kloroform ekleyin:izopropanol (24:1) ve girdap kuvvetlice. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj. NOT: PVX-LIC vektörü klonlama için LIC kasetini barındırır. PVX-LIC vektörün LIC kaseti bir ccdB geni ve kloramfenikol dirençli bir gen içerir ve kanamycin (50 μg/L) ve kloramfenikol (15 μg/L) içeren LB ortamı kullanılarak E. coli strain DB3.1'de tutulması/yayılması gerekir.</li>
		<li>Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 2,5 cilt etanol ve 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (pH = 4,0) ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın.</li>
		<li>Peletin% 70 etanol ve girdaptan 1 mL ile kuvvetlice durulayın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Peleti kurutun ve sindirilen PVX-LIC plazmidini 100 μL ddH2O ile çözün.</li>
		<li>Sindirilmiş PVX-LIC vektör DNA'sının 2,5 μL'si, 10x T4 DNA polimeraz tamponunun 0,5 μL'si karıştırılarak buz üzerinde T4 DNA polimeraz reaksiyonunun kurulması, 1 M DTT'nin 0,05 μL'si, 100 mM dTTP'nin 0,25 μL'si ve toplam 5 μL hacimde 0,1 μL T4 DNA polimerazı (3 U/μL) karışımı 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ürünleri 20 dakika boyunca 75 °C'de tedavi edin T4 DNA polimerazını etkisiz hale getir.</li>
	</ol></li>
	<li>STTM dizisini LIC reaksiyon kullanarak PVX-LIC vektörüne klonlayın. T4 DNA polimerazla işlenmiş STTM PCR ürünlerini (5 μL) ve T4 DNA polimerazla işlenmiş PVX-LIC plazmidlerini (5 μL) karıştırın. 70 °C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın, 0,1 °C/s rampada 22 °C'ye kadar soğutun ve PCR makinesi kullanarak 30 dakika boyunca 22 °C'de tutun. NOT: LIC klonlamanın daha yüksek verimliliğini elde etmek için kuluçka süresini 4 °C'de geceleme süresine kadar uzatın.</li>
	<li>LIC reaksiyon ürünlerinin 5 μL'sini E. coli DH5α'ya dönüştürün ve 50 μg/mL kanamycin62,63 içeren bir LB plakasında büyüyün. PVX-LIC vektörü için klonlama astarları ve evrensel astar ve ardından sıralama ile PCR ile pozitif kolonileri seçin ve doğrulayın.<ol>
<li>Pozitif klonları tanımlamak için STTM klonlama için ters astar ile birlikte PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') için ileri astar ile koloni PCR gerçekleştirin. PCR bandının boyutu ~300 bp olmalıdır. NOT: Sonlandırıcı döngüsü sırasıyla STTM parçalarının dizilerini doğrulayın64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>PVX-STTM plazmidlerini doğrulanmış klonlardan ayırın ve bunları GV3101, GV2260 veya EHA10562,63 Agrobacterium suşlarına dönüştürün. Agrobacterium kolonilerini PCR ile doğrulayın. NOT: PVX-LIC için ileri astarı ve STTM klonlama için ters astarı kullanarak Agrobacterium kolonilerini PCR ile onaylayın.</li>
</ol>3. Patates bitkilerinde PVX tabanlı VbMS tahlilleri gerçekleştirin.
<ol><li>4 haftalık tüp patates bitkilerini toprağa nakletin. Nakledilen bitkiler 3-4 gün sonra VbMS testine tabi tutulacaktır.</li>
	<li>Patates bitkilerini PVX-STTM plazmidlerini içeren Agrobacterium ile aşılayın. NOT: Patateste VbMS tahlili için Agrobakteri aracılı infiltrasyon ve kürdan tırmalama inoktülasyonu aynı anda gerçekleştirilir.<ol>
<li>PVX-STTM vektörleri içeren pozitif transformantları 50 μg/mL kanamycin ve 50 μg/mL rifampicin içeren 50 mL sıvı LB'ye alın ve aşılayın. OD600 = 1.0'a kadar 16 saat boyunca 220 rpm'de 28 °C inkübatörde büyüyün.</li>
		<li>Aynı zamanda, pozitif Agrobacterium kolonilerini 50 μg/ mL kanamycin ve 50 μg / mL rifampicin içeren en az iki yeni LB plakasına serin ve 1 gün boyunca 28 ° C'de büyüyün. Kontrol olarak PVX-LIC38,66 vektörünü ve virüs yayılmasını izlemek için PVX-GFP67,68'i dahil edin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.400 x g'da santrifüjleme ile Agrobacterium sıvı kültürünü toplayın. Agrobacterium hücrelerini eşit hacimli sızma tamponu (10 mM MgCl2, 10 mM MES ve 200 μM asetosyringone, pH = 5,6) ile yeniden biriktirin ve OD600 = 1,0'a ayarlayın. Oda sıcaklığında 6 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Agrobacterium kültürünü 1 mL iğnesiz şırınga ile tamamen genişletilmiş yaprakların abaksiyel tarafına sızın.<ol>
<li>Bir yaprağı tek elinizle çevirin ve tutun, ardından bir parmağınızı sızıntı yerindeki adaxial taraftan yaprak laminasını desteklemek için kullanın. Şırınnayı diğer elinizle yaprak yüzeyine dikey tutun ve Agrobacterium kültürünü lamina'nın abaksiyel tarafına sızın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Agrobacterium kültürünü LB plakalarından kazıyın ve sızan patates bitkilerinin ilk bir veya iki internotunun gövde yüzeyini kürdanla çizin. Sapın epidermisini hafifçe çizin. Bitkilere ciddi zararlar verebilecek gövdeden delinmekten kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>22 °C'de 22 °C'de 16 saat açık/8 saat koyu fotoperiyod ve bir serada 120 μmol/m2φ s1 ışık yoğunluğu ile bitkileri yetiştirin. NOT: MiRNA susturma nedeniyle fenotipler genellikle postinokokasyon sonrası 2-4 hafta içinde ortaya çıkar (Şekil 2, Şekil 3). VbMS fenotipinin sızmadan sonra görünmesi genellikle 10-20 gün sürer. VbMS fenotipi, spesifik miRNA ve hedef genlerin özelliklerine, büyüme koşullarına ve patates çeşitlerine bağlıdır.</li>
</ol>4. İfade analizi yapın.
<ol><li>Fenotipler 2-4 haftalık postinokokasyonda ortaya çıktığında, vbMS bitkilerinden fenotipli sürgünler, yapraklar, çiçekler veya kökler gibi dokuları ve kontrol tesislerinden gelen dokuları makasla toplayın. Toplanan dokulardan toplam RNA'ları izole edin.</li>
	<li>RNA kalitesini elektroforez62,63 ile kontrol edin ve OD260 absorbansını spektrofotometre ile ölçerek RNA konsantrasyonunu ölçün.</li>
	<li>MiRNA ifadesini analiz etmek için stem-loop gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) kullanın.<ol>
<li>Belirli miRNA'lar için bir kök döngü ters transkripsiyon astarı tasarlayin. Stem-loop RT primer'lar evrensel 5' omurga ve belirli bir miRNA'nın 3' 6 nt uzantısını içerir. Bir kök döngü yapısı oluşturan 5' evrensel omurga (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') tasarlayın. (Büyük harf ters tekrarlanan bir sıraya ve döngü bölgesine küçük harfe karşılık gelir).</li>
		<li>Bir döngü oluşturan 5' omurga dizisinin bir kısmı, sonraki PCR amplifikasyonu için ters astar görevi görür (omurga dizisinde kalın-italik sıra). Ters transkripsiyon için özgüllük sağlamak üzere kök döngü astarı için ilgi miRNA'nın 3' ucuna ters tamamlayıcı olan 6 nt'lik bir uzantı dizisi ekleyin (Ek Şekil 1A). NOT: Chen ve ark.69 ve Erika Varkonyi-Gasic ve ark.70,71,72 tarafından tanımlandığı gibi kök-döngü ters transkripsiyon astarını tasarlayın. Örneğin, Stu-miR160 için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-GTCTCCTCTGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGGACGGCATA-3' olarak tasarlanmıştır. Patates miR165/166 ailesi için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-GTCTCCTCTGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGG(A/G)A-3' olarak tasarlanmıştır. (Kalın büyük harf dizileri, belirli miRNA'lar için ters transkripsiyonun özgüllüğünü sağlar).</li>
		<li>Toplam RNA'nın 50-200 ng'si, kök döngü ters transkripsiyon astarının 1 μL'si (100 μM), 2 μL 10x tamponu karıştırarak ters transkripsiyon reaksiyonunu ayarlayın, Buz üzerinde 0,2 μL RNaz inhibitörü (40 U/μL), 0,25 μL dNTP (her biri 10 mM) ve 1 μL ters transkriptaz (200 U/μL). Toplam 20 μL hacme çekirdeksiz ddH2O ekleyin.</li>
		<li>Darbeli ters transkripsiyon prosedürünü kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin. Ters transkripsiyon reaksiyon karışımını 30 dakika boyunca 16 °C'de kuluçkalayın, 30 s için 30 °C, 30 s için 42 °C ve 1 s için 50 °C sıcaklık döngüsünü toplam 60 döngü boyunca gerçekleştirin ve ters transkriptazı 5 dakika boyunca 85 °C'de inkübasyonla etkisiz hale koyun.</li>
		<li>MiRNA ifadesinin gerçek zamanlı PCR analizi için, ileri astarı miRNA dizisine göre tasarlayın, ancak yukarıda tasarlanan kök döngü ters transkripsiyon astarı ile çakışır dizileri içermez. Uzunluğu, erime sıcaklığını ve GC içeriğini optimize etmek için ileri astarın 5' kısmına 3–7 nt uzantı ekleyin (Ek Şekil 1). NOT: Evrensel ters astar 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'' dür. Örneğin, Stu-miR160 için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3' olarak tasarlanmıştır. MiR165/166 ailesi için kök-döngü ters transkripsiyon astarı 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3''dür. Kalın diziler, astar optimizasyonu için 5' uzantı görevi eder. MiRNA için kök döngü ters transkripsiyon astarları ve gerçek zamanlı PCR astarları miRNA Primer Tasarım Aracı73 kullanılarak tasarlanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Hedef mRNA'ların cDNA'larını standart ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) ile sentezleyin. Ters transkripsiyon reaksiyon karışımını 37 °C'de 60 dakika kuluçkaya yatırın ve 5 dakika boyunca 85 °C'ye ısıtarak ters transkriptazı devre dışı bırakın. NOT: (1) Hedef mRNA'lar bilinmiyorsa psRNATarget programı74 kullanarak hedef mRNA'ları tahmin edin. (2) mRNA için evrensel ters transkripsiyon astarı, 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3' bağlantılı bir astardır.</li>
	<li>Hem ilgi çekici miRNA hem de hedef mRNA'lar için gerçek zamanlı PCR reaksiyonlarını ayarlayın. Buz üzerinde toplam 5 μL hacimde 0,5 μL şablon cDNA, 5 μL 2x gerçek zamanlı PCR tamponu SYBR yeşili, her ileri ve ters astarın 0,05 μL'si (40 μM) ve 4,4 μL ddH2O'yu karıştırın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 95 °C'de kuluçkaya yaslanın, 3 s için 95 °C'lik 40 döngü ve 30 sn için 60 °C. Sonraki erime eğrisi analizini aşağıdaki gibi yapın: 15 s için 95 °C'de kuluçkalayın, 20 °C/s'lik bir rampada 60 °C'ye kadar soğutun, 60 s için 60 °C'de tutun, 0,2 °C/s'lik bir rampada 95 °C'ye ısıtın ve 15 s için 95 °C'de tutun. ΔΔCt yöntemlerini kullanarak Ct değerlerini analiz edin76,77 ve standart hatalarla araçları çizin. NOT: (1) Hedef mRNA'lar için gerçek zamanlı PCR astarları açıklandığı gibi tasarlanabilir75. (2) Patates poliubiquitin 10 geni patateste normalleşme için bir iç kontrol görevi görebilirsiniz. Patates poliubiquitin 10 geni için ileri astar 5'-ATGTTGCCTTTTTTGTGGTTG-3' ve ters astar 5'-TTATTTATTCACATAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Gerçek zamanlı PCR analizi için kontaminasyon ve astar-dimer oluşumu yanlış pozitif sonuçlar üretebilir. Spesifik olmayan amplifikasyonu izlemek ve gerçek zamanlı PCR analizinin sorumluluğunu artırmak için, şablonsuz kontrollerin dahil edilmesi ve gerçek zamanlı PCR tahlilleri için ters transkriptaz yapılması önerilir.</li>
</ol>

STTM tasarımını PVX vektörüne entegre ederek patatesteki endojen miRNA'ların işlevini karakterize etmek için PVX tabanlı bir miRNA susturma sistemi sunuyoruz. VbMS sisteminin, bitki türleri arasında yüksek oranda korunmuş bir miRNA ailesi olan patateste miRNA165/166'nın susturılmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır.
TM yaklaşımı, hedeflenen miRNA'nın elenmesi ve etkinliğinin tutuklanmasıyla sonuçlanan miRNA tamamlama sırasında beklenen bölünme bölgesinde uyumsuz...

Bitki mikroRNA'ları (miRNA'lar) 20-24 nükleotid uzunluğunda, nükleer kodlu düzenleyici RNA'lar1 olarak karakterize edilir ve büyüme ve gelişme2,3, fotosentez ve metabolizma4,5,6,7, hormon sentezi ve sinyalizasyon8,9, biyotik ve abiyotik yanıtlar dahil olmak üzere bitki biyolojik süreçlerinin hemen hemen her alanında temel roller oynar10, 11,12,13 ve besin ve enerji düzenlemesi14,15. Tesis miRNA'larının düzenleyici rolleri iyi programlanır ve genellikle transkripsiyon sonrası seviyelerde hedef mRNA'ları ayırarak veya çeviriyle bastırarak yerine getirilir.
Patateste miRNA'ların tanımlanması, transkripsiyonal profil oluşturma ve hedef tahminine doğru muazzam ilerleme kaydedildi16,17,18,19,20,21. Bununla birlikte, patates de dahil olmak üzere bitkilerdeki miRNA'ların fonksiyonel karakterizasyonu, verimli ve yüksek verimli genetik yaklaşımların olmaması nedeniyle diğer organizmaların gerisinde kaldı. Standart fonksiyon kaybı analizi ile bireysel miRNA'nın fonksiyonel analizini yapmak zordur, çünkü çoğu miRNA önemli genetik artıklığa sahip ailelere aittir22. Buna ek olarak, tek bir miRNA birden fazla hedef geni kontrol edebilir23 ve birkaç farklı miRNA aynı moleküler yolu işbirliği içinde modüle edebilir24,25. Bu özellikler, belirli bir miRNA veya miRNA ailesinin işlevini karakterize etmeyi zorlaştırır.
MiRNA'ların fonksiyonel analizinin çoğu, belirgin sınırlamaları olan işlev kazancı yaklaşımlarına büyük ölçüde güvenmektedir. Yapay miRNA (amiRNA) yöntemi, miRNA'ları yüksek düzeyde üretmek için endojen primer transkriptlerden (pri-miRNA' lar) yararlanır ve hedef gen ekspresyonunun inhibisyonunu önler26,27,28,29. Bununla birlikte, güçlü bir constitutive 35S promotörü kullanarak aktivasyon etiketleme ve miRNA aşırı ekspresyonu genellikle in vivo koşulları temsil etmeyen ve bu nedenle miRNAs30'un endojen işlevini yansıtmayabilecek miRNA'ların yüksek ekspresyonuna yol açar. Bağlama ve/veya bölünme bölgelerinde temizlenemez mutasyonlar içeren hedef genlerin miRNA'ya dirençli formlarının ekspresyonini içeren alternatif bir yaklaşım geliştirilmiştir31,32,33. Ancak bu yaklaşım, transgenik eserler nedeniyle miRNA dirençli hedef transgeneden türetilen fenotipin yanlış yorumlanmasına da neden olabilir. Bu nedenle, bu fonksiyon kazanım çalışmalarından sonuçlar dikkatle çıkarılmalıdır34. Yukarıda açıklanan yaklaşımların bir diğer önemli sınırlaması, emek yoğun ve zaman alıcı olan dönüşümü gerektirmeleridir. Ayrıca, transgene bağımlı yaklaşımlar dönüşüm-recalcitrant bitki türleri için neredeyse geçerli değil. Bu nedenle, miRNA'ların işlevini çözmek için hızlı ve verimli bir işlev kaybı yaklaşımı geliştirmek önemlidir.
Dönüştürme prosedürünün ön koşulunı atlamak için, hedef mimik (TM) stratejilerini virüs türevli vektörlerle birleştirerek virüs tabanlı mikroRNA susturma (VbMS) oluşturulmuştur. VbMS sisteminde, yapay olarak tasarlanmış TM molekülleri geçici olarak bir virüs omurgasından ifade edilir ve bitki endojen miRNA'ların işlevini parçalamak için güçlü, yüksek verim ve zaman kazandıran bir araç sunar35,36. VbMS başlangıçta tütün çıngırak virüsü (TRV)35,36,37 ile N. benthamiana ve domates geliştirilmiştir ve Arabidopsis genişletilmiştir, pamuk, buğday ve mısır, patates virüsü X (PVX)38, pamuk yaprağı buruşuk virüs (ClCrV)39, salatalık mozaik virüsü (CMV)40,41,42, Çin buğday mozaik virüsü (CWMV)43 dahil olmak üzere diğer çeşitli virüs ifade sistemlerini kullanarak ve arpa şerit mozaik virüs (BSMV)44,45.
Patates (Solanum tuberosum), yüksek besin değeri, yüksek enerji üretimi ve nispeten düşük girdi gereksinimleri nedeniyle dünyanın en önemli dördüncü gıda ürünü ve en yaygın olarak yetiştirilen noncereal mahsulüdür46. Patatesin çeşitli özellikleri onu çekici bir dikotilendonöz model bitki yapar. Yüksek outcrossing oranı, heterozygozite ve genetik çeşitliliğe sahip bitkisel olarak yayılan bir poliploid mahsulüdür. Bununla birlikte, bugüne kadar, VbMS kullanarak patatesteki miRNA'ların işlevini karakterize eden bir rapor yoktur. Burada, patates bitkilerinde miRNA'ların işlevini değerlendirmek için ligasyondan bağımsız klonlama (LIC) uyarlanmış patates PVX tabanlı VbMS yaklaşımını sunuyoruz38. MiR165/166 ailesini VbMS testini göstermek için seçtik, çünkü miR165/166 ailesi ve hedef mRNA'ları ve Sınıf III homeodomain/Leu fermuarı (HD-ZIP III) transkripsiyon faktörleri 22.47.48 olarak kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. HD-ZIP III genleri meristem gelişimin ve organ polaritesinin temel düzenleyicileridir ve miR165/166 işlevinin bastırılması HD-ZIP III genlerinin ekspresyonunun artmasına neden olarak, apikal hakimiyetin azalması ve yaprak polaritesinin anormal örüntüleri gibi pleotropik gelişimsel kusurlara neden oluyor22,35,38,41 . MiRNA165/166'nın susturuğu ile ilişkili kolayca dekore edilebilir gelişimsel fenotipler, PVX tabanlı VbMS testinin etkinliğinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Bu çalışmada, PVX tabanlı VbMS sisteminin patatesteki miRNA'ların işlevini etkili bir şekilde engelleyebileceğini gösteriyoruz. PVX tabanlı virüs kaynaklı gen susturma (VIGS) sistemi bir dizi patates çeşidinde kurulduğundan49,50,51,52, bu PVX tabanlı VbMS yaklaşımı büyük olasılıkla çok çeşitli diploid ve tetraploid patates türlerine uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">100 &#181;M dATP and 100 &#181;M dTTP</td>
			<td style="width:188px;">Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td>
			<td style="width:120px;">TQAC136</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">3 M Sodium acetate, pH 4.0.</td>
			<td style="width:188px;">Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td>
			<td style="width:120px;">#S0297</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">D2666-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chloroform</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0757-950ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">D0798-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DTT</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0281-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">E. coli DB3.1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>for the destination constructs generated by LIC cloning</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td>
			<td style="width:120px;">G99260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs</td>
			<td style="width:188px;">Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, 
			Wilmington, MA, USA</td>
			<td>7958960001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0944-1L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Koptec Pure Ethanol &#8211; 200 Proof</td>
			<td style="width:188px;">Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td>
			<td style="width:120px;">V1005M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MES</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">M0606-250G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MgCl2</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">MFCD00149781</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0253L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">ND-ONEC-W</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System</td>
			<td style="width:188px;">Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td>
			<td style="width:120px;">170-9703</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro</td>
			<td style="width:188px;">Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td>
			<td style="width:120px;">950030010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">pH meter</td>
			<td style="width:188px;">Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td>
			<td style="width:120px;">Benchtop pH / mV Meter - 860031</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0883-400ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phytagel: Gellan Gum</td>
			<td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td>
			<td style="width:120px;">J63423-A1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVX VIGS vector: PVX-LIC</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:167px;">Zhao et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">4485697</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Real-time PCR reagent: KAPA SYBR&#174; FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td>
			<td style="width:188px;">Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, 
			Wilmington, MA 01887, USA</td>
			<td style="width:120px;">7959389001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Restriction enzyme: SmaI</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td>R0141S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix</td>
			<td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA</td>
			<td style="width:120px;">95107-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td>
			<td style="width:188px;">Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td>
			<td style="width:120px;">SKU: D3485-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">RNase Inhibitor Murine</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0314L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">RNAzol RT</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td>
			<td style="width:120px;">R4533</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Soil: Metro-Mix 360</td>
			<td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td>
			<td style="width:120px;">Metro-Mix 360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">T4 DNA polymerase and buffer</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0203S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

potato virus x-based microrna silencing (vbms) in potato.

Virüs bazlı mikroRNA susturma (VbMS), bitkilerdeki mikroRNA'ların (miRNA'lar) fonksiyonel karakterizasyonu için hızlı ve verimli bir araçtır. VbMS sistemi Nicotiana benthamiana, domates, Arabidopsis, pamuk ve buğday ve mısır gibi monokot bitkileri de dahil olmak üzere çeşitli bitki türleri için geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Burada, patatesteki endojen miRNA'ları susturmak için PVX tabanlı VbMS vektörlerini kullanarak ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Belirli bir miRNA'nın ifadesini yıkmak için, ilgi çekici miRNA'nın hedef mimik (TM) molekülleri tasarlanmış, bitki virüs vektörlerine entegre edilmiş ve patateste Agrobacterium infiltration ile doğrudan ilgi çekici sonojen miRNA'ya bağlanmak ve işlevini engellemek için ifade edilir.

Şekil 2 , PVX-STTM165/166 patates bitkilerini (Katahdin) damarlar boyunca yaprak laminanın abaksiyel tarafından yaprak dokularının ektopik büyümesi ile göstermektedir. Trompet şeklinde yaprak oluşumu gibi daha şiddetli fenotipler de gözlenmiştir. Buna karşılık PVX kontrol tesislerinde fenotipik anormallik gözlenmedi. Bu sonuçlar, VbMS sisteminin tetraploid patates bitkilerinde endojen miRNA fonksiyonunu bastırmada etkili olduğunu ve PVX-VbMS sisteminin spesifik miRNA'lar?...

Watch this Scientific Journal Video about Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato. at JoVE.com

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

potato-virus-x-based-microrna-silencing-vbms-in-potato

Research

JoVE Journal

Environment

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

3.0K Görüntüleme.  Texas A&M University System. Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Video: Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Bilgisayar simülasyonları ile fotobiyoreaktörler içinde Mikroalgler Büyüme teşvik için Baca Gazı ayarlarını optimize

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Çevre

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Küçük moleküllere steril koşullarda bitki yanıt-e doğru değerlendirmek için Hydroponic sistemi esnek bir düşük maliyetli

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Müstakil yaprak özendirme, Çiğneme böcek Manduca Sexta tarafından Infestation sırasında patates gen Ifade çalışmaları basitleştirmek için

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Saf Yaprak Döken Standlarda Üç Farklı Yöntem Kullanılarak Yaprak Alan İndeksi Tahmini

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&ndash;Environment Interactions

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating a knowledge gap. To meet the challenge of improving crops to feed the growing global population, this gap must be bridged.
Physiological traits are considered key functional traits in the context of responsiveness or sensitivity to environmental conditions. Many recently introduced high-throughput (HTP) phenotyping techniques are based on remote sensing or imaging and are capable of directly measuring morphological traits, but measure physiological parameters mainly indirectly.
This paper describes a method for direct physiological phenotyping that has several advantages for the functional phenotyping of plant&#8211;environment interactions. It helps users overcome the many challenges encountered in the use of load-cell gravimetric systems and pot experiments. The suggested techniques will enable users to distinguish between soil weight, plant weight and soil water content, providing a method for the continuous and simultaneous measurement of dynamic soil, plant and atmosphere conditions, alongside the measurement of key physiological traits. This method allows researchers to closely mimic field stress scenarios while taking into consideration the environment&#8217;s effects on the plants&#8217; physiology. This method also minimizes pot effects, which are one of the major problems in pre-field phenotyping. It includes a feed-back fertigation system that enables a truly randomized experimental design at a field-like plant density. This system detects the soil-water-content limiting threshold (&#952;) and allows for the translation of data into knowledge through the use of a real-time analytic tool and an online statistical resource. This method for the rapid and direct measurement of the physiological responses of multiple plants to a dynamic environment has great potential for use in screening for beneficial traits associated with responses to abiotic stress, in the context of pre-field breeding and crop improvement.

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&#8211;Environment Interactions

This high-throughput, telemetric, whole-plant water relations gravimetric phenotyping method enables direct and simultaneous real-time measurements, as well as the analysis of multiple yield-related physiological traits involved in dynamic plant&#8211;environment interactions.

Bitki-Çevre Etkileşimlerinin Gerçek Zamanlı Fizyolojik Fenotimi için Telemetrik, Gravimetrik Platformu

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating ...