Bu çalışma Hermelin Beyin Tümörü Merkezi, Henry Ford Hastanesi tarafından finanse edilmiştir.

1. Nörosfer Kültürü için Taze Cerrahi Glioblastoma Örneğinden Tek Hücreli Süspansiyon
<ol><li>Hastaların yazılı onayı ile ve kurumsal yönergelere uygun olarak, yüksek dereceli glioma rezeksiyon ameliyatından hemen sonra hücre kültürü için tümör örnekleri toplayın.</li>
	<li>Histopatoloji ile tümör örneğinin tanısını onaylayın. Numuneyi ameliyattan itibaren 1 saat içinde işlenmek üzere hemen operasyon odasından laminer akış dokusu kültür başlığına taşıyın. NOT: Uzak bir bölgedeki ameliyatlar için tümör örneğini daha küçük parçalara bölün ve DMEM/F12 içeren bir tüpe yerleştirin (buzda tutun). Tümör ameliyattan birkaç saat sonra işlenebilir.</li>
	<li>200-500 mg doku (optimal) ile başlayarak, neşter bıçağı kullanarak tümör örneğini kıyma yapın ve 10 ml DMEM/ F12 serum içermeyen ortam içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Birkaç kez ters çevirerek karıştırın, tümör parçalarının yerçekimi ile tortulanmasını, ortamın çıkarılmasını ve gerektiğinde tekrarlanmasını bırakın.</li>
	<li>Enzymatic Doku Ayrıştırma Sokunu hazırlayın ve Çözeltiyi Yeni Durdurun.<ol>
<li>Enzymatic Doku Ayrıştırma Çözümü: 5 ml% 0.05 Tripsin-EDTA, 2.5 ml Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) kalsiyum ve magnezyum içermeyen, 2.5 ml Kollajenaz IV stok çözeltisi (kalsiyum ve magnezyumlu HBSS'de 2.000 U/ml).</li>
		<li>Durdurma Çözümü: 5 ml Tripsin inhibitör çözeltisi, 5 ml DMEM/F12, 2 μl 5.000 U/ml DNASE I (HBSS kalsiyum ve magnezyum içermeyen olarak üretilir).</li>
	</ol></li>
	<li>Ortamı çıkarın ve her 0,5 g doku için 2 ml kullanarak kıyılmış tümör örneğine Enzimatik Doku Ayrıştırma Çözeltisi ekleyin. Ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>37 °C'de bir doku kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca doku inkübatörünü inkübte edin.</li>
	<li>2 ml pipetle tritüre edin ve sindirimi durdurun veya sindirim seviyesine bağlı olarak 15-30 dakikalık başka bir inkübasyon için inkübatöre geri dönün.</li>
	<li>2 hacim stop solution ekleyerek sindirimi durdurun ve 5 ml serolojik pipet ile mekanik olarak tritüre edin.</li>
	<li>Sindirilmemiş malzemeyi 40 μm hücre süzgeçten filtreleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'daki hücreleri pelet, ardından 10 ml DMEM / F12'de 3x yıkayın.</li>
	<li>Son hücre peletini 5 ml DMEM/F12'de yeniden sür.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu yavaşça 5 ml Lenfolit-M ve pelet üzerinde 1,300 x g oda sıcaklığında 20 dakika boyunca katmanlayın.</li>
	<li>Çekirdeklenmiş hücreleri içeren arayüz katmanını 10 ml DMEM/F12 içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da peletin. Yıkamayı DMEM/F12 2 kat daha fazla tekrarlayın.</li>
	<li>Cryopreserve, elde edilen tek hücreleri, Kurtarma Hücresi Dondurma Ortamı'ndaki peletin yeniden canlandırılması, cryovials içine aliquoting, yavaş donma ve sıvı nitrojende depolanması ile daha fazla kullanım için saklayın.</li>
	<li>Kültüre, Büyüme Faktörleri (NMGF) ile desteklenmiş Nörosfer Ortamı'ndaki hücreleri yeniden dürtmek ve standart koşullar altında normal bir T25 doku kültürü şişesinde nispeten düşük yoğunlukta (<1 x10 5 hücre/ml) plaka, % 5 CO2, 37 °C, nemli doku kültürü inkübatörü (Şekil 1A).<ol>
<li>Aşağıdaki tarifi kullanarak NMGF'ye hazırlanma<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">500 ml DMEM/F12 için</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Stok çözümü</td>
					<td>hacim</td>
					<td>nihai konsantrasyon</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">N2 takviyesi (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">250 mg/ml BSA stok çözümü</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 mg/ml Gentamisin reaktifi</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x antibiyotik/antimycotic</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml EGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>1-3 hafta boyunca oluşan nörosferleri (Şekil 1B-E) bağlı hücrelerden ve döküntülerden ayırmak için taze şişelere aktarın. Her 3-4 günde bir kısmi medya değişiklikleri gerçekleştirin. NOT: Yukarıdaki protokol kullanılarak ortotopik ksenograft tümörün ayrıştırılması durumunda 1.11-1.13 arası adımlar atlanabilir.</li>
</ol>2. Glioblastoma Nörosfer Kültürü Bakımı ve Aşağı Akış Uygulamaları
<ol><li>
Ayrışma: Nörosfer kültürlerini izleyin ve her 3-4 günde bir kısmi orta değişiklikler gerçekleştirin. Şişedeki çok hücreli nörosferlerin çoğu çapı 100 μm'ye ulaştığında, tek bir hücre süspansiyonuna ayrışın:<ol>
<li>Nörosferleri içeren ortamı 15 ml'lik bir tüpe aktarın, yerçekimi nörosferleri yaklaşık 5 dakika boyunca tortuya maruzn, ortamı çıkarın ve hücre peletini 10 ml kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'de yeniden biriktirin.</li>
		<li>Hücreler yerçekimi tarafından çökelti olarak oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>7-8 ml DPBS çıkarın, ardından nörosferleri önceden yazılmış bir serolojik pipetle mekanik olarak ayrıştırın.</li>
		<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da ayrışmış hücreleri peletle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Paslanma: NMGF'de ayrışmış hücreleri (adım 2.1.) yeniden biriktirin ve gerekli şişe sayısına bölün (1:3) ve standart koşullar altında kuluçkaya yatırın. sekonder nörosferler oluşacak ve daha sonra üçüncül kürelerin oluşumu için ayrışmalıdır.</li>
	<li>
Uzun süreli kendini yenilemenin değerlendirilmesi: Nörosfer kültürü kültürde en az 2 aya eşdeğer en az 10 pasaj elde edene kadar ayrışma prosedürünü tekrarlayın.</li>
	<li>
Donma: Nörosferleri kriyoprezikasyon yapmak için, nörosferleri ayrıştırmak (adım 2.1.) ve hücre peletini Kurtarma Hücresi Dondurma Ortamı'nda, aliquot'u cryovials'ta, yavaş dondurmada ve sıvı nitrojende saklamak için yeniden depolayın.<ol>
<li>Nörosfer hücrelerini donmuş bir stoktan kültüre etmek için: hücreleri 37 ° C'de çözün ve hemen 10 ml DMEM / F12 içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Tüpü hafifçe karıştırın ve ardından hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da döndürün. Hücre peletini bir kez daha yıkayın ve NMGF'deki hücreleri yeniden biriktirin ve bir T25 doku kültürü şişesine aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İmmün sistemi baskılanmış farede intrakraniyal implant için hücre süspansiyonu:<ol>
<li>Nörosferleri ayrıştırın (adım 2.1.) ve hücre peletini kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'de yeniden biriktirin. Hemositometre ve trypan mavi dışlama kullanarak uygulanabilir hücreleri sayın.</li>
		<li>İmplant için gereken hücre sayısını hesaplayın, tipik olarak 3 x 105 hücre/fare, istenen hücre sayısını bir şişeye aktarın ve hücreleri 1.000 x g'da peletlayın.</li>
		<li>Mikrosantrifüj tüpüne hafifçe dokunarak hücre peletini implanta (5 μl/fare) uygun bir hacimde yeniden kullanın. Hücre süspansiyonu buza yerleştirin ve 2 saat içinde kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tümörojenik Glioblastoma Hücrelerinin Kült Haline Getirmede Alternatif Protokol (nörosfer kültürünün başarısız olduğu durumlar için)
<ol><li>NMGF ortamını fetal sığır serumu ile %2 FBS/NMGF son konsantrasyonuna tamamlar.</li>
	<li>
NMGF kültüründeki hücrelerden başlayarak:NMGF şişesinden (Şekil 1F) uygulanabilir hücreleri hasat edin, % 2 FBS / NMGF'de yeniden biriktirin ve normal bir T25 doku kültürü şişesinde nispeten düşük yoğunlukta (<1 x10 5 hücre / ml) plaka, ve standart koşullar altında kültür, 5% CO2, 37 ° C, nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörü (Şekil 1G).</li>
	<li>
Donmuş hiç kültüre sahip olmayan hücrelerle başlayarak (adım 1.14.): Hücreleri çözün, serumsuz ortamda yıkayın ve % 2 FBS / NMGF'de plaka yıkayın ve adım 3.2'de açıklandığı gibi kültür. Uygulanabilir hücrelerin %2 FBS/NMGF'ye aktarılmasına kadar 3 gün boyunca NMGF'de kültleme, farklılaştırılmış hücreleri önceden seçmeye bir alternatiftir.</li>
</ol>4. İmmünohistokinetri ile Nörosferlerin Morfolojik ve Moleküler Analizi
<ol><li>Çoğu yüzen çok hücreli sferoid 100 μm çapa ulaşana kadar nörosferleri kültüre edin.</li>
	<li>Kültür şişelerini inkübatörden çıkarın ve hemen nörosferleri peletleyin, ortamı çıkarın ve peleni bozmadan 10 ml DPBS ekleyin. DPBS'yi çıkarın, %10 nötr tamponlu formalin içinde yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Küreselleri pelet, % 30 etanol resuspend ve 30-45 dakika kuluçka.</li>
	<li>% 30 etanolünü% 50 etanol ile değiştirin, 15 dakika kuluçkaya yatır ve taze% 50 etanol ile değiştirin, 30 dakika daha kuluçkaya yatır.</li>
	<li>%70 etanol ile tekrarlayın (adım 4.4.).</li>
	<li>Her biri 10-20 dk iki değişiklik% 95 etanol ile değiştirin ve küreseller parlak beyaz ve yoğunlaşına kadar mutlak etanol ile tekrarlayın.</li>
	<li>Lens kağıdından küçük bir filtre kağıdı konisi yapın ve bir beherde küçük bir huni içine yerleştirin. Lens kağıdını mutlak alkolle ıslatın.</li>
	<li>Peletin taze% 100 etanol ile hafifçe gevşetin, fazla etanol dökün ve küreselleri lens kağıt koniden dökün, koninin ucuna gittiklerinden emin olun. Tüpü ek mutlak etanol ile durulayın ve kalan küreselleri lens kağıdı koniden dökün.</li>
	<li>Kağıt konisini huniden çıkarın ve küreselleri koninin altına dikkatlice hareket ettirelim. Kağıdı bir kareye katlayın ve küresellerin mümkün olduğunca güvenli bir şekilde kapalı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Paketlenmiş nörosferleri bir kasete aktarın ve otomatik bir doku işlemcisine aktarın.</li>
	<li>Otomatik doku işlemcisini aşağıdaki gibi programlayın: mutlak etanol, 10 dk, ksilen, 15 dk (2x), parafin, 10 dk (4x).</li>
	<li>Kaseti işlemciden çıkarın ve bir parafin gömme sisteminin ısıtılmış kısmına yerleştirin. Tüm yüzeyin parçalardan, tozdan veya diğer döküntülerden arındırığından emin olun ve tüm parafinleri ısıtan kuyulardan sifonlayın. Sıcak temiz parafinsiz kümesler ve ısıtılmış bir baz kalıba az miktarda parafin ekleyin.</li>
	<li>Kaseti açın, paketi çıkarın ve gömme sisteminin ısıtılmış kısmına yerleştirin. Sferoidler görünene kadar kağıt konisini dikkatlice açın. Önceden ısıtılan önps ile malzemenin mümkün olduğunca çoğunu toplayın ve baz kalıptaki sıvı parafinlere aktarın.</li>
	<li>Mümkün olduğunca çok sferoid almak için gerektiği gibi tekrarlayın. Doku kağıdını, bloğa herhangi bir kağıt almadan kalan küreselleri toplamak için etanol ile silinmiş önceden ısıtilmiş temiz bir jiletle hafifçe kazıyın.</li>
	<li>Sıcak kümelerle herhangi bir küresel kümeyi dikkatlice ayırın. Küreselleri köşelerden tekdüze bir merkezi katmana taşıyın. Küreselleri yerinde sabitlemek için temel kalıbı soğutma alanına taşıyın, kaseti ekleyin, parafinle yavaşça doldurun ve iyice soğutun.</li>
	<li>Nörosfer parafin bloğu normal kesit ve immünostokimya için kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li><li>Ignatova, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro.">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756-760 (2006).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+implications+of+CD133-positive+and+CD133-negative+cells+in+glioblastomas.">Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas.</a> Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).</li><li>Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSEA-1+is+an+enrichment+marker+for+tumor-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma.</a> Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).</li><li>deCarvalho, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliosarcoma+stem+cells+undergo+glial+and+mesenchymal+differentiation+in+vivo.">Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo.</a> Stem Cells. 28, 181-190 (2010).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Laks, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+Formation+Is+an+Independent+Predictor+of+Clinical+Outcome+in+Malignant+Glioma.">Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).</li><li>Gunther, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-derived+stem+cell-enriched+cultures+form+distinct+subgroups+according+to+molecular+and+phenotypic+criteria.">Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria.</a> Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).</li><li>Fael Al-Mayhani, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+derivation+and+propagation+of+glioblastoma+cell+lines+that+conserves+the+molecular+profile+of+their+original+tumours.">An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours.</a> J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).</li><li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens.">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li><li>Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+implications+of+plasticity+of+the+cancer+stem+cell+phenotype.">The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Pietras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells in tumor heterogeneity.</a> Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).</li><li>Lomonaco, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells.">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li></ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Uygun enzymatik tümör hücresi ayrışması bu protokolde kritik bir adımdır. Doku, 37 °C'de hücre ayrıştırma çözeltisinde inkübasyondan önce, en az 30 dakika boyunca, dokunun mekanik olarak üçe alınması ve ayrışma uzantısının doğrulanması gerektiğinde iyice kıyılmalıdır. Doku uyum derecesine bağlı olarak, kuluçka, tek hücrelere ayrışma işlemini tamamlamak için gerektiğinde 15-30 dakika daha uzatılabilir. Hücre canlılığının azalması nedeniyle 1 saatten uzun süre ayrışma çözümünde inkübasyon önerilmez. Optimal başlangıç dokusu miktarı 200-500 mg olmasına rağmen, bu protokol 50 mg kadar az tümör dokusundan başarılı nörosfer kültürlerine yol açmıştır.
Serumsuz NMGF seçici bir ortamdır ve tümörün büyük kısmını oluşturan neoplastik hücrelerin bir yüzdesi ve konak hücreler hayatta kalamazken, diğerleri kaplamadan sonra tedavi edilen şişeye bağlanacaktır. 1-3 hafta boyunca oluşacak nörosferlerin (Şekil 1B-E) farklılaşmış tümör hücrelerinden ve döküntülerinden ayrılmak için taze şişelere aktarılması kritik öneme sahiptir.
GBM hücreleri enzimmatik olarak ayrışır ve hiçbir zaman kültüre edilmez (adım 1.10), nörosfer kültürünün başarısız olması durumunda, alternatif medyada kültüre hücrelerin yedek kaynağı olarak kriyoprezer olarak saklanabilir. Bu tür donmuş stoklardan nörosfer kültürlerinin yanı sıra% 2 FBS / NMGF'de büyüyen monolayer hücrelerden başarıyla elde ettik.
Kavramsal olarak, "kanser kök hücresi" devam eden bir çalışmadır ve bu gelişmekte olan alan ek açıklamalardan yararlanacaktır, çünkü klinik etkileri, özellikle tümör heterojenliği, plastisite ve tedaviye direnç oluşturmada önemli ölçüde19,20. Nörosfer kültürleri, hastaya özgü GBM hayvan modelleri üretmek için hayati öneme sahip olmasının yanı sıra, büyüme faktörlerine yanıt olarak hücre sinyalizasyonunda değişiklik ve gen ekspresyonu, hipoksi ve farmakolojik ajanlar11,21gibi in vitro çalışmalar için de değerlidir. Tüm küreyi etiketleme ve görüntülemenin daha yaygın yöntemi ile ilgili üstün hücre altı lokalizasyonu nedeniyle, immünofizyömi11tarafından protein ekspresyasyonu ve çeviri sonrası modifikasyonları incelemek için 3D mimariyi koruyarak formalin sabit ve parafin gömülü nörosferlerin kesitlerini kullanmayı tercih ettik.
Yetişkin memeli beyninden elde edilen nörosferlerdeki tüm hücrelerin kök hücre olmadığı gösterilmiştir22. Benzer şekilde, GBM tümörlerinden kültürlenen nörosferler, daha farklı kanser progenitör hücrelerinin varlığı ve yüksek hücre yoğunluklarında ortaya çıktığı bilinen kendi kendine toplama nedeniyle klonal değildir23Bu yöntemin bazıları tarafından bir sınırlaması olarak kabul edilir. Nörosferler22olarak geçici olarak büyüyebilen sadece progenitörlerin aksine, uzun süreli kendi kendini yenileyen kök hücreler için zenginleşmeyi tercih etmek için, birincil nörosferler ikincil nörosfer oluşumu için ayrışır ve kök hücrelerde zenginleştirilmiş bir popülasyonun göstergesi olan sürekli kültürde kabaca 2 aya eşdeğer en az 10 pasaj için daha fazla geçiş yapılır22. Deneyimlerimize göre, bu işareti elde eden GBM nörosfer kültürleri süresiz olarak nörosfer olarak genişletilmeye devam edebilir. Tümör derecesi önemlidir, çünkü sırasıyla GBM'lerden ve anaplastik astrositomalardan, WHO sınıf IV ve III'ten başarılı kültürler elde ettik, ancak alt dereceli gliomalardan elde etmedik.
Glioblastoma hücrelerini kültlemenin en yaygın yöntemi, % 10 FBS ile desteklenmiş geleneksel büyüme ortamında, orijinal tümörlerden önemli genomik ve fenotipik ayrışmaya yol açar 4. Öte yandan, nörosfer kültürleri kanser kök hücre fenotipi4sunan kararlı ve uzun vadeli bir hücre kaynağıdır. Nörosfer yöntemi, bu yöntemin ana zayıflığını temsil eden tüm yüksek dereceli astrositom örnekleri için başarılı olmamasına rağmen, ortotopik fare ksinograft modelleri için uzun vadeli kültürlerde CSC'nin zenginleştirilmesi için giderek daha popüler hale gelmiştir. Ebeveyn tümörlerinin moleküler özelliklerinin nörosfer oluşumunu nasıl etkileyebileceğini anlamaya yönelik çalışmalar devam etmektedir. "Omics" bilgilerinin erişilebilirliği ve potansiyel hedefli tedavilerin sayısının artmasıyla beslenen kişiselleştirilmiş tıp çağına ilerlerken, hastaya özgü GBM modellerine sahip olmanın önemli avantajları göz önüne alındığında, kültür yüksek dereceli gliomalara pratik alternatif yöntemlerin araştırılması ve ardından kapsamlı doğrulama verilir.

WHO sınıf IV astrositom olan Glioblastoma (GBM), en yaygın ve agresif primer beyin tümörüdür. Nöral kök hücre (NSC) belirteçlerinin ekspresyotiği, uzun süreli kendini yenileme ve astrositik belirteçleri ifade eden vetümörünbüyük kısmını oluşturan daha farklı hücrelere yol verme potansiyeli gibi "kanser kök hücresi" (CSC) özellikleri sergileyen hücreler de dahil olmak üzere gbm tümör hücreleri tarafından çeşitli gelişimsel fenotipler benimsenmiştir. KSS moleküler kimliği ve klinik etkileri ile ilgili açıklama hala gerekli olmakla birlikte, mevcut çalışmanın odak noktası KSS'nin operasyonel tanımıdır: uzun süreli kendini yenileme in vitro ve immün sistemi baskılanmış kemirgenlerde ortotopik implantasyon üzerine orijinal tümörü ayırt etme ve çoğaltma yeteneği.
Glioblastoma hücreleri on yıllardır% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren geleneksel ortamda kültürlenmiştir ve piyasada bulunan birkaç yüksek geçişli serum kültürlü GBM hücre hatları immün sistemi baskılanmış kemirgenlerde tümörijeniktir, ancak orijinal tümörden önemli genomik ve moleküler ayrışma vardır4, klinik olarak ilgili modeller olarak kullanımlarını sınırlar. Daha yakın zamanda, EGF ve bFGF'ye duyarlı kök/progenitör fenotipli hücreler GBM2'detanımlanmıştır. Daha sonra, ayrışmış GBM tümör örnekleri serumsuz bir ortamda kültürlendi3, başlangıçta nöral kök hücrelerin yetişkin memeli beyninden seçimi ve genişlemesi için formüleedilmiştir 5. Bu kültür koşulları, çoğu nonneoplastik ve daha farklı tümör hücre popülasyonlarının büyümesini engellerken, kök ve progenitör hücrelerin yüzen çok hücreli sferoidler veya nörosferler olarak büyümesini destekler3, yetişkin memeli nöral kök hücrelerin davranışını takliteder 5. Büyüme faktörleri (NMGF) ile desteklenmiş nörosfer ortamında veya %10 FBS ile desteklenmiş geleneksel büyüme ortamında kültürlenen birincil GBM hücrelerinin kapsamlı bir şekilde yan yana karşılaştırılması, GBM nörosferlerinin tümörojenik olduğunu, çok satırlı farklılaşma potansiyeli sunduğunu ve düşük pasajlarda tümörijenik olmayan ve geç pasajlarda orijinal tümörlerden önemli ölçüde ayrılan% 10 FBS kültürlerinin aksine orijinal tümörün genotipini koruduğunu ortaya koydu4.
CSC'nin, putatif CSC işaretleyici CD133'ün ifadesine dayanarak hücre sıralama yoluyla ayrışmış GBM tümörlerinden izole edilmesi de önerilmiştir6,7, ancak daha fazla çalışma, CSC fenotipinin bu tür belirteçlerin ifadesiyle kesin olarak ilişkili olmadığını gösterdi8-10, bu strateji için ilk hevesi azaltırken, yeni belirteçler hala test edilmektedir10. KSS'yi tanımlayan doğrulanmış bir işaretleyici kümesinin bugüne kadarki kullanılamaması, bu hücrelerin klinik öncesi çalışmalar için büyük ölçekli amplifikasyonu hedefiyle birlikte, hücre sıralamanın rutin CSC ile zenginleştirilmiş kültürler için pratik olmayan kullanımını işlemez hale getirir. NMGF'de nörosfer olarak büyüme yeteneği ile seçilen GBM hücreleri, sinirsel kök hücre belirteçlerini her zaman ifade eder. Sox2 ve nestin'in nörosfer kültürlerinde her yerde ifade edildiğini, CD133 proteininin ise GBM nörosferlerinin bir alt kümesinde bulunduğunu gözlemledik (yayınlanmamış veriler ve referans11).
Çeşitli laboratuvarlar, büyüme faktörleri 3 ,4,11-14ile desteklenmiş serumsuz ortamda aynı genel enzmatikayrışma ve kültleme yaklaşımını kullanarak glioblastoma tümörlerinden nörosfer kültürlerini takipederken,diğer meslektaşları gbm örneklerinden uzun vadeli nörosfer kültürlerini başarı olmadan büyütme girişimleri bildirmektedir. Burada sunulan yüksek dereceli gliomaların enzmatik ayrışması ve nörosfer kültürü için genel yöntem, yukarıdaki yayınlarda özetlenenlere benzer. Protokolü, 100 GBM'den fazla numuneyi ayrıştırma ve kültleştirme deneyimimize dayanarak optimize ettik. Burada sunulan protokolü uygulayan taze GBM örneklerinden uzun vadeli nörosfer kültürleri elde etmenin verimliliği% 40'ın üzerindedir, verimlilik verilerini gösteren birkaç raporabenzer3,15, EGF ve bFGF'nin ECMproteini 16ile kaplanmış yüzeylerde monolayer olarak serum içermeyen ortamda sürekli veya aralıklı olarak hücrelerin kültleşmesi gibi alternatif protokollerin araştırılmasına yol açmaktadır. Nörosfer kültürleri hala GBM tümörlerinin moleküler özelliklerini ve tümörijenik potansiyeli korumak için en doğrulanmış ve giderek daha popüler bir yaklaşımdır3,4,11-14, bu nedenle yaklaşımımız önce nörosfer kültürlerini denemektir, hayvan modellerinde kullanılabilecek GBM tümörlerinin temsilini artırmak için uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosferler oluşturamayan GBM hücrelerini kültleme için alternatif yöntemleri birlikte test ederken ( Şekil1). Burada GBM'lerden nörosferleri kültleme protokolü sunuyoruz. Nörosfer oluşturamayan hücreler için, büyüme ortamında basit bir değişiklik gösteriyoruz, çünkü tümörosfer olmayan hücrelerden GBM'ler oluşturan, umut verici sonuçlar veren ve hala kapsamlı doğrulamadan geçen ilk girişim olarak basit bir değişiklik gösteriyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin - EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14170-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type 4</td>
			<td style="width:143px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Albumin from Bovine Serum, cell culture grade</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lympholyte-Mouse</td>
			<td style="width:143px;">Cedarlane Laboratories Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">CL5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:143px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">245-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histoplex Tissue Cassettes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-146-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#160;Supplement</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KnockOut D-MEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stem Pro Neural Supplement&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>A1058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in  clinically relevant animal models and 3d immunochemistry

Astrositomların en yaygın ve agresif formu olan glioblastomalar, tedaviye refrakter ve moleküler olarak heterojendir. Ebeveyn tümörlerinin genomik profilini koruyan hücre kültürlerini, hastaya özgü in vitro ve in vivo modellerinde kullanılmak üzere oluşturabilme yeteneği, her tümörün moleküler özelliklerine göre uyarlanmış glioblastoma için yeni tedavilerin preklinik gelişiminde devrim yaratma potansiyeline sahiptir.
Tek hücrelere ayrışmış taze yüksek dereceli astrositoma tümörleri ile başlayarak, nörosfer testini, nöral kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu, uzun süreli kendini yenileme in vitrove ortotopik ksinograft tümörleri oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere kanser kök hücre fenotipini sunan hücreler için bir zenginleştirme yöntemi olarak kullanıyoruz. Bu yöntem daha önce önerildi ve şimdi birkaç araştırmacı tarafından kullanılıyor. 125 glioblastoma örneğini ayrıştırma ve kültleştirme deneyimimize dayanarak, burada sunduğumuz ayrıntılı protokole ulaştık, yüksek dereceli astrositomaların rutin nörosfer kültleme ve preklinik çalışmalar için tümörojenik hücrelerin büyük ölçekli genişlemesi için uygun. Bu protokolü kullanarak başarılı uzun vadeli kültürlerin verimliliği hakkında rapor veriyoruz ve nörosfer olarak büyümeyen ayrışmış glioblastoma hücrelerini kültleme için uygun fiyatlı alternatifler öneriyoruz. Ayrıca immünostokimya için nörosferler 3D mimarisini korumak için bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. GBM'lerin moleküler imzalarını ve heterojenliğini koruyan ortotopik ksinograft modelleri üretebilen CSC'lerde zenginleştirilmiş hücre kültürleri, GBM'lerin biyolojisinin incelenmesi ve potansiyel tedavilerin klinik öncesi testlerinin geliştirilmiş tasarımı için giderek daha popüler hale gelmektedir.

Yukarıda açıklanan protokolü, onaylanmış hasta onayı ile ve kurumsal yönergeler altında 125 taze cerrahi glioblastoma örneği (Şekil 1), 88 yeni tanı konmuş ve 37 tekrarlayan tümör (Tablo 2) ile ayrıştırmak ve kültüre etmek için uyguladık. Uzun vadeli nörosfer kültürleri kurma protokolünün verimliliği % 41,6 ve yeni teşhis edilen tümörler ve tekrarlayan tümörler için benzerdi (Tablo 2). Bazı GBM örnekleri için, nörosferler ilk birkaç gün içinde oluşur (Şekil 1B ve 1C), diğerleri için daha uzun kültleme süresi gereklidir (Şekil 1D ve 1E).
Nörosfer oluşumunun verimliliği, her ikisi de nörosfer kültürü kazandıran Protokol 1 ve 2'ye göre işlenen yüksek hücre yoğunluğuna (GBM1) ve tekrarlayan ve nekrotik tümörden (GBM2) elde edilen sonuçlarla örneklendir edildiği gibi, sadece dokudaki nekroz seviyesine bağlı değildi (Şekil 2).
İmmün olarak bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde her nörosfer kültürünün tümörojenik potansiyelinin test edilmesi, CSC'lerin zenginleştirilmesi için bu yaklaşımın çok önemli bir doğrulamasıdır. Daha önce açıklanan18, GBM1 ve GBM2 nörosferlerine benzer bir protokol kullanılarak, kurumsal ve IACUC hayvan bakım yönergeleri altında, bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin beyinlerine implante edilmiştir. Ksenograft tümörleri, beyin parankim ve nekroza invazyon gibi GBM'lerin morfolojik özelliklerini sunar (Şekil 2).
GBM3 ayrıştı (Şekil 1A) ve nörosfer ortamında kültürlendi (Şekil 1D ve 1E) ve% 2 FBS / NMGF (Şekil 1D, 1G ve 1H). %2 FBS/NMGF'de kültürlenen monolayer hücreler ve NMGF'de kültürlenen nörosfer hücreleri ayrıştırıldı ve Şekil 2'dekiyleaynı prosedür kullanılarak çıplak fareye aynı sayıda hücre yerleştirildi. İki preimplant kültür yöntemi arasında sağkalım, tümör büyüme dinamikleri veya morfolojide farklılık gözlenmedi (Şekil 3A-C). Tümör büyüme özellikleri test edilen en son pasaj, nörosferler için P20 ve% 2 FBS / NMGF için P10'a kadar değişmez. Sox2 de dahil olmak üzere nöral kök hücre belirteçleri% 10 FBS 3,4,11'de kültürlenen çoğu birincil GBM hücresinde küçültülürken, % 2 FBS ile desteklenmiş NMGF, Sox2 ekspresyonunun tutulmasına izin verir (Şekil 3D).
Nörosferler Protokol 4'e göre işlendi ve H&E (Şekil 4A), anti-Sox2 antikoru, nükleer lokalizasyon (Şekil 4B) ve EGFR antikoru, hücre zarı lokalizasyonu (Şekil 4C)ile etiketlendi. Bu protokol nestin, GFAP ve çoğalma işareti Ki6711ifadesinde uyaranlara bağlı değişikliklere erişmek için uygulanmıştır.
Tablo 2. GBM'lerden uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosfer kültürlerini türetmenin verimliliği.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>patoloji</td>
			<td>n</td>
			<td>Uzun süreli kendini yenileyen nörosferler sağlayan örneklerin yüzdesi (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - tedavi edilmemiş, ilk ameliyat</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - tekrarlayan</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>toplam</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Şekil 1. Taze glioblastoma cerrahi örneklerinden hücre kültürü. Taze tümörler enzmatik olarak tek hücreye ayrışır. Yoğunluk ayırma ortamından çekirdeklenmiş hücre arayüzü daha sonra NMGF ile kaplanır. Ayrışmış nörosferler NMGF'de kaplanır ve genellikle kaplamadan 1 gün sonra ölü hücreler, döküntüler, bağlı tek hücreler ve süspansiyondaki hücrelerin bölünmesi (A). Nörosfer oluşumu bazı vakalar için daha hızlıdır (B,C) ve diğerleri için daha yavaştır (D,E). Tüm nörosferler en az 10 pasaj için ayrıştırilir ve yeniden tabaklanır, % 41,6 GBM'ler uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosferler verir. Nörosfer (F) olarak büyümeyen canlı GBM ayrışmış hücreler alternatif kültür koşullarına aktarılabilir, örneğin% 2 FBS / NMGF (G, H). Çubuk (A), 100 μm, tüm görüntüler için geçerlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Şekil 2. Nörosfer üretimi ve GBM tümörlerinden ortotopik fare ksinograftları. Protokol 1 ve 2'ye göre yüksek hücre yoğunluğu (GBM1) ve yüksek nekrotik içeriğe (GBM2) sahip bir tümör örneği ayrıştırıldı ve nörosferler 1 ve 2 nolu protokollere göre 10 pasaj için kültürlendi. İmmün sistemi baskılanmış farelere 3 x 105 ayrışmış nörosfer hücresi yerleştirildi ve moribund olduğunda kurban edildi. Fare beyinleri, insan belirteçlerinin, insan mitokondrilerinin (hMit) veya büyük histocompatibility sınıfı I alt birasının (MHC-I) H&E lekeleme ve immünofizyokimya tespiti için sabit ve parafin gömülü olarak sabitlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Şekil 3. NMGF'de nörosfer veya %2 FBS/NMGF'de monolayer olarak kültürlenen GBM3 hücreleri ile intrakranially implante edilen farelerde benzer tümör büyümesi. (A) NMGF'de nörosferler veya %2 FBS/NMGF'de monolayer olarak kültürlenmiş GBM3 için Kaplan-Meier sağkalım eğrileri (her iki geçiş <10) sağkalımda hiçbir fark göstermez (n=10, p=0.7174, log-rank testi). (B) Canlı biyolüminesans görüntüleme (BLI) ile izlenen tümör büyümesi, iki grup arasındaki tümör büyüme dinamiklerinde anlamlı bir fark göstermez. (C) Tümör morfolojisi 4 GBM3 ksinograft, 2 kültür NMGF ve 2 kültürlü 2% FBS / NMGF için ayırt edilemez. Şekil 2için açıklandığı gibi MHC-I lekesi . Ölçek, 600 μm. (D) Kök hücre üreticisi Sox2 ekspresyonunu gösteren batı lekesi, ksinograft tümörlerini(A-C)başlatmak için kullanılan% 2 FBS / NMGF kültürlerinde tutulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Şekil 4. İmmünohistokmiya ile nörosfer bölümlerinde protein ekspresyonunun analizi. Nörosfer kültürleri Prosedür 4'te açıklandığı gibi formalin sabit ve parafin gömülü ve H&E (A), anti-Sox2 antikor (B) ve anti-EGFR antikor (C) ile lekelenmiştir. DAB substratı görselleştirmek için kullanıldı (B,C). Bar, 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry at JoVE.com

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

optimization-high-grade-glioma-cell-culture-from-surgical-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K Görüntüleme.  Henry Ford Hospital. Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Video: Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

Roman Bitkisel Tedaviler Değerlendirmek için Sepsis Hayvan Modeli kullanımı

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

Tıp

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Fare Servikal lenf nodu Yüksek frekanslı Ultrasonik Görüntüleme

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Için Polikistik Böbrek Hastalığında Küçük Kemirgen modelleri Ultra yüksek Saha MRI Kullanımı<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotiplendirme ve İlaç İzleme

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Fare ile Gastroözofageal Reflü Cerrahi Modelleri

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Deri Cerrahi denervasyon: Cilt Hastalıkları Fare modelleri Sinirler için Gereği Test Bir Yöntem

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

Bir Model İnsanlarda klinik İlgili ününüz Benzet

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...