Özellikle Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Moleküler Nöroşirürjik Doku Bankası için paha biçilmez araştırma materyalleri sağlayan hastalara borçluyuz. Doku Bankası'nı kuranlara, Reid C. Thompson MD'ye (baş araştırmacı), Cherryl Kinnard RN'ye (araştırma hemşiresi) ve Larry A. Pierce MS'e (yönetici) teşekkür ederiz. Histolojik hizmetler kısmen Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi (VUMC) Çeviri Patolojisi Paylaşılan Kaynağı (Vanderbilt-Ingram Kanser Merkezi'ne 5P30 CA068485 ödülü ile desteklenmektedir) tarafından gerçekleştirilmesiyle gerçeklenmiştir. Bu çalışma NINDS (1R21NS070139), Burroughs Wellcome Fonu ve VMC geliştirme fonlarından MKC'ye verilen hibelerle desteklenmiştir. MKC, Gazi İşleri Dairesi, Gaziler Sağlık İdaresi, Araştırma ve Geliştirme Ofisi, Biyomedikal Laboratuvarı Araştırma ve Geliştirme Bölümü tarafından 1 I01 BX000744-01 hibesi ile desteklenmektedir. İçerikler, Gazi İşleri Bakanlığı'nın veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmez.

1. Tümör Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması
Not: Primer ortotopik glioma ksinograftlarının kurulması ve sürdürülmesi için hasta materyali ve hayvanların kullanımı için uygun kurumsal onaylar gereklidir. Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi'nde, tanı amaçlı gerekli olandan daha fazla resected tümör materyali, bir araştırma dokusu deposu için hasta onayı ile toplanır. Örnekler randomize 5 haneli REDcap veritabanı numarası ile etiketlenir ve hastaya özgü tüm tanımlayıcılar kaldırılır. REDcap veritabanı, doku deposundaki her örnek için cinsiyet, yaş (yıl), ırk, sağkalım durumu, patoloji, kanser tedavileri, rezeksiyon yılı ve ilerleme süresini içeren düzenli klinik veriler içerir. Steriliteyi korumak ve birincil ksinograft yönteminin başarısını optimize etmek için, tüm reaktifler, buharla otoklavlanmış cerrahi aletler ve cerrahi bölge önceden monte edilmeli veya hazırlanmalıdır.
Not: Glioma örnekleri genellikle büyük miktarlarda miyelin ve döküntü içerir. Numune boyutuna bağlı olarak, miyelin ve döküntülerin yeterli şekilde giderilmesi için 4'ten fazla süreksiz gradyan tüpü kullanmak gerekebilir.
Not: İşlem, kalan veya çok az, açıkça görülebilen bir doku kalmadığında tamamlanır. Tritürasyon işlemi sırasında kabarcıkların tanıtılmasından kaçının.
Not: Ayrışmayı takiben hücre canlılığı tipik olarak %90 >. Daha düşük yükümlülükler, suboptimal doku elleçleme veya ameliyathaneden taşıma süresi, kriyoprezervasyon yöntemi veya papain ayrışma tekniği dahil olmak üzere birçok değişkeni yansıtabilir. Bununla birlikte, uygun hacimde yeterli sayıda canlı nakledilebileceği sürece, daha düşük hücresel canlılıklar hala yeterli olabilir. Her fare için 50.000-200.000 canlı hücre 2 μl hacimde implante edilir. Şırınga iğnesinin eğimli ucu nedeniyle, her enjeksiyon için şırıngaya yeterli malzemenin çekilebilmesini sağlamak için son hacme 5 μl hücre süspansiyonu eklenmelidir. Örneğin, 5 fare için 2 μl / fare enjekte etmek için son hacim 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl olmalıdır.
<ol><li>Laboratuvara taşınmak üzere buz üzerinde steril, kaplanmış bir kaba yeni resected, deidentified hasta materyali yerleştirin. Numuneyi doğrudan transplantasyon için işleyin veya sıvı nitrojende numuneyi sıvı nitrojende (aşağıya bakınız) sıvı nitrojende depolamak ve daha sonra kullanmak için kriyoprezite saklayın.</li>
	<li>Papain ayrıştırma çözeltilerini (papain çözeltisi, yıkama/proteaz inhibitör çözeltisi ve süreksiz gradyan çözeltisi) kit bileşenleri ve üretici tarafından sağlanan talimatlarla steril bir kaputta hazırlayın. Steril 15 ml polistiren konik tüpleri etiketleyin ve çözeltileri aşağıdaki gibi dağıtın:<ul>
<li>Tüp 1: 5 ml papain çözeltisi</li>
			<li>Tüp 2: 3 ml yıkama/proteaz inhibitörü çözeltisi</li>
			<li>Tüpler 3-6: Her biri süreksiz degrade çözeltisinin her biri 5 ml</li>
		</ul>
</li>
	<li>Glioma örneğini 5 ml papain çözeltisi ile tüp 1'e yerleştirin ve 10-20 dakikalık bir süre boyunca 5 ml pipetle tritüre edin.</li>
	<li>Malzemeyi 10 kez yukarı ve aşağı pipetlayın ve bir sonraki olgunlaşma döngüsünü başlatmadan önce malzemeyi oda sıcaklığında 2-3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>5 ml pipet ucunu konik tüpün altına yakın bir şekilde, her tritürasyon döngüsüyle birlikte, ucun son 2 döngü boyunca tüpün dibine değecek şekilde konumlandırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve peletin 3 ml yıkama/ proteaz inhibitörü çözeltisinde 10x yukarı ve aşağı pipet.</li>
	<li>"Yerçekimi" dağıtım hızında ayarlanmış bir pipettör ile 5 ml süreksiz gradyan çözeltilerinin (tüpler 3-6) her biri üzerine eşit miktarda süspansiyonu dikkatlice katmanlayın.</li>
	<li>Tüpleri, hızlanma hızı en düşük ayara düşürülecek ve fren kapalı olacak şekilde sallanan kova rotorlu bir santrifüje yerleştirin. Oda sıcaklığında 12 dakika boyunca 76 x g'da santrifüj. Fren kapalıyken, santrifüjleme genellikle 20 dakika sonra tamamlanır.</li>
	<li>Süpernatant çıkarın, yeniden biriktirin ve her peleti 5 ml steril dengeli tuz çözeltisinde birleştirin ve hücreleri buza yerleştirin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun bir kısmını (10-100 μl) çıkarın ve hemositometre ile trippan mavi dışlama ile canlı hücrelerin yoğunluğunu belirleyin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatant çıkarın ve hücre peletini μl başına 25.000-125.000 canlı hücre yoğunluğunda yeniden biriktirin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun yeterli hacmini 200 μl mikrosantrifüj tüpüne (PCR tüpü) aktarın ve buza yerleştirin.</li>
</ol>2. Cerrahi Bölge ve Aletlerin Hazırlanması
Not: İşlem sırasında steril cerrahi eldivenler giyilir. Her kurumun gereksinimlerine bağlı olarak cerrahi önlük, kapak ve yüz koruyucu gerekebilir.
<ol><li>Hayvan hazırlama, çalışma alanı ve hayvan kurtarma için ayrılmış bitişik alanlarla kemirgen cerrahisi için dezenfekte edilmiş bir tezgah hazırlayın.</li>
	<li>Cerrahi aletleri buharlı otoklavda sterilize edin. Daha sonra, bir hayvandan diğerine geçerken aletleri flaş sterilize etmek için sıcak bir boncuk sterilizatörü kullanın.</li>
</ol>3. İndüksiyon, Anestezi ve Analjezi
Not: Farelerin uyuşturulmasından itibaren 15 dakikayı aşan ameliyatlar bir temas ısı kaynağı gerektirir. Hipotermiyi önlemek için, farelere ameliyat öncesi ve sonrası dönemlerde bir ısı kaynağı (dolaşımdaki sıcak su battaniyesi) sağlanır. 
<ol><li>Ketamin/ksilazine kokteylini indüksiyon anestezisi için hazırlayın, böylece her fare ketamin 100 mg / kg ve ksilazine 10 mg / kg, vücut ağırlığının gramı başına kokteylin 10 μl enjekte ederek.</li>
	<li>
Tablo 1. Anestezi kokteyli.
		<table><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
					<td rowspan="2">Stok konsantrasyonu</td>
					<td colspan="3">Hazırlanacak birim </td>
				</tr>
<tr>
<td>bir fare</td>
					<td>beş fare</td>
					<td>on fare</td>
				</tr>
<tr>
<td>Ketamin</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>25 μl</td>
					<td>125 μl</td>
					<td>250 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>Xylazine</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>2,5 μl</td>
					<td>12,5 μl</td>
					<td>25 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>İsotonic salin</td>
					<td></td>
					<td>223 μl</td>
					<td>1.113 μl</td>
					<td>2.225 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td colspan="2">toplam</td>
					<td>250 ul</td>
					<td>1.250 μl</td>
					<td>2.500 μl</td>
				</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Stok çözeltisini (10 mg/ ml) 1:20 steril, pilojen içermeyen suda seyrelterek analjezi için ketoprofen çözeltisi hazırlayın, böylece her fare, çözeltinin gram vücut ağırlığı başına 10 μl enjekte ederek 5 mg / kg'lık bir doz alır.</li>
	<li>Presurgical ağırlığı tartın ve kaydedin. Bireysel fare ağırlıkları değişir, ancak genellikle 18-22 g arasında değişir.</li>
	<li>Bir insülin şırınnası ile intraperitoneal alana fare vücut ağırlığının gramı başına 10 μl ketamin / ksilazin kokteyli enjekte edin. Örneğin, 20 g fare için 200 μl enjekte edin.</li>
	<li>Farenin arka bacağın ayak parmağı çimdikle tamamen uyuşturulup uyuşturulmadığını belirleyin. Farenin artık kıstırıktan çekilmemeleri genellikle 3-5 dakika sürer.</li>
	<li>Bir insülin şırınnası ile kanadın gevşek cildine gram fare vücut ağırlığı başına 10 μl ketoprofen çözeltisi enjekte edin. Örneğin, 20 g fare için 200 μl enjekte edin.</li>
	<li>Saç kesme makası ile kafatasının üzerinde saç tıraşı yapın, açıkta kalan kafa derisini pamuk ucu aplikatörü kullanarak povidone-iyotla ovalayın ve ardından bir alkol pedini silin. Bu adımları tekrarlayın, povidone-iyot ovma ve alkol silme, iki kez daha.</li>
	<li>Farenin gözlerine oftalmik merhem uygulayın.</li>
	<li>Steril bir neşter bıçağı ile kulakların arkasından gözlerin hemen önüne uzanan 1 cm'lik bir orta çizgi kesiği yapın.</li>
	<li>Fareyi bir diseksiyon dürbününün altına yerleştirin ve dikiş çizgilerini tanımlamak için kafatasını ortaya çıkarın. Matkapla dairesel hareketler kullanarak, bregma'ya 2,5 mm yanal ve koronal dikişe 1 mm posterior bir çapak deliği ortala.</li>
</ol>4. intrakraniyal transplantasyon
Not: 2,5 μl'yi aşan enjeksiyon hacimleri fareler için ölümcül olabilir.
<ol><li>Üst kesici dişleri kesici diş çubuğunun üzerine bağlayarak ve burun kelepçesini uygulayarak fareyi stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin, böylece kafatası nötr bir pozisyonda sıkıca tutulur.</li>
	<li>Süspansiyonu karıştırmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için stereotaktik manipülatörün prob tutucusuna kenetlenmiş 10 μl Hamilton şırıngasına birkaç kez bir mikrosantrifüj tüpündeki hücrelerin 5-10 μl'lik kısmını yukarı ve aşağı çekin. Şırınnanın 2 μl (bir hayvana enjekte etmek için yeterli hacim) ile yüklenmesi için pistonu bastırın.</li>
	<li>Çapak deliğini açığa çıkarmak için cilt kesisinin yanal kenarını çekin ve mikromanipülatör ile iğneyi çapak deliğine sokun, böylece eğimli kısım kafatası yüzeyinin hemen altındadır.<ol>
<li>İğneyi 3 mm ilerletin ve enjeksiyon için bir alan oluşturmak için iğneyi 0,5 mm çekin.</li>
			<li>Pistonu yavaşça 30 sn'nin üzerinde ilerletin ve ardından iğnenin beyinde 2 dakika daha kalmasına izin verin. 0,5 mm yükselerek ve iğneyi beyinden çıkarmadan önce 30 saniye daha bekleyerek iğneyi yavaş yavaş çekin.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın ve yarayı bir otoklapla kapatın.</li>
	<li>Vücut sıcaklığını korumak ve mukoza zarlarının ve açıkta kalan dokuların (ayak tabanları) solunum düzenini ve rengini sürekli izlemek için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin.</li>
	<li>Fareyi anesteziden (sternal ve ambülatör) tamamen iyileştikten sonra steril bir mikroisolatör kafesine yerleştirin ve hayvan barınma tesisine geri verin.</li>
</ol>5. İmplant sonrası Hayvan Bakımı ve Gözlemi
Not: Tümör engraftasyonunun ve infiltratif büyümenin en güvenilir göstergesi, kambur duruş ve pürüzlü saç önlüğü gelişimi eşliğinde kademeli, sürekli kilo kaybıdır. Nadir durumlarda, ataksi, parez ve nöbetleri içeren nörolojik eksiklikler not edilir. Ortotopik primer ksinograftlar oldukça invazivdir ve uzun bir süre boyunca gelişir. Fareler tipik olarak nakilden 3-6 ay sonra tümör büyümesi belirtileri gösterir.
<ol><li>Kesi yerinde yiyecek ve su alımı, davranış, tımar ve enfeksiyon belirtileri için her gün ortotopik ksinograftları olan fareleri gözlemleyin.</li>
	<li>Ameliyat sonrası ağrı veya sıkıntı görülürse ketoprofen (deri altından 5 mg/ kg, günde 1-2x) verin.</li>
	<li>Ameliyattan 8-10 gün sonra otoklapları çıkarın.</li>
	<li>Fareleri haftalık olarak tartın.</li>
	<li>Tümör engraftment belirti ve semptomlarını izleyin.</li>
</ol>6. Tümör Hasadı
Not: Bu yöntemle, ilk koronal dilim (#1) koku ampullerinin arka yönünü ve frontal lobların ön yönünü içerir. Engrafted tümör en çok sonraki 3 koronal dilimin sağ yarımküresinde (dilim #2, #3 ve #4) bol miktarda bulunur ve enjeksiyon görüşü rutin olarak koronal dilim #3 bulunur. Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak, malzeme tümör geçişi, donmuş doku bölümleri, formalin sabit parafin gömülü doku bölümleri, ayrışmış dokunun akış sitometrisi, hücre kültürü veya DNA, RNA veya protein analizi için lizatlar için kullanılabilir. Tümörün bazı bölümleri% 80-95 arasında değişen hücre canlılığı ile gelecekteki ihtiyaçlar için kriyopreziserved edilebilir.
<ol><li>Fareleri uzun süre karbondioksite maruz kalarak ötenazi ve ardından servikal çıkık.</li>
	<li>Beynin tabanındaki ötenazili farelerin kafasını daha büyük bir çift cerrahi makasla (foramen magnum seviyesi) çıkarın ve kafatasını tamamen ortaya çıkarmak için deriyi kesiden ileri çekin.</li>
	<li>Beyni çıkarın.<ol>
<li>Kafatasının sol tarafındaki oksipital kemiği kesmek için sol dış işitsel meatus seviyesine foramen magnum'un yanal yönüne bir çift ince cerrahi makas yerleştirin. Sağ tarafta aynı kesimi gerçekleştirin.</li>
			<li>Koronal düzlem boyunca oksipital kemiği bir dış işitsel meatustan diğerine kesin ve beyinciği ortaya çıkarmak için kemiği çıkarın.</li>
			<li>Burun kemik plakalarını gözlerin arasından kesin.</li>
			<li>Sagittal sütür boyunca burun kemik plakalarından bregmaya kadar arka arka kesim yaparak sagittal sütürünü kesin. Lambda'dan bregma'ya kadar ön kesim yaparak sagittal dikiş boyunca orta çizgi kesisini tamamlayın.</li>
			<li>Kafatasının beyne herhangi bir dural yapışıklıklarını yırtmak için her iki taraftaki sagittal açıklık boyunca ince bir çift tokanın ucunu dikkatlice yerleştirin ve ardından beyni ve koku ampullerini dorsally maruz bırakmak için iki kafatası yarısını yanal olarak soyun.</li>
			<li>Herhangi bir yapışıklık serbest için koku ampulleri ve kafatasının ventral yönü arasında tokaları kaydırın.</li>
			<li>Beynin geri çekilmesini sağlamak için kafatasını geriye doğru eğin, böylece optik ve diğer kraniyal sinirler açığa çıkar. Beyni steril PBS içeren bir tabağa salmak için kraniyal sinirleri koparın.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Tartım spatulası olan beyni matris dilimleyiciye aktarın ve jiletlerle 2 mm koronal dilimler oluşturun.</li>
	<li>Koronal dilimleri daha fazla görsel inceleme ve daha fazla doku işleme için steril PBS içeren bir tabakta düzenleyin.</li>
</ol>7. Tümör Kriyoprezervasyonu
<ol><li>Kriyoprezervasyon ortamının bir stok çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>50 ml çoğalma takviyesi, 5 ml 100x penisilin ve streptomisin çözeltisi ve 450 ml bazal ortama% 0.2 heparin 450 μl ekleyin.</li>
			<li>Stok çözeltisi 4 °C'de ışıktan korunur.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Kriyoprezervasyon ortamının çalışma çözümünü hazırlayın.<ol>
<li>47,5 ml kriyoprezervasyon ortamı ve 2,5 ml steril DMSO'yu 50 ml polipropilen konik tüpte birleştirin ve iyice karıştırın.</li>
			<li>Her bir cryovial için aliquot 1.0 ml çalışma çözeltisi ve ışıktan korunan 4 ° C'de saklayın.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Xenografted beynin bir 2 mm'lik koronal dilimini buz üzerinde kriyoprezervasyon ortamı içeren bir cryovial içine yerleştirin.</li>
	<li>Şişeyi sıkıca kaplayın ve -80 °C'de bir dondurucu kaba yerleştirin. Ertesi gün cryovial'ı daha uzun depolama için sıvı bir azot tankına aktarın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials.">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. 84, 1424-1431 (2001).</li><li>Witt Hamer, D. e., C, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+profile+of+human+malignant+glioma+is+altered+early+in+primary+cell+culture+and+preserved+in+spheroids.">The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids.</a> Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+in+vivo+and+in+vitro+fates+of+glioblastoma+cell+subpopulations+with+amplified+EGFR.">Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR.</a> Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).</li><li>Daniel, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+xenograft+model+of+small-cell+lung+cancer+reveals+irreversible+changes+in+gene+expression+imposed+by+culture+in+vitro.">A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro.</a> Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).</li><li>Piaskowski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+cells+showing+IDH1+mutation+cannot+be+propagated+in+standard+cell+culture+conditions.">Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. 6, 425-436 (2006).</li><li>Sasai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+pathway+activity+is+down-regulated+in+cultured+medulloblastoma+cells:+implications+for+preclinical+studies.">Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies.</a> Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).</li><li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+orthotopic+transplantation+of+fresh+surgical+specimen+preserves+CD133++tumor+cells+in+clinically+relevant+mouse+models+of+medulloblastoma+and+glioma.">Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma.</a> Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).</li><li>Suggitt, M., Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+preclinical+anticancer+drug+screening:+empirical+to+target-driven+approaches.">50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches.</a> Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans:+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved.">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).</li><li>Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell-directed+therapies:+recent+data+from+the+laboratory+and+clinic.">Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic.</a> Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).</li><li>Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+in+vitro+and+in+vivo+applications+of+primary+human+glioblastoma+multiforme+(GBM)+xenograft+models+for+translational+biology+studies+and+drug+discovery.">Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery.</a> Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).</li><li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice:+new+tools+to+tackle+old+problems.">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59, 1155-1168 (2011).</li><li>Sarangi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+inhibition+of+the+Hedgehog+pathway+in+established+malignant+glioma+xenografts+enhances+survival.">Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival.</a> Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).</li><li>Valadez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Hedgehog+pathway+responsive+glioblastomas+by+isocitrate+dehydrogenase+mutation.">Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation.</a> Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).</li><li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma.">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).</li><li>Ehtesham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-dependent+activation+of+the+hedgehog+pathway+in+glioma+progenitor+cells.">Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells.</a> Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).</li><li>Kelly, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglioma+cell+lines+containing+t(1;19)(q10;p10.">Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10.</a> Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).</li><li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells.">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li><li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD/LtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells.">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li></ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Kültürlü hücre hatları, ksinograftlar ve genetik olarak tasarlanmış fareler gliomaları modellemek için en yaygın yöntemlerdir ve her model sistemi için farklı faydalar ve sınırlamalar vardır3,13,14. Primer ortotopik glioma ksinograftlarının ilgili faydaları arasında yaygın gliomaları tipleyen infiltratif büyüme ve genetik değişikliklerin tutulması ve kültürlü glioma hücrelerinde bakımı son derece zor olabilecek önemli sinyal mekanizmaları sayılabilir. Örneğin, iso...

Malign gliomalar, beyinde ve bazen omurilikte meydana gelen merkezi sinir sisteminin primer glial tümörleridir. Gliomalar Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından astrositlere, oligodendrositlere veya ependymal hücrelere histolojik benzerliğe göre sınıflandırılır ve daha sonra malignitenin patolojik özellikleri için sayısal olarak (I ila IV) derecelendirilir. En sık görülen histolojik alt tipler astrositomlar, oligodendrogliomalar ve karışık oligoastrositomlardır. WHO'nun II ila IV sınıflarını kapsayan malign gliomalar invaziv büyüme ve mevcut tedavilere yeniden hesaplama ile karakterizedir. Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık 15.750 kişiye malign glioma tanısı konulmaktadır ve tahmini 12.740 hasta bu hastalığa yenik düşmektedir. Bu istatistikler, malign gliomaların özellikle ölümcül doğasını ve gelişmiş terapötik etkinlik için önemli ihtiyacı vurgulamaktadır.
Kanser modelleri tümör biyolojisi ve tedavilerinin araştırılması için gereklidir. İnsan kanser hücre hatları in vitro manipülasyonlar ve in vivo ksinografting çalışmaları (ikincil ksinograftlar) için önemli bir ilk adımı temsil eder1. Bununla birlikte, standart kanser hücre kültürleri, ikincil ksinograftlarda geri yüklenemeyen fenotipik ve genotipik dönüşüm2-4'e tabidir5. Ayrıca kanser hücre kültürlerinde izoitrat dehidrogenaz(IDH)mutasyonları6, farklı kök hücre popülasyonları7 ve anahtar sinyal yollarına bağımlılık8 gibi genetik değişiklikler kaybedilebilir. Genomik profiller kanser küre kültüründe daha iyi ölçüde korunabilir, ancak yine de primer tümörlerin genotipini tam olarak yansıtamaz2,3. Doğrudan ortotopik transplantasyon in vitro kültürün etkilerini olumsuzlar, uygun bir mikroçevrme sağlar ve tümör başlatan hücrelerin bütünlüğünü korur9,10. Bu nedenle, birincil ksinograftlar, gelecekteki klinik çalışmaların rasyonel tasarımına yardımcı olmak için hedeflenen ajanları titizlikle test etmek için güçlü ve ilgili bir preklinik modeli temsil eder5,11,12.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Phosphate buffered saline
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			14040-133
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Papain dissociation system
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Worthington Biochemical Corp.
			</td>
			<td style="width:140px;">
			LK003150
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Trypan blue solution 0.4%
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			15250061
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Ketamine HCl
			</td>
			<td rowspan="4" style="width:142px;">
			Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Xylazine HCl
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Ketoprofen
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Ophthalmic ointment
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Povidone-iodine
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:140px;">
			190061617
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Cryopreservation medium and proliferation supplement
			</td>
			<td style="width:142px;">
			StemCell Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			05751
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			0.2% Heparin sodium salt in PBS
			</td>
			<td style="width:142px;">
			StemCell Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			07980
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Penicillin-streptomycin
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			15140-122
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Dimethyl sulfoxide
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:140px;">
			D6250-5X10ML
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice
			</td>
			<td style="width:142px;">
			The Jackson Laboratory
			</td>
			<td style="width:140px;">
			005557
			</td>
			<td style="width:97px;">
			NSG mice
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Anti-human vimentin antibody
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Dako
			</td>
			<td style="width:140px;">
			M7020
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Use 1:200 to 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Anti-human IDH1 R132H antibody
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Dianova
			</td>
			<td style="width:140px;">
			DIA-H09
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Use 1:100 to 1:400
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>




<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Material 
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:143px;">
			Catalogue Number
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Centrifuge with swinging bucket rotor
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:143px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Pipetter with dispensing speed control
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:143px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Disposable hemocytometer
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			22-600-100
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Sterile surgical gloves
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			11-388128
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Disposable gown
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			18-567
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Surgical mask
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			19-120-1256
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Tuberculin syringe
			</td>
			<td style="width:140px;">
			BD
			</td>
			<td style="width:143px;">
			305620
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Alcohol pads
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			22-246-073
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Portable electronic scale
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			01-919-33
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Zoom stereomicroscope
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:143px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Surgical clipper
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Stoelting
			</td>
			<td style="width:143px;">
			51465
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Scalpel handle
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			10003-12
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Scalpel blades, #10
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:143px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Stereotaxic instrument
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Stoelting
			</td>
			<td style="width:143px;">
			51730
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			High-speed drill
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Stoelting
			</td>
			<td style="width:143px;">
			51449
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">Drill bit, 0.6 mm</td>
			<td style="width:140px;">Stoelting</td>
			<td style="width:143px;">514552</td>
			<td style="width:97px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Hamilton syringe
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Hamilton
			</td>
			<td style="width:143px;">
			80336
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Autoclip, 9 mm
			</td>
			<td style="width:140px;">
			BD
			</td>
			<td style="width:143px;">
			427630
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Circulating water warming pad
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Kent Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			TP-700
			TP-1215EA
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Hot bead dry sterilizer
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Kent Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			INS300850
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Surgical scissors
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			14101-14
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Fine scissors
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			14094-11
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Spring scissors
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			15018-10
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Dumont forceps
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			11251-30
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Semimicro spatulas
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			14374
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Mouse brain slicer matrix
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Zivic Instruments
			</td>
			<td style="width:143px;">
			BSMAS002-1
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Cryogenic storage vials
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			12-567-501
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase i mutation

Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder. Transplantasyon tahlillerinde WHO sınıf III ve IV malign gliomaları modellemek için, insan tümör hücreleri immün sistemi baskılanmış farelerin ortotopik bölgesine, yani beyne ksinografize edilir. Kültürlü tümör hücrelerini kullanan ikincil ksinograftların aksine, insan glioma hücreleri resected örneklerden ayrıştırılır ve birincil ksinograftlar oluşturmak için doku kültüründe önceden geçiş olmadan nakledilür. Bu rapordaki prosedür, tümör numunesi hazırlama, bağışıklık sistemi baskılanmış farelere intrakraniyal transplantasyon, tümör engraftmentinin izlenmesi ve alıcı hayvanlara veya analize sonraki geçiş için tümör hasadını detaylandırmamaktadır. Tümör hücre hazırlama 2 saat, cerrahi işlem ise 20 dk/hayvan gerektirir.

Dissosiyatif glioma hücreleri, primer ortotopik ksinograft çizgileri elde etmek için doğrudan bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin beyinlerine nakledilir. Her tümör örneğine, korunan sağlık bilgilerini kaldırmak için deidentifikasyon sürecinin bir parçası olarak transplantasyondan önce randomize bir sayı atanır. Bu amaçla 5 haneli bir REDcap veritabanı numarası kullanıyoruz. Şekil 1' de, izosirat dehidrogenaz 1 (IDH1) mutasyon arginin 132'den histidin'e (R132H) sahip bi...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation at JoVE.com

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder.

Primer Ortotopik Glioma Xenografts Infiltratif Büyüme ve İsocitrat Dehidrogenaz I Mutasyonu Rekapitulate

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

primary-orthotopic-glioma-xenografts-recapitulate-infiltrative-growth

Research

JoVE Journal

Medicine

7.9K Görüntüleme.  Vanderbilt University Medical Center. Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder.

Video: Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Murin Mesane Kanseri bir Ortotopik Model

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Tıp

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Small bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with short gut syndrome and failure of parenteral nutrition (irreversible intestinal failure). In specialized centers improved operative and managing strategies have led to excellent short- and intermediate term patient and graft survival while providing high quality of life 1,3. Unlike in the more common transplantation of other solid organs (i.e. heart, liver) many underlying mechanisms of graft function and immunologic alterations induced by intestinal transplantation are not entirely known6,7. Episodes of acute rejection, sepsis and chronic graft failure are the main obstacles still contributing to less favorable long term outcome and hindering a more widespread employment of the procedure despite a growing number of patients on home parenteral nutrition who would potentially benefit from such a transplant. The small intestine contains a large number of passenger leucocytes commonly referred to as part of the gut associated lymphoid system (GALT) this being part of the reason for the high immunogenity of the intestinal graft. The presence and close proximity of many commensals and pathogens in the gut explains the severity of sepsis episodes once graft mucosal integrity is compromised (for example by rejection). To advance the field of intestinal- and multiorgan transplantation more data generated from reliable and feasible animal models is needed. The model provided herein combines both reliability and feasibility once established in a standardized manner and can provide valuable insight in the underlying complex molecular, cellular and functional mechanisms that are triggered by intestinal transplantation. We have successfully used and refined the described procedure over more than 5 years in our laboratory 8-11. The JoVE video-based format is especially useful to demonstrate the complex procedure and avoid initial pitfalls for groups planning to establish an orthotopic rodent model investigating intestinal transplantation.

Small bowel transplantation has become an accepted treatment option for patients with irreversible intestinal failure. Our experimental model of orthotopic small bowel transplantation in rats serves as a reliable tool to address underlying immunologic and inflammatory processes that complicate intestinal transplantation.

Sıçanlarda Ortotopik Küçük Bağırsak Nakli

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat liver transplantation in 1979 by Kamada et al.3, this model has remained the gold standard despite various proposed alternative techniques4. Nevertheless, its broader use is limited by its steep learning curve5.
In this video paper, we show a simple and easy-to-establish revision of Kamada's two-cuff technique. The suprahepatic vena cava anastomosis is performed manually with a running suture, and the vena porta and infrahepatic vena cava anastomoses are performed utilizing a quick-linker cuff system6. Manufacturing the quick-linker kit is shown in a separate video paper.

We present an easy-to-establish revision of the classical two-cuff technique for orthotopic liver transplantation in rat.

Sıçanlarda Ortotopik Karaciğer Nakli

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers patients only modest benefits, as most patients do not survive more than five years following diagnosis due to glioma relapse 1,2. The discovery of cancer stem cells in human brain tumors holds promise for having an enormous impact on the development of novel therapeutic strategies for glioma 3. Cancer stem cells are defined by their ability both to self-renew and to differentiate, and are thought to be the only cells in a tumor that have the capacity to initiate new tumors 4. Glioma relapse following radiation therapy is thought to arise from resistance of glioma stem cells (GSCs) to therapy 5-10. In vivo, GSCs are shown to reside in a perivascular niche that is important for maintaining their stem cell-like characteristics 11-14. Central to the organization of the GSC niche are vascular endothelial cells 12. Existing evidence suggests that GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells are important for tumor development, and identify GSCs and their interaction with endothelial cells as important therapeutic targets for glioma. The presence of GSCs is determined experimentally by their capability to initiate new tumors upon orthotopic transplantation 15. This is typically achieved by injecting a specific number of GBM cells isolated from human tumors into the brains of severely immuno-deficient mice, or of mouse GBM cells into the brains of congenic host mice. Assays for tumor growth are then performed following sufficient time to allow GSCs among the injected GBM cells to give rise to new tumors-typically several weeks or months. Hence, existing assays do not allow examination of the important pathological process of tumor initiation from single GSCs in vivo. Consequently, essential insights into the specific roles of GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells in the early stages of tumor initiation are lacking. Such insights are critical for developing novel therapeutic strategies for glioma, and will have great implications for preventing glioma relapse in patients. Here we have adapted the PoRTS cranial window procedure 16and in vivo two-photon microscopy to allow visualization of tumor initiation from injected GBM cells in the brain of a live mouse. Our technique will pave the way for future efforts to elucidate the key signaling mechanisms between GSCs and vascular endothelial cells during glioma initiation.

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

By combining a polished and reinforced thin-skull (PoRTS) cranial window and glioblastoma (GBM) cell injection, we can observe glioma initiation and growth from injected GBM cells in the brain of a live mouse longitudinally.

Görüntüleme Glioma Başlatma<em&gt; In Vivo</em&gt; Bir Parlak ve Takviyeli İnce kafatası Kranial Pencere arkası

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Bir Ortotopik Mesane Tümörü Model ve intravezikal Sarna Tedavisinin Değerlendirilmesi

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

Rahim içi Büyüme Kısıtlama bir Tavşan Modelinde Fetal Ekokardiyografi ve Pulsed-wave Doppler Ultrason

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Pankreas Kanseri İlerleme Bioluminescent Ortotopik Model

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Bağışıklık yetersizliği olan farelere subkutan olarak ve intrahepatik insan hepatoselüler karsinoma ksenograftlarının Üretimi

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

Kemirgen Ortotopik Mesane ksenogratflarının Minimal İnvaziv kurulması

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.