GEM kaynaklı glioblastoma hücrelerinin immünkompetan bir fare beynine intrakraniyal enjeksiyonu için en uygun tekniği tanımladık ve insan glioblastomunun temel özelliklerini özetleyen tümörlerle sonuçlandı. GEM kaynaklı TRP hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu için bu teknik, korteksten kaynaklanan tümörler için oldukça tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve tutarlı sonuçlar verir, ancak GEM tümörlerinin invazivliğini korur. Fare glioblastoma beyin tümörleri agresif büyüme gösterir ve çevredeki beyin parankimini istila eder.
Bu nedenle, hastalarda tümör infiltrasyonunu ve migrasyonunu baskılayabilecek terapötikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol diğer beyin tümörü modelleri, virüsler, terapötikler için özelleştirilebilir veya stereotaksik koordinatların ayarlanmasıyla farklı beyin bölgelerine enjeksiyon için uyarlanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Devon Atkinson olacak.
Başlamak için, yüzey koruyucuları stereotaksik aparatın altına ve çalışma yüzeyine yerleştirin. Vinil tüpü anestezi makinesinden stereotaksik aparatın gaz anestezi platformunun portuna ve başka bir tüpü de çıkış portuna bağlayın. Dijital ekranı bir güç kaynağına ve cihaza bağlayın.
Ardından, mikro pompa kontrolörünü güç kaynağına bağladıktan sonra mikro pompayı cihazın manipülatör koluna takın. Mikro pompayı saniyede 5,6 nanolitreye ayarlayın. Fare ısıtma yastığını sıcaklık kontrol cihazına ve bir güç kaynağına bağlayın.
Kabarcıklardan kaçınarak 30 gauge hassas bir şırıngayı metil metilselüloz hücre karışımı ile geri yükleyin. Pistonu taktıktan sonra, iğneyi takın ve yüklü hücre karışımı iğneden düşene kadar pistonu bastırın. İğneyi% 70 alkol hazırlama pedi ile temizleyin.
Hassas şırınga mikro pompaya bağlandıktan sonra, şırınga iğnesinin yer değiştirmesini önlemek için fareyi yerleştirmeden önce manipülatör kolunu sahneden uzağa döndürün. Anestezi uygulanan fareyi stereotaksik alete aktarın ve üst dişleri burun konisi desteğine yerleştirerek burun konisine sabitleyin. Burun konisini bir düğme ile sıktıktan sonra, uygun anesteziyi sağlamak için refleksleri kontrol etmek için bir ayak parmağınızı sıkıştırın.
Ardından kulak çubuklarını takın ve kafayı sabitlemek için düğmeyi sıkın. Anestezi koşulları altında gözleri yağlamak için göz merhemi uygulayın. Buprenorfin SR analjezik subkutan enjekte edin ve iç sıcaklığı izlemek için rektal fare probu yerleştirin.
Cerrahi alanı, cerrahi bir ovma ve etanol arasında üç kez dönüşümlü olarak, dışa doğru daireler kullanarak sterilize edin. Gergin cildi forseps ile çekin ve gözler arasında yaklaşık 1 santimetre uzunluğunda bir kesi yapmak için bir neşter bıçağı kullanın. Hücre enjeksiyonu için, manipülatör kolunu fareye bağlı şırınga ile geri getirin.
Düğmeleri sıktıktan sonra, şırıngayı yatay düzlemde X ve Y düğmelerini kullanarak hareket ettirin ve bregmanın üzerine monte edin. Bregma konumunu onaylamak için Z düğmesini kullanarak iğneyi indirin ve dijital okuma konsolunu sıfıra ayarlayın. Ardından, X ve Y düğmelerini ve ilgili dijital okumayı kullanarak iğneyi makalede açıklandığı gibi istenen konuma getirin ve iğneyi kafatasının yüzeyine taşımak için Z düğmesini kullanın.
Ekli 25 gauge iğne ile 1 mililitrelik bir şırınga kullanarak kafatasındaki bir deliği delin. İğnenin eğimini 30 gauge hassas şırıngaya doğru yerleştirirken manipülatör kolunu dikkatlice yana doğru döndürün. Yüklü hassas şırınga iğnesine sahip manipülatör kolu deliğin üzerine yerleştirildikten sonra, iğne ucunu delikle hizalayın ve iğneyi beynin durasına indirmek için Z düğmesini kullanın.
Dijital okuma konsolunu sıfıra ayarladıktan sonra, iğneyi Z düğmesiyle 1 milimetre indirin ve bir dakika bekleyin. 2 milimetre derinliğe ulaşıldığında, mikro pompayı durdurun ve 2 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edildiğinde pompanın durduğundan emin olun. İğneyi kafatasından çıkarmak için bir milimetre kaldırın ve bir dakika bekleyin.
Yara kapatma için, pamuk uçlu bir aplikatörün ahşap ucunu kullanarak, bir parça kemik balmumu alın ve bir koni haline getirin. Balmumu kafatasındaki açıklığa yerleştirdikten sonra, deliğe itin. Kafatasında kalan balmumunu eritmek için boncuk sterilize forseps kullanın.
Pürüzsüz hale geldiğinde, insizyona iki damla anestezik bupivakain çözeltisi ekleyin ve forseps kullanarak cildin kenarlarını bir araya getirin. Cildi gerginleştirdikten sonra, bir veya iki yara klipsi kullanarak, cildi kapatın, fareyi taslaksız bir alanda bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin ve fareyi yakından gözlemleyin. Haftalık MRI taramaları, beyindeki tümör yükünün arttığını ve tümör hacmi ölçümlerini gösterdi.
MRG tümör hacmi ölçümü, radyasyon tedavisinden sonra bile tümör büyümesinin baskılanmadığını ve tedavi edilen farelerin sağkalımının artmadığını ortaya koydu. Sinjenik modellerdeki GBM tümörleri agresif bir şekilde büyümüş ve terminal bitiş noktası tarafından kafatasını ihlal etmiş gibi görünüyordu. Hücre implantasyonundan sonra görüntülemede ekstrakraniyal büyüme gözlenirse, bu enjeksiyon işlemi sırasında hücre sızıntısını gösterir ve enjeksiyon iğnesinin çekilmesi sırasında daha fazla özen gösterilmelidir.
Ortotopik TRP GBM tümörlerinin histopatolojisi, psödopalizading ve nekroz gibi tümörlerde ayırt edici özelliklerin özetlenmesi de dahil olmak üzere grade 4 astrositomun varlığını doğruladı. Doğru hücre enjeksiyon koordinatlarını sağlamak için bregma'daki sıfır noktasını ayarlarken hassas olun. Beyindeki iğneyi indirmek ve yükseltmek, travmayı ve geri akışı önlemek için yavaş olmalıdır.
Tümör hücrelerinin enjeksiyonundan sonra, tedaviye başlamadan önce bazal tümör boyutunu belirlemek ve beyindeki değişen tümör yükünü görselleştirmek için haftalık MRI taramaları kullanılabilir.
