Grip viral PP üreten ve enfekte olduğunu belirleyen bu teknik bir BSL-2 şehirde grip virüsü araştırma basitleştirmek olabilir. PpS'nin qRT-PCR verilerine dayalı enfeksiyonlar için PPS'yi normalleştirdik. İki glikoprotein ekspresyonu plazmid kodlanır, bu da virüs reassortment araştırmabasitleştirebilirsiniz.
Hücre tohumlamadan bir gün sonra, ters ışık mikroskobu altında hücre morfolojisini ve yoğunluğunu kontrol edin. İdeal olarak hücre transfeksiyonda yaklaşık %85 konfeksiyon olmalıdır. Orta yı her kuyuda bir mililitre serumsuz DMEM ile değiştirin ve tabağı kuvöze geri koyun.
Hücrelerin her bir kuyunun transfeksiyon alabilen her bir kuyusu için, transfeksiyon reaktifinin sekiz mikrolitresini azaltılmış serum ortamına sahip 150 mikrolitrelik bir hacme seyreltin. Çözeltiyi hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika bekletin. Bu arada, azaltılmış serum orta 158 mikrolitre içine plazmid DNA 2.5 mikrogram seyreltin.
Beş dakika kuluçka sonra, seyreltilmiş DNA seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirmek, yavaşça çözeltikarıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında bırakın. Serumiçermeyen ortamdaki hücrelerle ilgili kuyulara DNA lipid kompleksini ekleyin. Sonra yavaşça ileri geri sallayarak plaka karıştırın.
Plakayı 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle 4-6 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra ortayı çıkarın ve her kuyuda iki mililitre DMEM ile değiştirin. Sonra 36-48 saat daha kuluçkaya yat.
Her bir duyarlı hücre türünü kuyu başına 10, 000 hücre ve 96 kuyu plakası ile tohumlayın. Sonra tabağı bir gecede 37 derece santigrat ve %5 karbondioksit kuvözde bırakın. Transfeksiyondan sonraki üçüncü gün, pembe veya hafif turuncu renkte olması gereken ortamın rengini kontrol edin ve 440 ila 460 nanometre dalga boyu altında ters floresan biyolojik mikroskopla hücreleri inceleyin.
Transfeksiyon sonrası 38 ila 48 saat sonra, hücre enkazını ortadan kaldırmak için 0,45 mikrometrelik poliviniliden florür membran filtresinden geçirerek pseuotyped partikülleri veya PPS'yi hasat edin, sonra bunları küçük hacimli aliquotlara bölün ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. PPS'yi ölçmek için saflaştırılmış viral parçacıkların 30 mikrolitresini 1,5 mikrolitrelik bir RNase içermeyen tüpe aktarın ve bir mikrolitre Benzonaz Çekirdeği ekleyin. Herhangi bir DNA ve RNA kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için tüpü 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, çekirdeği aktif leştirmek için numuneyi eksi 70 dereceye kadar dondurun ve karışımı iki mikrolitre Proteinaz K.Incubate ekleyip zarf proteinlerini sindirmek ve CMV-GFP RNA'yı serbest bırakmak için 30 dakika boyunca ekleyin. Sonra Proteinaz K'yi 100 derecede üç dakika boyunca etkisiz k. Metin el yazmasında belirtilen astar ve problarda Evrensel Sonda Tek AdımLı RT-qPCR Kiti'ni kullanarak PPS'yi nicel ters transkripsiyon RTPCR ile ölçün.
PPS'yi mililitre başına dört kez 10 ila beşinci RNA kopyalarına normalleştirin. Daha sonra TPCK-trypsin'i mililitre başına 10 mikrogramlık son konsantrasyona h7N9 hemagglutinin barındıran PPS'ye ekleyin. PPS'yi 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın ve fonksiyonel ALT Birimler HA1 ve HA2'yi oluşturun.
Normalleştirilmiş PPS'yi DMEM ortamı ile bire bir oranında karıştırın ve duyarlı hücreleri içeren plakayı biyogüvenlik kabinesine getirin. Supernatant aspire ve önceden ısıtılmış PBS 100 mikrolitre ile hücreleri bir kez yıkayın. Her kuyuya 100 mikrolitre PPS-DMEM karışımı ekleyerek, her bir PPS tipinin enfekte liktestlerini hassas bir hücre hattına dönüştürün.
Plakayı 4-6 saat 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Daha sonra süpernatant aspire ve 100 mikrolitre DCM inkübasyon plaka ile değiştirin başka bir 24-36 saat enfekte algılama önce. Sonuçlarımız PPS artık insanlar için bulaşıcı olarak kabul edilir.
Bu nedenle, bir maske takmak ve biyogüvenlik kabininde enfekte liktaht denemeleri yapmak gibi gerekli koruma prosedürlerinin alınması önerilir. Bu protokol, iki gruplu hemaglutinin ve nöraminidaz vesiküler stomatit virüsü G glikoprotein veya zarf glikoproteinleri olmayan 10 tip psödotipli partikül veya PPS üretmek için üretilmiştir. PPS iletim elektron mikroskobu ile görüntülendi ve bunların enfekteliği A549 ve MDCK olmak üzere iki hücre hattında değerlendirildi.
H5 barındıran PPS grubunda H5N1, H5 plus N9 ve H5'in enfekte liği sırasıyla %90%18 ve A549 hücre hattı için %10, MDCK için %40%5 ve %5 idi. H7 barındıran PPS grubunda H7N9, H7 plus N1 ve H7'nin enfekte liği sırasıyla %10 7 ve A549 hücre hattı için %1, MDCK için %8 4 ve %1 idi. Veziküler stomatit virüsü G glikoprotein PP'nin enfektivitesi A549 için %21, MDCK hücreleri için %16 idi.
Delta zarf glikoproteinler pp ise hiçbir enfektelik gösterdi. PP üreticisi HEK-293T/17 hücrelerinin bu prosedürün temelini oluşturduğunu hatırlamak önemlidir. Yani optimal büyüme bize HEK-293T/17 hücrelerinin en önemli olduğunu öğretir.
Bu yordamı veya L2 gibi başka bir testten sonra sınırlama testi yapılabilir. Bu test neredeyse reseptör tercihinin biyolojik özellikleri kurtulmak verebilir ve desen PPS tropism ortaya çıkaracaktır. Onlar influenza virüsü glikoproteinler aldı beri iki artı max klonlanır.
HA ve NA proteinleri ayrı ayrı incelenebilir, bu yüzden aralarında yeniden çeşitlendirilebilir. Mutantlar ve olgun etkileri keşfedilebilir.
