Yazarlar Dr Kent Seeley, bu tesisin kullanımı için Güney Florida Üniversitesi İlaç Keşif ve Yenilik Merkezi (CDDI) Proteomiks Çekirdek Tesis Direktörü teşekkür ederim. Bu çalışma Bhas NIH / NIDCD hibe R01 DC004295 tarafından desteklenen

Etik Bildirimi Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallar altında belirtilen farenin dokusunu kullanarak deneyler Güney Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokoller 3931R, 3482R) tarafından onaylanmıştır. 1.. Protein Ekstraksiyon <ol><li> -80 ° C&#39;de 16 30-günlük-eski (P30) CBA / J fareler ve mağaza koklear duyu epiteli izole </li><li> Deney gününde, 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 500 ul doku yıkayın. 1000 x g&#39;de 3 dakika boyunca santrifüj ve supernatant çıkarın. Üç yıkamadan bir toplam için tekrarlayın. </li><li> 50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 120 mM NaCI, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 ug / ml AEBSF, 10 ug / ml löpeptin, 100 ug / ihtiva eden liziz tamponu içinde 100 ul buz üzerinde 30 saniye süreyle sonikasyon doku bir ses Dismemrator (; Thermo Fisher Model 100) kullanılarak ml pepstatin, 2 ug / ml aprotinin, 0.5 ug / ml mikrosistin. Buz üzerinde serin lizatHer bir sonikasyon arasında 1 dakika için. 3x toplam sonikasyon. </li><li> 2 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 750 x g&#39;de santrifüj özü ve yeni bir mikrotüp süpernatantı. Buz üzerinde 30 saniye boyunca sonike ile liziz tamponunda 50 ul pelet ekstrakte edin. 2 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 750 x g&#39;de santrifüjleyin özü. 60 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 28,600 x g&#39;de santrifüj lizatları ve hem de bir araya getirin. Yeni mikrotüpe Süpernatantı ve pelet% 0.1 ASB-14 içeren 20 ul lizis tamponu ekleyin. Vortex 1 dakika boyunca, 4 ° C&#39;de 60 dakika boyunca inkübe </li><li> 60 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk, daha sonra 5 dakika boyunca 95 ° C&#39; de örnek ısıtın. 10 dakika boyunca 25 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de santrifüj ile takip edin. Süpernatan toplamak ve yeni bir tüpe aktarılır. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de santrifüj ve süspansiyon sindirim için supernatant saklayın. </li></ol> 2. FASP kullanarak Tüm lisatı çift triptik sindirim Protein <ol><li> Bir 30 μ ekleme% 4 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren koklear protein ekstresi, (400 ug ≤) l kısım, 100 mM Tris-HCI, doğrudan 30K eğirme filtreye pH 7.6 ve 0.1 M ditiyotreitol (DTT) ve 8 200 ul ile karıştırın Tris-HCl M üre. 15 dakika boyunca 14.000 x g&#39;de santrifüj. </li><li> 15 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de 8 M üre çözeltisi ve 200 ul santrifüj ile konsantre seyreltin. </li><li> 1 dakika için filtre ve girdap konsantreye 8 M üre çözeltisi 10x iyodoasetamit (IAA) 10 ul ekle. 10 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de santrifüj ile ve ardından karanlıkta, oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca santrifüj filtre inkübe edin. </li><li> 15 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de filtre ünitesine ve santrifüj üzerindeki konsantresine 8 M üre çözeltisi 100 ul ekleyin. Bu adım 2x tekrarlayın. 50 mM amonyum bikarbonat, 10 dakika 14,000 x g&#39;de filtre ünitesine ve santrifüj (ABC) çözeltisi 100 ul ekle. Bu adım 2x tekrarlayın. </li><li> 1:100 içinde tripsin 0.4 ug / ul (a / a) enzim için-Protein oranı ve 37 ° C de bir gece (O / N) inkübe </li><li> İnkübasyondan sonra, 10 dakika boyunca 14,000 xg&#39;de santrifüj filtre ünitesi ve 50 mM ABC çözeltisi 40 ul ekle. Bu adım, 1x tekrarlayın. </li><li> 10 dakika boyunca 14,000 xg&#39;de santrifüj filtre ve santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Yeni bir mikrotüp triptik peptitler içeren filtrat transferi ve sindirim durdurmak için% 1.0 formik asit (FA) ile asitlenir. </li><li> 8 M üre, 40 ul filtre ünitesi yıkayın ve daha sonra 40 ul 18 M, su ile 2 kez yıkanır. </li><li> 50 mM ABC çözeltisi 100 ul ile filtre ünitesi 3 kez yıkayın. En son yıkama 1:100 (w / w), enzim için protein oranında tripsin 0.4 ug / ul ekleyin ve 37 ° C&#39;de O / N sonra inkübe </li><li> 10 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de filtre ünitesine ve santrifüj 50 mM ABC çözeltisi 40 ul ekleyerek sindirimi ikinciden triptik peptidlerin elüsyonu. Bu adım, 1x tekrarlayın. </li><li> 0.5 M NaCl çözeltisinin 50 ul ekle10 dakika boyunca 14,000 xg&#39;de santrifüj ve filtre birimi. Yeni bir mikrotüp triptik peptitler içeren filtrat aktarın ve% 1.0 FA ile asitleştirin. </li><li> Numuneler, standart olarak BSA kullanılarak mikro kolorimetrik deneyi kullanılarak ölçülebilir. </li></ol> 3. FASP kullanarak Tüm lisatı Endoproteinaz lysC ve Protein triptik sindirim <ol><li> Doğrudan bir 30K eğirme filtresi 4% SDS, 100 mM Tris-HCI, pH 7.6, 0.1 M DTT içeren koklear protein ekstresi, 30 ul bir kısım (400 ug ≤) ekleyin ve Tris-HCl, 8 M üre, 200 ul ile karıştırın . 15 dakika boyunca 14.000 x g&#39;de santrifüj. </li><li> 15 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de 8 M üre çözeltisi ve 200 ul santrifüj ile konsantre seyreltin. </li><li> 1 dakika için filtre ve girdap konsantreye 8 M üre çözeltisi 10x IAA 10 ul ekle. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin eğirme filtresi daha sonra 10 dakika boyunca 14,000 xg&#39;de santrifüj. </li><li> 8 M üre çözeltisi 100 ul ekle15 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de filtre ünitesine ve santrifüj üzerindeki konsantreye ution. Bu adım 2x tekrarlayın. 10 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de filtre ünitesine ve santrifüj 100 mM ABC çözeltisi 100 ul ekleyin. Bu adım 2x tekrarlayın. </li><li> 1:50 (a / a) enzim için protein oranında endoproteinaz lysC 0.1 ug / ul ilave edin ve 30 ° C&#39;de O / N inkübe </li><li> İnkübasyondan sonra, 10 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de filtre ünitesine ve santrifüj 100 mM ABC çözeltisi 40 ul ekle. Bu adım, 1x tekrarlayın. </li><li> 10 dakika boyunca 14,000 xg&#39;de santrifüj filtre ve santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Taze mikrotüpe IvsC&#39;deki peptidler içeren süzüntü aktarın ve sindirim durdurmak için% 1.0 FA ile asitleştirmek. </li><li> 8 M üre, 40 ul filtre ünitesi yıkayın ve daha sonra 40 ul 18 M, su ile 2 kez yıkanır. </li><li> 50 mM ABC çözeltisi 100 ul ile filtre ünitesi 3 kez yıkayın. Son yıkama tripsin 0.4 ug / ul ekledikten sonra 1:100 enzim-to-proproteindir oranı ve 37 ° C&#39;de O / N inkübe </li><li> 10 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de filtre ünitesine ve santrifüj 50 mM ABC çözeltisi 40 ul ekleyerek triptik peptidlerin elüsyonu. Bu adım, 1x tekrarlayın. </li><li> 10 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de filtre ünitesine ve santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Yeni bir mikrotüp triptik peptitler içeren filtrat aktarın ve% 1.0 FA ile asitleştirmek. </li><li> Numune, standart olarak BSA ile mikroplaka kolorimetrik deneyi kullanılarak ölçülebilir. </li></ol> 4. Spin sütunları kullanma Tuzsuzlaştırma peptidler <ol><li> 1 dakika boyunca 1100 x g asetonitril (ACN) ve santrifüj 500 ul ekleyerek, bir C 18 kolonu MacroSpin etkinleştirir. Santrifüj sonrası akış-through atın. </li><li> 1 dakika boyunca 1100 x g,% 0.1 FA ve santrifüj 500 ul ile sütun dengelenmesi. Flow-through atın ve bu adımı 1x tekrarlayın. </li><li> Peptidin 500 ul kadar ekleme sütun An sindirimi1 dakika boyunca 1.100 xg d santrifüj. Örnek hacmi 500 ul büyükse o zaman bu adımı tekrarlayın. </li><li> 1 dakika boyunca 1100 x g,% 0.1 FA 500 ul ve santrifüj ile sütun yıkayın. Flow-through atın. Bu adım, 1x tekrarlayın. </li><li> 1 dakika boyunca 1.100 xg&#39;de sütun ve santrifüj 90:10 ACN-su oranı 250 ul ekleyin. Tuzsuzlaştınlmış ve peptidleri içeren yıkama sıvısı toplayın ve yeni bir mikrotüp transfer. Bu adım, 1x tekrarlayın. </li><li> Bir vakum santrifüjde tuzu alınmış örnek peptit kurutun ve tamamen kuru numune izin kaçının. </li></ol> 5. İyon Değişimi Kromatografisi <ol><li> Peptidlerin ayrılması için bir 200 x 2.1 mm, 5 um SCX kolonu (PolySULPHOETHYL A) üzerine sindirilmiş protein örneğinin 50-100 ug enjekte edilir. </li><li> 250 | il / dk &#39;lık bir akış oranında 50 dakika zarfında% 2-40 B gradyanı kullanın. Çözücü A 5 mM amonyum format,% 25 asetonitril, pH 3.0 ve% 75 GKD 2 O olduğu Çözücü B 500 mM amonyum format, pH6.0,% 25 ACN ve% 75 GKD 2 O. </li><li> 280 nm&#39;de peptid fraksiyonlarını izlemek ve bir kısım toplayıcısı kullanılarak 2 dakika aralıklarla fraksiyonları toplayın. </li><li> Tuz çıkarılmasına yardımcı% 5 uçucu kül içeren GKD 2 O içinde% 50 asetonitril 500 ul bir vakum yoğunlaştırıcısı ile tekrar süspansiyon Kuru parçacıklar. </li><li> -80 ° C&#39;de Kurutmayınız kesirler ve mağaza nano LC-MS/MS analiz için kullanmaya hazır olana kadar. </li></ol> 6. Aseton Yağış Önceki GELFrEE ayırma koklear protein yüzer tuz giderme işlemine maruz edilmelidir. Aseton çökelme proteinleri tuzunun giderilmesi ve konsantre kullanılabilir. <ol><li> Koklear süpernatana buz soğukluğunda aseton üç sayılarını. Yavaşça girdap ve -20 ° CO / N. inkübe </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15,000 xg&#39;de santrifüj örnek karışımı ve supernatant çıkarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 14,000 x g soğutulmuş aseton ve santrifüj ile protein topak 3 kez yıkayın° C. </li><li> Pelet hava-kurutun ve 18 M 112 ul su içinde çözülür. </li><li> Mikro kolorimetrik deneyi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. </li></ol> 7. Koklear Duyu epiteli GELFrEE Fraksiyonu <ol><li> 5x örnek tampon maddesi 30 ul (0.25 M Tris-HCl pH 6.8,% 10 (w / v) SDS,% 50 gliserol,% 0.5 (ağırlık / hacim) bromofenol mavisi) 18 M 112 ul içerisinde süspansiyon haline tuzu giderilmiş proteine su. </li><li> Protein disülfid bağları azaltmak için 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 8 ul 1M DTT ve ısıtın. Isıtıldıktan sonra oda sıcaklığına soğumaya bırakılmıştır. </li><li> Anot hazneye akan tampon 8 ml, toplama haznesi örnek çalışan tampon 150 ul ve katot hazneye akan tampon içinde 6 ml ilave edilir. </li><li> Bir pipet kullanılarak, örnek yükleme odasına akan olabilecek tamponunu çıkarın. </li><li> Koklear protein karışımının yük 150 ul (≤ 1 mg), numune yükleme odasına% 8 ile Tr3,5-150 kDa&#39;lık bir kütle aralığı ile kartuş asetattır. </li><li> Çalışmasını başlatmak için alt elektrotlar ve yakın enstrüman kapak. </li><li> Cihaz üzerinde ilk duraklatılmış anda katot rezervuara akan tampon 2 ml ekleyin ve çalıştırmak devam. </li><li> Cihazın her durdurulmuş aralıkta, bir pipet kullanılarak, örnek toplama odasından numunenin toplanması ve taze etiketli mikrotüp ekleyin. Çalışan tampon 150 ul ile toplama haznesi 2x yıkayın ve atın. </li><li> Örnek toplama haznesine taze çalışan tampon 150 ul ekleyin ve çalıştırmak devam. 150 ul / fraksiyonunun toplam hacim içinde 2.6 saatlik bir süre boyunca protein fraksiyonları toplayın. </li></ol> 8. GELFrEE Kesirler 1D Jel Elektroforez 1D jel elektroforezi önce enzimatik sindirme ve MS analizine GELFrEE paya ayırma sonuçlarını görselleştirmek için kullanılabilmektedir. GELFrEE protein parçaları, bir% 4-15 Tris-HCI jeli üzerinde ayrılabilir. </p&gt; <ol><li> (Numune tampon maddesi içinde 350 mM DTT) bir numunesi, seyreltici tampon içinde 5 ul her GELFrEE fraksiyonun, 5 ul bir kısım karıştırın. </li><li> 3 dakika boyunca 95 ° C &#39;de örnekleri ısıtın. </li><li> Oda sıcaklığına soğutun örnekleri. </li><li> Bireysel jel şerit ve son kullanılmayan şeritte moleküler ağırlık standardının yük 5 ul her GELFrEE fraksiyonun yük 10 ul. </li><li> Boyanın önü jelin alt kısmına ulaşana kadar 1.5 saat için 125 V de jel veya çalıştırın. </li><li> Dikkatlice jel kaldırmak ve protein ayırma görselleştirmek için Gümüş Leke Plus ile leke. </li></ol> 9. FASP kullanma GELFrEE Kesirler Protein Sindirim Değiştirilmiş bir FASP prosedür GELFrEE fraksiyonların deterjan çıkarılması ve sindirim için kullanılır. <ol><li> 8 M Tris-HCI, üre ve 25 dakika boyunca 14,000 xg&#39;de santrifüj 200 ul ile karıştırın, doğrudan 30K filtre ünitesi için her bir fraksiyon ekleyin. </li><li> Üre çözeltisi 200 ul konsantre seyreltinve 12 dakika boyunca 14.000 xg santrifüj. Bu adım, 1x tekrarlayın. </li><li> Her bir filtre ünitesi, 1 dakika süre ile girdap konsantreye üre çözelti içinde 10x IAA 10 ul ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 15 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de filtre birimleri ve santrifüj üzerindeki konsantresine üre çözeltisi 100 ul ekleyin. Bu adım 2x tekrarlayın. Filtre birimler ve 10 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de santrifüj ile 100 mM ABC çözeltisi 100 ul ekleyin. Bu adım 2x tekrarlayın. </li><li> Filtre birimlere bir 1:50 (w / w), enzim için protein oranı için lysC 0.1 ug / ul ilave edin ve 30 ° C&#39;de O / N inkübe </li><li> İnkübasyondan sonra, 10 dakika boyunca 14,000 xg&#39;de santrifüj filtre ve santrifüj 100 mM ABC çözeltisi 40 ul ekle. Bu adım, 1x tekrarlayın. </li><li> 10 dakika boyunca 14,000 xg&#39;de santrifüj filtre ve santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Yeni bir mikrotüp için her sıkma filtresinden lysC peptidleri içeren filtrat aktarın ve trifluoroac ile asitleştirmekasetik asit (TFA). </li><li> 8 M üre, 40 ul spin filtreleri yıkanır, daha sonra 40 ul 18 M, su ile 2 kez yıkanır. </li><li> Eğirme filtresi 50 mM ABC çözeltisi 100 ul 3x yıkayın. Son yıkama bir 1:100 (a / a) enzim için protein oranında tripsin 0.4 ug / ul ekleyin ve 37 ° C sıcaklıkta O / N sonra inkübe </li><li> 10 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de 50 mM ABC çözeltisi ve santrifüj içinde 40 ul eklenmesi ile her bir filtre biriminden triptik peptidlerin elüsyonu. Bu adım, 1x tekrarlayın. </li><li> Filtre birimler ve 10 dakika boyunca 14,000 xg&#39;de santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Yeni bir mikrotüp, her bir filtre biriminden triptik peptitler içeren filtrat aktarın ve TFA ile asitlenir. </li><li> Vakumlu bir deriştirme aygıtı içinde, tüm digests kurutun. </li></ol> 10. LC-MS/MS için Numune Hazırlama <ol><li> Sulandırın kurutuldu lysC ve triptik peptid,% 0.1 FA ve vorteks 20 ul fraksiyonlar sindirir. </li><li> 10 için 20.000 xg Santrifüj örnekleridakika ve yeni bir numune şişesine numunesinin üst% 95 çıkarın. </li><li> Tuzları ve kirlilikleri uzaklaştırmak ve bir 75 um x 10 cm C18 kolonu üzerinde kromatografik ayırma gerçekleştirmek için bir 100 um x 25 mm numune tutucu üzerine her bir peptid fraksiyonu 5 ul enjekte edilir. </li><li> 200 nl / dak &#39;lık bir debi ile 100 dakika boyunca% 2-40 B gradyanı kullanın. Çözücü A% 95 ddH2O ve% 0.1 FA içeren% 5 asetonitrildir. Çözücü B% 80 ACN ve% 0.1 FA ihtiva eden% 20 ddH2O olduğunu. </li><li> Her MS yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile taramak için on tandem kütle spektrumları toplayın. Bir LTQ Orbitrap kütle spektrometresi, bu deneyde kullanıldı. </li></ol> 11. Protein Tanımlama <ol><li> Hem ileri içeren UniProt fare veritabanı kullanarak proteinleri tespit ve protein dizileri ve ortak kirletici ters. MASCOT arama motoru ile MaxQuant yazılım protein veritabanı aramak için kullanılır. </li><li> Kullanılabilen ara parametreler; sabit modificsistein carbamidomethyl ation of metioninin oksidasyon değişken modifikasyonlar protein N-terminal asetilasyonu, 2 en fazla bölünmesini cevapsız. Tanımlanması için dikkate alınması gereken minimum peptid uzunluğu 6 amino asit kadardır. ± 8 ppm ve 1.2 Da (kütle hata kütle spektrometresi kullanılan bağlıdır) bir parçası kitlesel bir hoşgörü peptid kütle konsantrasyonu hatayı girin. </li><li> MaxQuant yazılım, peptid ve protein belirlenmesi için bir% 1 yanlış keşif hızı (FDR) kullanın. Protein tespiti eşleşen peptidler, yüzde protein sekansı içerisinde, ve peptid dizilerinin sayısı ile listelenir. </li></ol>

<ol>
	<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+-+Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Review - Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312, 212-217 (2006).</li><li>Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+induced+changes+in+the+expression+of+p38/MAPK+signaling+proteins+in+the+sensory+epithelium+of+the+inner+ear.">Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear.</a> J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).</li><li>Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+analysis+of+proteins+in+inner+ear+tissues+and+fluids+with+emphasis+on+endolymphatic+sac,+otoconia,+and+organ+of+Corti.">Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti.</a> Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).</li><li>Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+of+Corti-specific+polypeptides:+OCP-I+and+OCP-II.">Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II.</a> J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).</li><li>Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).</li><li>Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics+of+mouse+models+for+deafness,+a+discovery+strategy.">Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy.</a> Brain Res. 1091, 113-121 (2006).</li><li>Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+the+Organ+of+Corti+Using+Nanoscale+Liquid+Chromatography+Coupled+with+Tandem+Mass+Spectrometry.">Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).</li><li>Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Transcriptomics,+Proteomics,+and+MicroRNA+Analyses+Reveals+Novel+MicroRNA+Regulation+of+Targets+in+the+Mammalian+Inner+Ear.">Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/K+-ATPase+&#945;1Identified+as+an+Abundant+Protein+in+the+Blood-Labyrinth+Barrier+That+Plays+an+Essential+Role+in+the+Barrier+Integrity.+.">Na+/K+-ATPase &#945;1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. .</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Bundles+Are+Specialized+for+ATP+Delivery+via+Creatine+Kinase.">Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase.</a> Neuron. 53, 371-386 (2007).</li><li>Chen, Z. Y., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inner+ear+gene+expression+database.">An inner ear gene expression database.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).</li><li>Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+gene+expression+in+the+inner+ear.">Ion channel gene expression in the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).</li><li>Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+in+analysing+complex+proteomics+samples.">Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples.</a> J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).</li><li>Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+chromatographic+techniques+and+methods+in+shotgun+proteome+analysis.">Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis.</a> Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).</li><li>Wu, C. C., MacCoss, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics:+Tools+for+the+analysis+of+complex+biological+systems.">Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).</li><li>Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Two-Dimensional+Separation+of+Intact+Proteins+for+Bottom-Up+Tandem+Mass+Spectrometry+of+the+Human+CSF+Proteome.">Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome.</a> J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry:+Bottom-up+or+top-down.">Mass spectrometry: Bottom-up or top-down.</a> Science. 314, 65-66 (2006).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Reid, G. E., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+down'+protein+characterization+via+tandem+mass+spectrometry.">Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).</li><li>Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+for+proteomics.">Mass spectrometry for proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).</li><li>Thalmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics:+A+fad+or+hear+to+stay.">Inner ear proteomics: A fad or hear to stay.</a> Brain Res. 1091, 103-112 (2006).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

<html> Koklear duyu epitel protein kimlik maksimize önemli adımlar şunlardır: sindirim için birden endoproteinazlara 1) kullanımı, birden fazla ayırma teknikleri 2) kullanımı ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi 3) kullanımı. Birden enzimlerin uygulanması peptidlerin sayısını arttırır ve protein dizisi kapsama geliştirir, bu nedenle koklear dokudan belirlenen protein sayısını artırır. Tripsin, en yaygın olarak kullanılan proteaz MS iyonlaşma ve parçalanması için iyi olan pepti...

Proteomiks protein ifadesi, işlev, değişiklik ve etkileşimleri 1 analiz karmaşık biyolojik sistemlerin çalışmadır. Çeşitli yöntemler, antikor mikrodizi 2, iki boyutlu jel elektroforezi 3-5 ve dige 6 da dahil olmak üzere, iç kulak bölgesinin proteom analizi için kullanılmıştır. Bununla birlikte, proteinlerin sadece sınırlı sayıda tespit edilmiştir ve iç kulak 11,12 belirlenen genler ve 10.000 &#39;den fazla edilen sunulan sekans bölümlerinin (EST) ile karşılaştırıldığında, 2,7-10, özelliği, MS, en yaygın olarak kullanılan ve kapsamlı bir tekniktir protein karakterizasyonu için proteomikteki. Gibi koklea gibi karmaşık proteomik numunelerin, analiz, zor olabilir. Bununla birlikte, MS ile birden fazla ayırma tekniklerinin bir kombinasyonu nedeniyle artan bir dinamik konsantrasyon aralığında ve en yüksek kapasite 13, peptidlerin ve proteinlerin, bir daha fazla sayıda tanımlanmasını sağlar. Çok boyutlu kromatografikphy farklı adsorpsiyon mekanizmalarının kullanımına izin vererek son derece kompleks protein karışımları azaltır. İki sık kullanılan MS proteomdaki çözümleme yaklaşımları, av tüfeği ve aşağıdan yukarıya proteomiks vardır. Av tüfeği proteomik, sağlam proteinlerin bir karışımı enzimatik olarak sindirilir ve güçlü katyon değişim kromatografisi, ters faz sıvı kromatografisi (RPLC) 14,15 ve ardından (SCX) ile çok boyutlu kromatografi kullanılarak ayrılır. Ayrılmış peptidler tandem MS tabi ve veritabanı 15 arıyor. Bu tekniğin önemli bir avantajı protein binlerce tek analizinde tespit edilebilir ve teknik membran proteinleri için daha uygun olmasıdır. Aşağıdan yukarıya yaklaşımda, protein kanşım genellikle bir ya da iki boyutlu elektroforez ile ayrılır, ve tek tek protein bantları ya da noktalar genellikle birden peptidler ile sonuçlanır, tripsin gibi bir enzim ile kesilir ve sindirilmiştir. Ancak, başka bir daha yenily aşağıdan yukarıya proteomikteki kullanılan elektroforetik yaklaşım geliştirdi, GELFrEE olduğunu. Bu teknik, sıvı-faz içinde protein örnekleri böler ve analizden önce için daha az karmaşık hale getirir. Bu teknik, tekrar üretilebilir yüksek protein iyileşme sağlar ve karmaşık protein örnekleri 16 yüksek fazla proteinler dağılımını azaltır. Ayrılmış proteinlerinden elde edilen peptidler, 17-19 veritabanı arama için sekans etiketler oluşturmak için, peptid kütle parmak izi ya da tandem MS (MS / MS) kullanılarak, MS ile analiz edilir. Aşağıdan yukarıya yaklaşım kullanarak önemli avantajlarından bazıları yüksek çözünürlüklü ayrımları ve kapsamlı protein kapsama almak için yeteneği vardır. Aşağıdan yukarıya proteomiks proteomiks 20 en çok kullanılan tekniktir, dolayısıyla, çeşitli biyoinformatik araçları mevcuttur. Buna ek olarak, proteinler, sindirim önce bir karışım olarak ayrılabilir, böylece daha büyük bir kimlik olasılığı vardır. Önemli sorunlardan biriproteomik analizi için iç kulağı kullanarak kendi küçük boyutu, sınırlı erişilebilirlik ve hücre tipi çeşitlilik 21&#39;dir. Buna ek olarak, bu tür iyon kanalları, taşıyıcı ve reseptör olarak özelliğe ayırt anahtar proteinler, 22, izole etmek zor olabilir zar proteinleri vardır. Bu nedenle, filtre destekli numune hazırlama (FASP) protein çıkarımı için sınırlıdır dokuların proteomik analizler için avantajlıdır ve membranlar 23 çözündürülmesi için deterjan gerektirir. Bu filtre membran ve çözünebilir proteinlerin MS analizi için ve düşük molekül ağırlıklı kirletici 23,24 peptidler izole etmek yeteneği sağlar. Mevcut protokol birleştirildi ve çözünebilir ve membran proteinleri de analiz etmek ve koklear duyu epitel protein kimliklerinin sayısını arttırmak için modifiye sık kullanılan proteomik yaklaşımlar anlatılmaktadır. Biz FASP çok sindirimi ile av tüfeği proteomiks kullanarak anlatacağıziyon, iyon değiştirme kromatografisi, yüksek çözünürlüklü MS ve veri analizi. Buna ek olarak, biz GELFrEE, FASP çok sindirim, yüksek çözünürlük MS, ve veri analizi ile aşağıdan yukarıya proteomiks anlatacağız.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

Proteomiks karmaşık biyolojik sistemlerin içgörü sağlayabilir yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Koklear duyusal epitelyum, periferal ve merkezi sinir sistemi tarafından işlenen bir elektro-kimyasal enerjiye sesin mekanik enerji transdüksiyonu reseptörlerini içerir. Çeşitli proteomik teknikler, iki boyutlu bir fark jel elektroforezi (2D-DIGE), antikor mikrodizi ve kütle spektrometrisi (MS) halinde koklear iç kulak, çalışma için geliştirilmiştir. MS proteomikteki en kapsamlı ve çok yönlü bir araçtır ve ayırma yöntemleri ile birlikte biyolojik örneklerin derinlemesine bir proteomesini sağlayabilir. MS ile birlikte ayırma yöntemleri, protein örnekleri ettirecek düşük bir molekül ağırlığı ve hidrofobik proteinleri tespit ve proteom dinamik aralığını azaltarak düşük bol proteinleri tespit etmek yeteneğine sahiptir. Farklı sindirim stratejiler peptid ve protein geliştirmek için bütün lisat ya da parçalanmış protein lisatı uygulanabilirdizisi kapsama. Güçlü katyon alışveriş (SCX), ters faz (RP) ve jel elüt sıvı fraksiyon tuzak elektroforezi (GELFrEE) dahil olmak üzere farklı ayırma tekniklerinin kullanımı protein belirlenmesi için önceki MS analizi için numune karmaşıklığını azaltmak için uygulanabilir.

Koklear duyu epiteli en kapsamlı proteomesini edinmek için, hızlı doku diseksiyonu öncesi protein ekstraksiyon ve numune hazırlama için gereklidir. İki proteomik teknikleri, av tüfeği ve aşağıdan yukarıya proteomiks kullanılabilir. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi av tüfeği proteomik için numune hazırlamak için, FASP sindirim prosedür kullanıldı. FASP yöntem, protein konsantrasyonu, deterjan ortadan kaldırılması, ve birden fazla enzimleri kullanılarak protein sindirimi i?...

Watch this Scientific Journal Video about Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome at JoVE.com

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Membran proteinleri izole etmek ve tanımlamak zordur çünkü koklear duyu epitel Proteom analizi nedeniyle küçük boyutu ve zor olabilir. Zar ve çözülebilir proteinler, her ikisi de yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte birden hazırlama yöntemleri ve ayırma teknikleri birleştirilerek tanımlanabilir.

Kapsamlı Cochlear Proteome tanımak için aşağıdan yukarıya ve Shotgun Proteomiks

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Görüntüleme.  University of South Florida.  Membran proteinleri izole etmek ve tanımlamak zordur çünkü koklear duyu epitel Proteom analizi nedeniyle küçük boyutu ve zor olabilir. Zar ve çözülebilir proteinler, her ikisi de yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte birden hazırlama yöntemleri ve ayırma teknikleri birleştirilerek tanımlanabilir. 

Video: Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biyoloji

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Üretimi<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta Mikrotubul ilişkili RNA&#39;lar tanımak ayıklar

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.