Bu yöntem, hiv alanındaki virüs bulaşması ve patogenezinin determinantlarının belirlenmesi gibi, enfeksiyondan en çok etkilenen organlardan ikisinde anahtar soruların yanıtlatIlmesine yardımcı olabilir. Aslında, anahtar ileri sürüş hastalığı ilerlemesi dokularda yer alır. Enfeksiyon özellikleri ve karmaşıklığı kötü dolaşımdaki hücreler tarafından yansıtılır veya izole ve in vitro enfekte.
HIV patogenezi incelemek için ex vivo doku kültürünün en büyük avantajı iki ila üç hafta süreyle hücreler arasındaki orijinal aralıklı ve fonksiyonel ilişkilerini korumaktadır. Başlamak için, 20 milimetre petri kabı ile 100 milyon metre cmt 20 ila 30 mililitre doldurun. Jelatin süngerleri steril çömetler kullanarak Petri kabına aktarın.
Her iki tarafta sünger ıslatın ve süngerbir dakika orta kadar emmek için izin verin. Süngerleri petri kabının dibine iki dakika kadar steril bir spatula kullanarak bastırın. Yaklaşık bir santimetre kare eşit büyüklükte parçalar halinde rehydrated jelatin sünger kesmek için steril makas kullanın.
Sonra bir kültür plaka her kuyuiçine bir sünger parçası aktarmak için forceps kullanın. Bademcikler için 6 kuyulu bir plakanın her kuyuya 3-4 mililitre CMT ve serviks için 12 kuyuluk bir plakaya her bir mililitre ekleyin. 37 santigrat derece, %5 CO2 ve daha yüksek veya % 90 nemden daha yüksek veya eşit olarak ayarlanan plakaları kuvöze yerleştirin.
Bademcikleri taşıma kabından steril çiller kullanarak 10 ila 20 mililitre CMT içeren 100 milimetrelik Petri kabına aktarın. Doku incelemek için bir kesme yüzeyi olarak Petri çanak kapağını kullanın. Pişme ile hafifçe doku tutma, steril bir neşter ve bıçak kullanarak farklı, büyük parçalar halinde her bademcik kesti.
Korterize, kanlı ve fibroid doku yanı sıra tonsilloliths veya yeşilimsi-kahverengi renk içeren herhangi bir parça kaldırmak için terlik ve neşter kullanın. Kalınlığı yaklaşık iki milimetre dilimler halinde her doku parçası kesin. Önceki adımda olduğu gibi istenmeyen parçayı kaldırın.
Sonra iki milimetre kalınlığında şeritler halinde doku dilimleri kesti. Son olarak, iki milimetre kalınlığında bloklar halinde doku şeritler kesti. Diseksiyon ile devam ederken doku desiccation önlemek için CMT 10 ila 20 mililitre içeren yeni bir 100 milimetre Petri kabına ekspertiz aktarın.
Diseksiyonun sonunda, ekstrektifi dağılımını rasgele leştirmek için plakayı döndürün. Her jelatin süngerin üzerine, forceps kullanarak 6 kuyulu bir plakaya dokuz doku eksbitkisi yerleştirin ve aralarında boşluk bırakarak. Plakaları kuvöze geri ver.
Tipik olarak, ekstesiek bitkiler bir gecede kültürlenir. ERTESI gün HIV aşısı yapılır. Bu kültürde bakteriyel veya mantar kontaminasyonu gelişmediğinden emin olmak içindir.
Ayrıca, hücreler diseksiyon hemen sonra doku ekstrnere gerileme eğilimindedir. Bir pipet ile 6-well plaka orta aspire ve dezenfektan çözeltisi ile bir kap içinde atın. Tabağı yatırın ve jelatin süngerleri yavaşça kuyunun üst kısmına doğru itin ve ortamın alt kısımda toplanmasını bekleyin.
Aspire ve orta atın. Sonra her kuyuya 3-4 mililitre CMT ekleyin. Şimdi 37 santigrat derece su banyosunda HIV-1 virüs hazırlık eritin.
Pipet bir jelatin sünger üzerinde dokuz eksbitki her üstüne doğrudan virüs inoculum. Tabağı kuvöze geri ver. Doku incelemek için bir kesme yüzeyi olarak Petri çanak kapağını kullanın.
Mendolu pİşplerle hafifçe tutarak, ektoserviks in mukozasını ve/veya endoservisi, neşter ve bıçak la altından, neşter ve bıçakla ayırArak mukoza şeritlerini elde edin. Mukozayı iki milimetre genişliğinde şeritler halinde kesin. Sadece iki milimetre kalınlığında bir doku tabakası bırakarak mümkün olduğunca çok submukoza çıkarın ve atın.
Sonra şeritleri iki milimetre kalınlığında parçalarhalinde kesin. Diseksiyon ile devam ederken doku desiccation önlemek için CMT 10 ila 20 mililitre içeren yeni bir 100 milimetre Petri kabına doku ekstrperleri aktarın. Diseksiyonun sonunda, ekstrektifi dağılımını rasgele leştirmek için plakayı döndürün.
Steril forceps ile, steril 1,5 mililitre konik tüpler içine explants aktarın. Pipet kullanarak tüpteki herhangi bir ortamı çıkarın. Optimum sonuçlar için serviks eksektifleri ameliyat sonrası en kısa sürede işlenmeli ve enfekte edilmelidir.
Alternatif olarak, dokular cmt bir gecede 4 derece batık ve diseksiyon hemen sonra enfekte saklanabilir. 37 santigrat derecede bir su banyosunda HIV-1 hazırlık çözültün. Çözüldükten sonra, eksplandan içeren tüplere virüs aktarın.
Tüpleri bir termoshaker'a aktarın ve 300 rpm'de sallanan 37 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatın. Tüpleri her 30-60 dakikada bir hafifçe ters çevirin. Bu arada, steril fosfat tamponlu tuzlu kuyu başına üç ila dört mililitre ile 6-iyi plaka doldurun.
HIV-1 ile kuluçka sonunda, dezenfektan solüsyonu ile bir kap içine eksplantlar içeren tüpler tüm virüs hazırlık atmak için bir pipet kullanın. Daha sonra eksplleri PBS içeren 6 kuyulu plakaya aktarmak için çerseps ve pipet kullanın. Ekstesitbitkilerin oda sıcaklığında bir dakika PBS'de dinlenmesine izin vererek, PBS'yi 2-3 kez yukarı ve aşağı boruyla yıkayarak yıkayın.
Daha sonra PBS'yi pipet kullanarak dezenfektan solüsyonu olan bir kap içine atın. Her kuyuya üç ila dört mililitre yeni PBS ekleyin. Toplam üç yıkıntı için iki kez daha tekrarlayın.
Doku desiccation önlemek için sünger ekstremite transfer hemen önce PBS atın. Şimdi her jelatin süngerin üzerine 5-8 eksbitkiyi 12 kuyulu bir tabağa aktarmak için forceps kullanın. Tabağı kuvöze geri ver.
Bir pipet ile kültür ortamı bir örnek toplamak ve eksi 80 santigrat derece depolama için steril 1,5 veya iki mililitre vidalı kapak tüpleri içine aktarın. Steril forceps ile doku ekstrperler hasat ve steril 1.5 veya iki mililitre vidalı kapak tüpleri içine explants aktarın. Doku örneklerini deney gereği işleme veya saklama.
Bir pipet ile kuyuda artık kültür ortamı aspire ve dezenfektan çözeltisi ile bir kap içine atın. Tabağı yatırın ve jelatin süngerleri yavaşça kuyunun üst kısmına doğru itin ve ortamın alt tabakada toplanıp aspire edip atmasını bekleyin. Şimdi her kuyuya 3-4 mililitre kültür ortamı ekleyin.
Steril forceps kullanarak, kuvöz plaka dönmeden önce jelatin sünger orta düştü herhangi bir doku eksültörü döndürün. Kültürün sonunda, tüm biyolojik atıkları, enstitünün tehlikeli biyolojik lerin taşınması na ilişkin yönetmeliklerine ve özel risk değerlendirmesine göre apposite kaplarına atın. Inter-donör değişkenliği, aynı virüs inokülile enfekte üç farklı donörlerin servikal doku için gösterildiği gibi, doku ekstrüzyon kültür supernatant HIV çekirdek protein p24 gag konsantrasyonu ile ölçülen HIV-1 replikasyonu etkileyebilir.
İlk donör için, sadece HIV-1 BaL ile enfekte eksplants kültür orta p24 gag birikimi açıkça bir ürün enfeksiyonu gösterir. HIV replikasyonlarını tamamen azaltan antiretroviral ilaç 3TC negatif kontrol olarak kullanıldı. 3TC ile tedavi edilen eksbitkilerin kültür ortamında ölçülen p24 gag miktarı, kültür sırasında doku ekskbitkileri tarafından özel olarak emilen ve salınan virüs inokülfraksiyonunun fraksiyonunu ortaya koymaktadır.
İkinci donörden doku eksektinde, HIV-1 barsak enfeksiyonu zaman içinde p24 öğürme konsantrasyonunda sürekli bir azalmaya neden olur, bu da p24 öğürme niceliği ile enfeksiyonun azaldığını veya tespit edilemeyen bir hastalık olduğunu gösterir. Bu benzer bir HIV çoğaltma kinetik gösteren 3TC tedavi kontrol eksektif tarafından doğrulanır. Üçüncü donörden doku eksektimi enfeksiyonu çok az miktarda virüs verir.
Bu durumda, de novo virüs üretimi ile enfeksiyonun varlığını tespit etmek için negatif kontrol olarak 3TC tedavisinin dahil edilmesi gereklidir. Bu prosedürü takiben, akış sitometrisi veya immünostaining gibi analitik yöntemler, ilgi hücre popülasyonunun fenotip, oranveya doku konumu ile ilgili soruları yanıtlamak için farklı zaman noktalarında gerçekleştirilebilir. Deneyi tasarlarken, inter-donör değişkenliğinin seçimin deneysel okuması üzerindeki etkisini tahmin etmek önemlidir.
Inter-donör değişkenliği, sıkı klinik ve muhtemelen deneysel dahil etme ve dışlama kriterleri ayarlayarak kısmen kontrol edilebilir. Ex vivo insan doku kültürleri vaccinia virüsü veya herpes virüsleri gibi HIV dışındaki mikropların patogenezini incelemek için kullanılabilir. Ayrıca antimikrobiyal toksisite ve etilik çalışmaları için bir preklinik platform olarak kullanılmaktadır.
Lütfen sağlıklı bireylerden gelen tüm insan örneklerinin bulaşıcı ajanlar barındırabileceğini unutmayın. Sizin ve iş arkadaşlarınızın güvenliğini sağlamak için insan dokularını işlemek için uygun eğitim, öğretim ve korumalar gereklidir.
